Name: מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: חקור מניפולציה אלקטרואופטית של מעגלים עצביים בזמן ניטור מצבי שינה וערות בעכברים. שיטה זו מאפשרת לחקור קשרים סיבתיים בין פעילות נוירונים לרגולציית שינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי התוכנית לימודים לחוקר מרק (54843), KAKENHI גרנט-עזרה עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים, "WillDynamics" (16H06401) (ט), ו KAKENHI גרנט ב-עזרה למחקר מחקרי בתחומים חדשניים (ט) (18H02595).

כל הניסויים כאן אושרו על ידי ועדת ניסוי בעלי חיים של אוניברסיטת טסוקובה, הציות להנחיות של NIH.
1. כירורגיה של בעלי חיים, הזרקת וירוס, אלקטרודה עבור EEG/EMG, ו סיבים אופטיים השרשה
זהירות: הגנה מתאימה וטכניקות טיפול יש לבחור מבוסס על רמת בטיחות של הווירוס לשימוש. AAV צריך לשמש בחדר P1A מבודדים מדורגים להזרקה, ואת הצינור נושאת AAV חייב להיות מעוקר עם החיטוי לאחר כל אמצעי האחסון משמש למעלה. האתר כירורגי וכל חומר מושתל צריך להיות נקי וסטרילי במהלך השימוש. הערה: ראה איור 1.
<ol><li>לחטא את הציוד הכירורגי עם החיטוי.</li>
	<li>. בעזרת מכשיר הרדמה לצפות עד העכבר הגיע לעומק הרצוי של הרדמה, נקבע על ידי אובדן של תגובה צובט את הזנב עם מלקחיים. החלת משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע מהם להתייבש.</li>
	<li>לחטא את השדה כירורגי עם יוד פתרון או 70% אטוח (3x) ו יבש מספיק. לאפשר וירוס להפשיר על הקרח כמו הניתוח מבוצע. כסו את האזור הכירורגי עם נייר מעבדה סופג.</li>
	<li>תקן את ראש העכבר במנגנון הסטרטקטיקה עם פסי האוזן וצביטה באף. לאחר אישור הראש מוחזק באופן בלתי נשכח, לבצע חתך midsagittal בקרקפת כדי להבטיח את המיקומים של ברז ו למדא ממוקמים באותה רמה על קו אופקי.</li>
	<li>כדי למנוע הפער מיקום, כראוי להתאים את רמות הצביטה האף והאוזניים למעלה ולמטה. הברגמה ולמדא מתייחסים לצומת שבין הסוטורה סאגגיוציס וסוטורה קורוליס או סוטורה, בהתאמה (איור 2).</li>
	<li>השתמש בתפסים Serafin כדי להחזיק את העור כדי לשמור על הגישה הגולגולת. לאחר חשיפת הגולגולת, לחטא את פני השטח של הגולגולת עם יוד או 5% H2O2, כדי לאפשר את התפרים הגולגולת כולל ברז ו למדא להיות דמיינו יותר בבהירות.</li>
	<li>הכנת הזרקת וקטור AAV:
	<ol>
<li>שטוף את החלק הפנימי של מזרק 10 מ ל (ראה טבלת חומרים) ברצף עם 70% אטוח, 100% אטואה ו מים מעוקרים, 5 פעמים כל אחד. אבטח את המזרק בתפס של זרוע משאבת מיקרוהזרקה וודא שכל הפתרונות במזרק משוחררים.</li>
		<li>מוחדרים בזהירות 2 μL של שמן מינרלי ללא בועות אוויר, ולאחר מכן מוחלק את הנפח המיועד של פתרון וירוס. לאחר השאיפה, לתמרן את כפתור הבוכנה ולוודא כי פתרון וירוס מתגלה בקצה של המחט. הערה: נפח ההזרקה של פתרון הווירוס נקבע בניסויים פיילוט באמצעות אותו להתאמץ העכבר ואותו מוצר וירוס. יש להעריך מראש את הקשר בין נפח פתרון הווירוסים לבין היקף אזור הזיהום.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנס וקטור AAV:
	<ol>
<li>התאימו את קצה המחט המיקרוזרקת על הברגמה ושימו לב לקואורדינטות כנקודה המקורית. העבר את העצה לאתר ההזרקה המיועד (עבור ה-BNST: anteroposterior + 0.2 מ"מ, מדיה הצלעות ± 1.0 mm, dorsoventral-4.2 מ"מ) ומניחים את קצה המחט על המיקום. לשים סימן על הגולגולת ולקדוח חורים של כ 2 מ"מ בקוטר באמצעות מקדחה שיניים עם חותך 0.7 מילימטר קרביד. יש להיזהר שלא לפגוע ברקמת המוח או ברקמה המוחית.</li>
		<li>לאחר הסרת דם מסביב החורים בספוגית כותנה, הזיזו לאט את המחט לתנוחת ה-BNST. לאט להזריק את הכמות המיועדת של פתרון וירוס (0.07 μl/min) עם מיקרו מזרק מכני. לאחר השלמת הזריקה, להשאיר את המחט 5 דקות כדי לאפשר את הפתרון כדי לחדור מספיק את רקמת BNST. . תוציא בזהירות את המחט</li>
		<li>לקבלת הזרקה דו-צדדית, חזור על שלבים 1.8.1-1.8.2 בצד השני. במהלך ההליך, לשמור על הגולגולת לח עם יישומים של תמיסת מלח סטרילי. הערה: השתמשנו שתלים מותאמים אישית EEG/EMG (W: 5 מ"מ, D: 7 מ"מ, H: 1 מ"מ) עם ארבעה אלקטרודות EEG (4 מ"מ), שני אלקטרודות EMG (2 מ"מ; לחתוך את האלקטרודה 4 מ"מ 2 מ"מ עם מצבתים) ו 6 אלקטרודות (4.5 מ"מ) (איור 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>הלחמה שני חוטי נירוסטה (ראה טבלת חומרים) שממנה 1 מ"מ של הבידוד מופשט משני הקצוות לאלקטרודות emg. להתאים את מרכז האלקטרודות אל ברז ולסמן את המיקום של כל אלקטרודה EEG (anteroposterior ± 1.5 mm, mediolateral ± 1.0 מ"מ), ולקבוע את המיקום של השתל (איור 2B).</li>
	<li>סיבים אופטיים השתל:
	<ol>
<li>לצרף סיבים אופטיים שלטון מניפולטור ולסובב את הזרוע מניפולטור כך שיש לו זווית של ± 30 ° נגד קו אופקי (תהליך זה צריך רק כדי למנוע הפרעות בין אלקטרודות סיבים אופטיים, כגון במקרה של גירוי BNST). שים את קצה החוט על הברז. ותעד את נקודות הציון</li>
		<li>הזז את הקצה לשורת ההכנסה הייעודית וסמן את המיקום על הגולגולת. שים גם סימנים נוספים ליד אתר הכניסה עבור בורגי העוגן. לקדוח את הגולגולת על כל אתר עם מקדחה שיניים כדי להכניס את סיבים אופטיים ולתקן את הבורג. . תתקן את הבורג על הגולגולת היזהרו לא לשבור את הדורה או נזק רקמות על ידי בורג.</li>
		<li>הכנס את סיבי הראיה בעדינות עד שהגיע מעל ל-BNST עם מניפולטור. הפרשול צריך לנוח על הגולגולת שנותרה (איור 1B).</li>
		<li>החלת מלט שיניים פוטולריפוי (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את הסיבים ואת הבורג. זמן התגובה כדי לחזק את הדבק צריך להיות מצוין על ידי המדריך של היצרן (החומר שלנו זקוקה לחשיפה לאור עבור לפחות 10 s עם התמונה באורך גל ספציפי-גנרטור. אין צורך לייבש את הדבק אחרי זה.</li>
		<li>בשלב זה, ודא שאין חומרים (בורג או דבק) תופסים את השטח הגובר עבור האלקטרודות. בנוסף, להימנע מלעשות כל הפרעה בבטון עבור חזיות חיבור סיבים אופטיים וכבלים. חזור על הצעדים 1.10.1-1.10.4 בצד הנגדי של גירוי דו-כיווני.</li>
	</ol></li>
	<li>מקדחים לאלקטרודות של EEG/EMG. הכנס את קצות האלקטרודות לתוך החורים. החזיקו את השתל והחילו דבק ציאנואקרילי לחלל שבין הגולגולת לאלקטרודות. הוסף שוב עם תשומת לב לא להתערב בחומרים כלשהם.</li>
	<li>לכסות את ההיקף של אלקטרודות וסיבים אופטיים עם דבק ציאנואקרילי ואחריו יישום של מאיץ ציאנואקריאקרילי על דבק. שלב זה נמנע מגרימת הפרעה בכבל הפרכלל-לאופטי ובאזור חיבור התיל-אל-מוביל (איור 1C). הערה: דבק ציאנואקרילי והמאיץ שלו. מזיקים לעין העכבר שים לב לא לגרום לניקוז של חומרים כימיים אלה. כמו כן, להיזהר לא לגעת מאוד אלקטרודות וסיבים כדי למנוע סטייה בלתי צפויה מיד לאחר מיצוק דבק.</li>
	<li>לחשוף את שרירי הצוואר העכבר ולהכניס את החוטים של האלקטרודה EMG מתחת לשריר. התאימו את אורך האלקטרודה EMG כך שהיא מאתרת רק מתחת לשרירי הזמן. חיבור אור בין קצה של אלקטרודה fascia שרירים הוא מספיק כדי לתפוס את האות EMG.</li>
	<li>החלת דבק ציאנואקרילי כדי למלא את השתלים ולחזק את הדבק עם נוזל האצה. לאחר מכן, הניחו את העכבר על משטח חום להתאוששות עד שיופיע רפלקס הפוסט-אורל. כוונן את טמפרטורת משטח החום לטמפרטורת הגוף למנוחה בעלי חיים (36.0 ° צ' ב-ZT 0-12 במקרה של עכברים C57BL6; לא יעלה על 38.0 ° c). הערה: אנטיביוטיקה אינה נדרשת לניתוח סטרילי.</li>
	<li>בצע את ההנחיות המוסדיות המקומיות שלך לחוסר כאבים שלאחר הניתוח. לשמור את העכברים בכלוב הבית לתקופת התאוששות של לפחות 7 ימים.</li>
</ol>2. מעקב EEG/EMG עם העירור התמונה של נוירונים ממוקדים במצבי שינה ספציפיים
זהירות: פרוטוקול זה כולל שימוש בציוד לייזר מסוג class 3B או בהתקני LED. יש לשים לב למידע על בטיחות. משקפי העין המגן נדרשים.
<ol><li>לפני חיבור כבל הלייזר לסיבים אופטיים, להתאים את עוצמת הלייזר עם scaler. לקשור את קצה כבל הלייזר לסיבים אופטיים שאינם בשימוש עם כלל ולוודא כי אין מקום בצומת בין סיבים לכבל.</li>
	<li>הפעל את המתג הראשי של הלייזר והמתן 20 דקות לחימום.</li>
	<li>לפלוט את הלייזר לבודק האינטנסיביות ולהתאים את עוצמת הלייזר ל 10 mW/mm2. לשנות את מצב הלייזר כדי ההיגיון טרנזיסטור ולאשר כי פולסים אור נפלטים סיבים מבוקרת על ידי הרגולטור דפוס אשר מוגדר ב 10 ms למשך, 40 ms עבור מנוחה, 20 פעמים עבור מחזור, ו 20 פעמים חוזר (כלומר, 20 הרץ של 10 הפולסים האור עבור 20 s).</li>
	<li>לאחר תקופת ההחלמה, להעביר את העכברים לחדר ניסיוני עבור הקלטת EEG/EMG. עכברים בבית באופן קבוע 23 ° צ' עם מחזור 12 שעות אור/כהה עם מזון ומים זמין ad libitum.</li>
	<li>לחבר את האלקטרודה מושתל מתאם כבל אשר קשור לטבעת התגית כדי למנוע שזירה. מומלץ לכסות את הצומת עם חומרים בלתי מסוגלים לאור כגון רדיד אלומיניום כדי למנוע דליפת לייזר. אם נדרש ניסוי דו-כיווני, השתמש בטבעת הצמדה עם קובץ מצורף של bifurcate עבור הכבלים.</li>
	<li>בפרוטוקול זה, אנו להעריך את ההשהיה לערות מ-NREM שינה או שינה REM, כך זמן ההקלטה צריך להיות מוגבל בזמן האופטימיזציה ממוטבת (ZT0 מוגדר כשעה כאשר האור הוא על). פרוטוקול זה נערך בין ZT4-ZT10. תנו לעכברים להישאר בחופשיות בחדר הניסיוני לפחות 1 h כהאקטיזציה.</li>
	<li>במהלך התקופה הניסיונית, לפקח EEG ו-EMG אותות באותו צג ולהעריך את מצב העכבר כמו ערות, NREM לישון או לישון ראם. השתמש בבקרת הרווח עבור כל גל כדי להקל על ההבחנה בין כל מדינה.</li>
	<li>למדידת שינה NREM כדי השהיה ערות, להתבונן יציב NREM שינה עבור 40 s או יציב REM לישון עבור 30 s, ואז להפעיל את הבורר של מחולל דפוס עבור פוטוגריית (פרוטוקול זה יוצר 20 הרץ של 10 אלפיות התשעים של האור עבור 20 s). תאשר פליטת לייזר. לסיבים האופטיים המושתל</li>
	<li>הקלטה של אותות EEG/EMG עד שמצב השינה משתנה לערות. אם יש צורך בשני מבחנים ניסיוניים או יותר, יש להגביל את המניפולציה האופגנטית פעם ביום משום שהגירוי בתמונה הוא התערבות מלאכותית שעלולה להשפיע על אדריכלות השינה/הערות.</li>
	<li>לאחר הניסוי, מורדם מאוד ומעשה עם תמיסת מלח סטרילי ופאראפורמלדהיד (בכיוון ההוא) לדגימת המוח כולו עבור ניתוח אימונוהיסטוכימיה26.</li>
</ol>3. ניתוח זמן ההשהיה מ NREM שינה לערות
<ol><li>לאחר הקלטת אותות EEG/EMG, להעביר את נתוני האות למחשב עבור הבקיע שינה/מצבי ערות. פרוטוקול זה מתאר את השיטה לניתוח EEG עם תוכנת הקלטה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הפעל את יישום סימן השינה ולחץ על כרטיסיית הקובץ ובחר באפשרות פתיחה כדי לבחור את הנתונים המוקלטת (קובץ. kcd). לחץ על הכרטיסיה שינה כדי לבחור זמן תקופה להתאמת חלון הזמן עבור כל תקופה (אנו משתמשים ב-1 תקופה/4 שניות).</li>
	<li>באופן ידני הציון שינה/ערות מדינות המבוססות על אותות EEG/EMG, על פי הקריטריונים הבאים: עירות, EMG גבוהה ומתח EEG נמוך עם תדר גבוה; NREM, בטון נמוך EMG ובמתח EEG גבוה עם δ גבוהה (0.5-4 Hz) תדר; ו REM, EMG מציין שריר atonia ומתח EEG נמוך עם high θ (6-9 Hz) תדר. מדינה שאינה נמשכת ברציפות עבור 16 s (כלומר 4 מנות) אינה מוגדרת כשינוי מדינה משום שהיא אינה מצב יציב.</li>
	<li>לחץ והחזק את לחצן העכבר השמאלי בתקופה הראשונה וגרור את הסמן עד המגמה הספציפית של יותר מ -16 (4 מנות) הוא הסתיים. לאחר מכן, שחרר את לחצן העכבר השמאלי ובחר את המצב המתאים (ערות או שינה NREM או שינה REM) בחלון המוקפץ. חזור על הליך זה כדי להבקיע כל אותות EEG/EMG שנרשמו בקובץ.</li>
	<li>מצא את הזמן המדויק של גירוי בתקופה שבה EEG מראה NREM או ראם שינה, ואת התקופה מראה מעבר המדינה בעקבות נקודת גירוי. ספור את מספר הנקודות בין התקופות שלאחר הגירוי ובדיוק לפני מעבר המדינה.</li>
	<li>לאחר מכן הכפל את מספר האפוקסי הנספר ב -4 s (א). בעידן הגירוי, קחו צילום מסך ומדדו את הרוחב בין נקודת הגירוי לסוף התקופה. לאחר מכן, חלק את האורך הנמדד על-ידי אורך התקופה כולה והכפל ב -4 s (ב). באופן דומה, לחשב את משך שינה NREM בתקופה של שינוי המדינה, מה שאומר את הזמן בין תחילת התקופה ואת נקודת שינוי המדינה (ג).</li>
	<li>Sum A, B ו-C כדי לקבל את ההשהיה מ-NREM לישון לערות. אותו הליך משמש לניתוח של מעבר המדינה מ REM שינה לערות.</li>
</ol>

<ol><li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder%3A+Secondary+symptom+or+core+feature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li>
<li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li>
<li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+and+anxiety+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li>
<li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li>
<li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice%3A+Molecular+genetics+of+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li>
<li>Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-process+model+of+sleep+regulation%3A+A+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sleep+Research%22%5BJournal%5D)">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li>
<li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+human+sleep%3A+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li>
<li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic%2C+circadian%2C+and+emotional+regulation+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li>
<li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+state+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li>
<li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overshadowed+by+the+amygdala%3A+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+wakefulness+and+arousal%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li>
<li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li>
<li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-based+interrogation+of+sleep+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li>
<li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li>
<li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer%3A+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li>
<li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li>
<li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li>
<li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li>
<li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li>
<li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLin%2C+F+%22Handbook+of+practical+immunohistochemistry%3A+frequently+asked+questions%22">Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+neurons%3A+tools%2C+applications%2C+and+experimental+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li>
</ol>

פרויקט זה היה נתמך באופן חלקי כספית על ידי מרק & Co.

אנו כאן הציגו שיטה כדי להעריך את ההשפעה של גירוי אלקטרואופטיקה של נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות על מעברים מדינה של שינה/ערות והעניק דוגמה של מניפולציה של הנוירונים בע. הנתונים שלנו הראו כי השפעת השפעת הנוירונים באופן מיידי על ידי הנירע באמצעות מעבר מיידית מ-nrem לישון לערות.
עיצובים ניסיוניים שונים זמינים בגלל התפתחות של סוגים רבים של כלים אלקטרואופטיקה. ניתן להפעיל או לעכב את הפעילות העצבית של נוירונים מסוימים באמצעות סוגים שונים של האופינים, כגון ChR2, SSFO, halorho...

שינה חיונית לתפקוד קוגניטיבי אופטימלי. הממצאים האחרונים גם מראים כי הפרעות בשינה משויכים מגוון רחב של מחלות1,2,3. למרות שפונקציות השינה הן עדיין לא פתורות, התקדמות משמעותית נעשתה לאחרונה בהבנת מעגלים עצביים ומנגנונים השולטים שינה/ערנות מדינות4. ביונקים, ישנם שלושה מצבי דריכות: ערות, התנועה לא מהירה העין (NREM) לישון, ואת העין מהירה תנועה (REM) לישון. ערות מאופיין בתנודות מהירות של EEG (5-12 Hz) של משרעת נמוכה עם פעילות מוטורית מהירה ומתמשכת. שינה NREM מוגדר על ידי תנודות איטיות (1-4 Hz) של משרעת גבוהה (גלי דלתא), עם חוסר הכרה ופעילות מוטורית תכליתי. שינה REM מתאפיינת בתנודות מהירות יחסית (6-12 Hz) של משרעת נמוכה וכמעט מוחלטת של שריר דו צדדי atonia5.
Borbely הציע תאוריה של התקנה שינה-ערות המכונה 2 תהליך הדגם6,7. תהליך הומסטטי, המכונה גם תהליך S, מייצג לחץ שינה המצטבר במהלך הערות ומתמוסס במהלך השינה. תהליך נוסף, המכונה תהליך C, הוא תהליך מעגלי, מה שמסביר מדוע רמות הדריכות משתנים במחזוריות של 24 שעות. בנוסף לשני תהליכים אלה, גורמים allostatic חשובים גם לוויסות שינה/ערות8,9. גורמים אלוסטטיים כוללים מצבים תזונתיים ורגשות. פחד וחרדה מלווים בדרך כלל על ידי עלייה בהתעוררות יחד עם תגובות אוטונומיות ונוירואנדוקרינים10,11,12. המערכת הלימבית הוא האמין לשחק תפקיד בוויסות של פחד וחרדה, ומנגנונים בבסיס התגובות האוטונומית האנדוקריניים נחקרו בהרחבה, אבל את השביל שבו המערכת הלימבית משפיע שינה/ערנות מדינות לא עדיין נחשף. מספר רב של מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות opto-ו פרמקוגנטיקה הציעו כי נוירונים ומעגלים עצביים להסדיר שינה/ערות מדינות מופצים ברחבי המוח, כולל את מערבולות, בסיס המוח הקדמי, תלמוס, ההיפותלמוס, וגזע המוח. בפרט, פיתוחים אחרונים באלקטרואופטיקה אפשרו לנו לעורר או לעכב מעגלים עצביים ספציפיים in vivo עם רזולוציות מרחבית וזמני גבוהה. טכניקה זו תאפשר התקדמות ההבנה שלנו של מצעים עצביים של שינה וערות, וכיצד שינה/הערות מדינות מוסדר על ידי תהליכים מעגליות, לחץ שינה, וגורמים allostatic, כולל רגש. נייר זה נועד להציג כיצד להשתמש מניפולציה אלקטרואופטיקה בשילוב עם הקלטת שינה/התעוררות, אשר יכול להיות הפוטנציאל לעדכן את ההבנה שלנו של התחברות ומנגנונים במוח כי לשחק תפקיד בוויסות NREM לישון, ראם לישון, וערות. הבנה של מנגנון זה שבו המערכת הלימבית מסדיר מדינות שינה/ערנות היא בעלת חשיבות עליונה לבריאות, כי נדודי שינה קשורה בדרך כלל עם חרדה או פחד להיות מסוגל לישון (somniphobia).
הוא נחשב לתפקיד חיוני בחרדה ובפחד. גד 67-הבעת הנוירונים הם אוכלוסייה מרכזית של הבנסט12,13. בדקנו את ההשפעה של מניפולציה אלקטרואופטיקה של הנוירונים האלה (נגבה בידיndt) על מדינות שינה/ערות. אחת ההתקדמות הגדולה ביותר במדעי המוח בשנים האחרונות הייתה שיטות המאפשרות מניפולציה של נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות בvivo, עם רזולוציות מרחבית וזמני גבוהות. אלקטרואופטיקה היא שימושית מאוד להפגין קשרים סיבתי בין פעילות עצבית ותגובות התנהגותיות מסוימות14. אנו מתארים אלקטרואופטיקה כשיטה לבחון את הקישוריות הפונקציונלית של מעגלים עצביים מוגדרים בוויסות מצבי שינה/ערנות. באמצעות שימוש בטכניקה זו, הושגה התקדמות רבה בהבנת המעגלים העצביים המוסתים שינה/ערות מדינות15,16,17,18,19 . במקרים רבים, opsins מוצגים במיוחד נוירונים עם זהויות כימיות מסוימות באזורי המוח סלקטיבי על ידי שילוב של עכברים מנהל ההתקן והמין-inducible AAV-תיווך העברה גנטית. יתרה מזאת, ביטוי ממוקד של האופינים הרגישים לתמונה כגון המתקשרים 2 (ChR2)20 או הארכדופסין (archt)21 בשילוב עם מערכת מסוג-loxp או Flp-frt מאפשר לנו לתמרן אוכלוסיה עצבית סלקטיבית וספציפית . מסלול עצבי22
אנו מתארים כאן ניסויים על הנוירונים... כדי לבטא את האופינים באוכלוסיה עצבית ייעודית, עכברים מתאימים למנהלי התקנים של מנהלי ההתקנים ודרכי הווירוסים תלויי-היצור שבשימוש תכוף ביותר. שורות העברה או הקפאה, שבהן מתבטאת האופשות באוכלוסיות נוירואליות מסוימות, הן גם שימושיות. בניסויים הבאים, השתמשנו GAD67-יצורים טוק-in עכברים23 שבו רק gabaergic הנוירונים אקספרס היצורים RECOMBINASE עם רקע גנטי C57BL/6j, ו וקטור aav אשר מכיל ChR2 (hChR2 H134R) התמזגו עם eyfp או eyfp כפקד בבורר "FLEx (היפוך כריתה)"24. הנוהל מתאר במפורש את העירור האפגנטי של הנוירונים האחרים ב-BNST במהלך הניטור של מדינות שינה/ערות25.

<table><tbody><tr><td>1x1 סיבים אופטיים סיבוביים מפרקים</td><td>Doric</td><td>FRJ 1x1 FC-FC</td><td>לאופטוגנטיקה</td></tr><tr><td>6 פינים כותרת</td><td>KEL corporation</td><td>DSP02-006-431G</td><td></td></tr><tr><td>6 פינים שקע</td><td>Hirose</td><td>21602X3GSE</td><td></td></tr><tr><td>A/D ממיר</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>ממיר אנלוגי לדיגיטלי</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td><td></td><td></td><td>3.70 ופעמים; 1013(עותקים גנומיים/מ"ל)</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td><td></td><td></td><td>5.82&פעמים; 1013(עותקים גנומיים/מ"ל)</td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>פוג'י סרט</td><td>014-23302</td><td></td></tr><tr><td>מגבר</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>להקלטת EEG/EMG</td></tr><tr><td>וופורייזר הרדמה</td><td>Muromachi</td><td>MK-AT-210D</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אוטומטי</td><td>KD מדעי</td><td>780311</td><td></td></tr><tr><td>חותך קרביד</td><td>Minitor</td><td>B1055</td><td>&phi; 0.7 מ"מ. מתייחס כמקדחה דנטלית, בשימוש עם מיקרו-מנוע סיבובי במהירות גבוהה&nbsp;</td></tr><tr><td>הידבקות ציאנואקרילט&nbsp; (ארון אלפא A) ותאוצה</td><td>Konishi</td><td>#30533</td><td></td></tr><tr><td>אור ריפוי שיניים</td><td>3M</td><td>Elipar S10</td><td></td></tr><tr><td>דבק אפוקסי</td><td>Konishi</td><td>#04888</td><td>בידוד סביב ההלחמה של כבל תיקון 6 פינים ומוגן</td></tr><tr><td>כבל תיקון סיבים אופטיים (הסתעפות)Doric</td><td></td> <td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td><td></td></tr><tr><td>Gad67-Cre עכברים</td><td>שסופקו על ידי ד"ר קנג'י סאקימורה</td><td></td><td>גן Cre recombinase נדפק באלל Gad67</td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>Hamilton</td><td>65461-01</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיקרו-מנוע סיבובי במהירות גבוהה</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>בשימוש עם חותך קרביד</td></tr><tr><td>שרוול חיבור</td><td>Thorlab</td><td>ADAF1</td><td>&phi; 2.5 מ"מ קרמיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>פייזר</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>לייזר&nbsp; &nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>N/A</td><td>473 ננומטר</td></tr><tr><td>אורך גל בודק אינטנסיביות לייזר</td><td>קוהרנטי</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>ממריץ לייזר</td><td>מרכז מחקר ביולוגי</td><td>STO2</td><td>מתייחס כמחולל דופק בטקסט</td></tr><tr><td>סיבים אופטיים עם טבעת&nbsp;</td><td>Thorlab</td><td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2-rh10</td><td>מסופק על ידי PennVector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1A-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>Addgene</td><td>plasimid # 20296</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>מסופק על ידי ד"ר קארל דיסרות'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כבל תיקון</td><td>דוריק</td><td>D202-9089-0.4</td><td>אורך 0.4 מ', מוליך לייזר בין לייזר ומפרק סיבובי</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צמנט דנטלי הניתן לריפוי</td><td>3M</td><td>56846</td><td></td></tr><tr><td>מהדק סראפין</td><td>Stoelting</td><td>52120-43P</td><td></td></tr><tr><td>כבל מוגן</td><td>mogami</td><td>W2780</td><td>הלחמה לשקע 6 פינים להקלטת EEG/EMG</td></tr><tr><td>תא הקלטת שינה</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>תוצרת קוסטום (21 ס"מ; 29 ס"מ ופעמים; 19 ס"מ) עם מחזיק מיכל מים</td></tr><tr><td>תוכנת שלטי שינה</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/A</td><td>לניתוח EEG/EMG</td></tr><tr><td>טבעת</td><td>החלקה מדעי המוח, inc</td><td>N/A</td><td>לניתוח EEG/EMG</td></tr><tr><td>בורג אל חלד</td><td>Yamazaki</td><td>N/A</td><td>&phi; 1.0 x 2.0</td></tr><tr><td>חוט אל חלד</td> חוט <td>קונר</td><td>AS633</td><td>&nbsp; מסגרת סטריאוטקסית בקוטר 0.0130 אינץ</td></tr>' <tr><td>עם קונסולה דיגיטלית</td><td>Koph</td><td>N / A</td><td>דגם 940</td></tr><tr><td>מחט מזרק</td><td>המילטון</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מקליט חיונית</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/A</td><td>להקלטת EEG / EMG</td></tr></tbody></table>

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

בשנים האחרונות, אלקטרואופטיקה היתה בשימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר נוירודעי. במקרים רבים, opsin, כמו ערוץ הרודוסין 2 (ChR2), מבוטא על ידי וקטור וירוס בסוג מסוים של תאים עצביים בעכברים שונים של מנהלי התקנים. ההפעלה של opsins אלה מופעלת על ידי יישום של פולסים אור אשר מועברים על ידי לייזר או LED באמצעות כבלים אופטיים, ואת ההשפעה של ההפעלה היא נצפתה עם רזולוציה גבוהה מאוד. ניסויים מסוגלים לעורר בחריפות את הנוירונים תוך ניטור התנהגות או תוצאה פיזיולוגית אחרת בעכברים. אלקטרואופטיקה יכולה לאפשר אסטרטגיות שימושיות להערכת תפקוד של מעגלים עצביים בוויסות מצבי שינה/ערנות בעכברים. כאן אנו מתארים טכניקה לבדיקת ההשפעה של מניפולציה אלקטרואופטיקה של נוירונים עם זהות כימית ספציפית במהלך אלקטרונצלגרם (EEG) ו אלקטרומגנט (EMG) ניטור כדי להעריך את שלב השינה של עכברים. כדוגמה, אנו מתארים מניפולציה של הנוירונים GABAergic בגרעין המיטה של מסוף הניסטריה (BNST). הריגוש האופגנטי אקוטי של נוירונים אלה מעורר מעבר מהיר לערות כאשר מיושם במהלך שינה NREM. מניפולציה אלקטרואופטיקה יחד עם הקלטת EEG/EMG יכול להיות מיושם כדי לפענח את המעגלים העצביים כי להסדיר שינה/ערות מדינות.

המחקר הנוכחי הראה את ההשפעה של השפעת האופגנטיות של הנוירונים בתוך המדינה במצב שינה. ChR2-EYFP הביע באופן מידי ביטוי בנוירונים. An באתרו היברידיכימית מחקר היסטכימיות הראה כי ChR2-EYFP היה מקומי בנוירונים המבטא גד 67 mRNA אותות, המציין כי אלה הם נוירונים GABAergic. הסיבים האימונוהיסטוכימיים אישרו את מיקומו של הסיב האופטי, שקצהו היה בדיוק מעל ל-25.
איור 3A מראה נציג E...

כאן, אנו מתארים שיטות של מניפולציה אלקטרואופטיקה של סוגים מסוימים של נוירונים במהלך ניטור של שינה/ערנות מדינות בעכברים, הצגת העבודה האחרונה שלנו על גרעין המיטה של מסוף הניסטריה כדוגמה.

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

הליך זה יכול לעזור לנו לזהות את הפונקציה של מעגל נוירו ספציפי המעורבים בוויסות ערנות השינה עם מניפולציה פולשנית פחות ורזולוציה זמנית גבוהה. שיטה זו מאפשרת לנו את פני השטח ניטור EEG בזמן אמת בשילוב עם מניפולציה של מעגל נוירו ספציפי כדי לבחון את הקשר הסיבתי בין מעגלים מצבי ערנות שינה. שוטה קודאני תדגים את הנוהל.לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת הבוהן, יש למרוח משחה על עיני החיה ולהשתמש בפסי האוזן וסיבת האף למנגנונים הסטריאוטקטיים כדי לייצב את ראש העכבר הרדמה על כרית סופגת. כאשר הראש קבוע בעמדה, לעשות חתך באמצע sagittal בקרקפת כדי לאשר כי הצומת בין סאטורה sagittalis ו sutura coronalis או sutura lambdoidea נמצאים בקו אופקי באותה רמה. כדי למנוע פער מיקום, התאימו את קמצוץ האף ואת מוטות האוזן לפי הצורך.לאחר מכן באמצעות מהדקי סרפין כדי להחזיק את העור פתוח לחטא את פני השטח החשופים של הגולגולת כדי לאפשר את התפרים הגולגולת להיות חזותיים בצורה ברורה יותר. כדי להזריק את וקטור וירוס אדנו הקשורים, לטעון מזרק אתנול מעוקר 10 מיליליטר עם שני microliters של שמן מינרלי, ואחריו נפח ניסיוני של וירוס להיות מוזרק. השתמש במשאבת microinjection כדי להתאים את קצה מחט microinjection על bregma ולציין את הקואורדינטות כנקודת המוצא.לאחר מכן להעביר את הקצה לאתר ההזרקה המיועד ולמקם את קצה המחט על המיקום. סמן את הגולגולת באתר ההזרקה ולהשתמש במקדחה שיניים מצויד חותך קרביד 0.7 מילימטר לקדוח חור בקוטר של כשני מילימטר לתוך הגולגולת. לאחר הסרת דם מסביב לחור עם צמר גפן, לאט להזיז את המחט אל גרעין המיטה של terminalis סטריה או BSNT לאט להזריק את הנפח המיועד של פתרון וירוס.ואז להשאיר את המחט במקום במשך חמש דקות כדי לאפשר לפתרון מספיק לחדור את רקמת BNST לפני בזהירות לסגת המחט. עבור אלקטרואנצפלוגרם, או EEG, ו electromyogram, או EMG, השתלת אלקטרודה, הלחמה הראשונה שני חוטי נירוסטה שממנו מילימטר אחד של בידוד הופשט משני הקצוות אל אלקטרודות EMG ולמקם את מרכז האלקטרודות על bregma. לאחר מכן סמן את המיקום עבור כל אלקטרודה EEG.כדי לקבוע את המיקום של שתל הסיב האופטי, חבר סיב אופטי ferrule למניפולטור ולסובב את זרוע המניפולטור לזווית פלוס או מינוס 30 מעלות נגד קו אופקי. שים את קצה הסיבים על bregma ולהקליט את הקואורדינטות. הזז את הקצה לקו הכניסה הממוקד וסמן את המיקום על הגולגולת ואת המיקום של בורג העוגן ליד אתר הכניסה.השתמש במקדחה שיניים כדי לקדוח את הגולגולת בכל אתר ולהשתמש מניפולטור בעדינות להכניס את הסיב האופטי עד שהוא מגיע מעל BNST. פרול צריך לנוח על הגולגולת הנותרת. לאבטח את הסיבים לגולגולת עם בורג עוגן, דואג לא לשבור את דורה או נזק כל רקמה.ואז לכסות את הסיבים בורג עם מלט שיניים לריפוי צילום. לאחר מכן, לקדוח חורים עבור אלקטרודות EEG / EMG ולהכניס את קצה האלקטרודה הראשונה לתוך חור אחד. החזקת השתל ביד אחת, להחיל דבק cyanoacrylate על החלל בין הגולגולת לבין האלקטרודה ולהכניס את האלקטרודה שאר הדרך, דואג לא לפגוע בכל רקמה.כאשר כל האלקטרודות הוצבו, לכסות את היקף האלקטרודות ואת הסיבים האופטיים עם דבק cyanoacrylate נוספים מאיץ cyanoacrylate כדי למנוע גרימת כל הפרעה בפרולה לכבל אופטי ואלקטרודה להוביל אזורי חיבור חוט. עכשיו לחשוף את שרירי הצוואר, ולהכניס את החוטים לאלקטרודה EMG מתחת לשריר. התאימו את אורך האלקטרודה EMG כך שתתאים ממש מתחת לשרירי הנוכל וממלאים את השתלים בהיבקות ומאיץ יותר של ציאנואקרילאט.לאחר מכן מניחים את העכבר על כרית חום עם ניטור עד פיצוי מלא. לניטור EEG/EMG במהלך עירור הצילום של נוירונים ממוקדים, השתמש תחילה בסקלאר כדי לכוונן את עוצמת הלייזר ולהשתמש בפרול כדי לקשור את קצה כבל הלייזר לסיבים אופטיים שאינם בשימוש. ודא שאין מקום בצומת שבין הסיב לכבל.לאחר 20 דקות, פולטים את הלייזר החם אל בודק העוצמה ומתאימים את העוצמה ל-10 מילי-וואט למילימטר בריבוע. הגדר את משך הדופק הקל ל- 10 אלפיות השניה, את תקופת המנוחה ל- 40 אלפיות השניה, את המחזור ל- 20 ואת החזרה ל- 20. שנה את מצב הלייזר ללוגיקה טרנזיסטורית ואשר שפולסים של אור נפלטים מהסיבים הנשלטים על ידי וסת הדפוס.חבר את האלקטרודה המושתלת ואת מתאם הכבלים, ולאחר מכן לכסות את הצומת עם חומר אטום אור כדי למנוע דליפת לייזר. וכאשר הלייזר מוכן, להעביר את העכברים לתא הניסוי להקלטת EEG / EMG. כדי להעריך את ההשהיה ערנות מתנועת עיניים לא מהירה או שינה מהירה של תנועת עיניים, להגביל את זמן ההקלטה ואת האתר אופטימיזציה להרוויח זמן ולתת לעכברים לנוע בחופשיות בתא הניסוי לפחות שעה אחת.במהלך תקופת הניסיון, לפקח על אותות EEG ו- EMG באותו מסך הקלטה. להעריך את מצב העכבר כמו ערנות, תנועת עיניים לא מהירה לישון, או תנועה מהירה של העין לישון באמצעות שליטה לקבל עבור כל גל כדי להקל על הבחנה בין כל מדינה. למדידת השינה הלא מהירה של תנועת העיניים להשהיית ערנות, יש להתבונן בשינה יציבה של תנועת עיניים לא מהירה למשך 40 שניות, ולאחר מכן הפעל את מחולל הדפוסים לגירוי תמונות ואשר את פליטת הלייזר לסיבים האופטיים המושתלים.לאחר מכן הקליטו את אותות EEG/EMG עד ש מצב השינה ישתנה להתעוררות. כאן מיוצגים עקבות EEG / EMG לפני ואחרי גירוי תמונה במהלך שינה תנועת עיניים לא מהירה מוצגים. EEG במתח גבוה ותדר איטי ללא אותות EMG, מייצג שינה לא מהירה בתנועת העין.גירוי צילום עורר מעבר חריף ערנות כשתי שניות לאחר גירוי channelrhodopsin-2 הבעת עכברים תוך כדי שליטה עכברים לא להדגים את המעבר הזה, מה שמרמז כי עירור של נוירונים BNST גאבא במהלך שינה לא מהירה בתנועה העין מפעילה אינדוקציה מהירה של ערנות. לעומת זאת, גירוי צילום במהלך שינה תנועת עיניים מהירה לא הייתה השפעה ולכן אפקט המעבר הופיע רק בשנת תנועת עיניים לא מהירה. חשוב לדאוג לתיאום מדויק של הזרקת הנגיף וצעדי השתלת סיבים אופטיים.עקבות EEG / EMG שנתפסו במהלך ניתוח השינה ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשלכות של מניפולציה תמונה על מצבים ערניים שונים בעכברים. טכניקה זו גם תעזור לנו לזהות רכיבים ומעגלים אחרים המעורבים בוויסות מצבי ערנות השינה. השתמש משקפי מגן כדי למנוע נזק לייזר לעין הקפד תמיד autoclave לעקר את מיכל וקטור וירוס הקשורים אדנו לאחר השימוש.

optogenetic-manipulation-neural-circuits-during-monitoring

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

מקור: Kodani, S., et.al. מניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים במהלך ניטור מצבי שינה/ערות בעכברים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את המניפולציה האופטוגנטית של מעגלים עצביים המעורבים במעבר משינה לערות בעכברים. ההליך כולל השתלה כירורגית של סיב אופטי ואלקטרודות במוח ובשרירים כדי לאפשר גירוי אור ורישום אלקטרופיזיולוגי. על ידי אספקת אור להפעלת תעלות קטיון רגישות לאור בגרעין המיטה של הסטריה טרמינליס (BNST), הפעילות העצבית מווסתת, ומאפשרת לחוקרים לנתח אותות מוחיים ושרירים הקשורים לאינדוקציה של ערות.

מניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים למעבר משינה לערות בעכברים

סרטון זה מדגים פרוטוקול לוויסות תנודות תטא במודל עכבר מהונדס גנטית עם תעלות יונים רגישות לאור בנוירוני המחיצה המדיאלית GABAergic שלו. על ידי העברת פולסי אור להיפוקמפוס, הפרוטוקול נועד לסנכרן את הפעילות העצבית וליצור תנודות תטא, אשר נרשמות כפוטנציאלי שדה מקומיים.

מניפולציה סלקטיבית של תנודות תטא במודל עכבר

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

הרישום של אלקטרואנצפלוגרמה (EEG) ואלקטרומיוגרמה (EMG) בעכברים שמתנהגים בחופשיות הוא צעד קריטי למתאם התנהגות ופיזיולוגיה עם שינה וערות. הפרוטוקול הניסיוני המתואר כאן מספק מערכת מבוססת כבלים לרכישת הקלטות EEG ו-EMG בעכברים.

נוהל הקלטת פוליגרפים למדידת שינה בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוצדורות ניסוייות ואנליטיות כדי לתאר את הדינמיקה הזמנית של המשתנים העצביים והלבניים של שינה שאינה REM בעכברים, המווסתים את היענות השינה לגירויים אקוסטיים.

כימות אינפרה איטית דינמיקה של הספק ספקטרלי ואת קצב הלב בעכברים שינה

אנו מתארים את השימוש optogenetics והקלטות אלקטרופיזיולוגיות עבור מניפולציות סלקטיבי התנודות תטא בהיפוקמפוס (5-10 Hz) בעכברים להתנהג. היעילות של entrainment הקצב נעשה באמצעות שדה מקומי פוטנציאל. שילוב של באופטו - וניגוד pharmacogenetic מטפל מדידה efferent הסינכרון בהיפוקמפוס.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה של מדידת שינה באמצעות פיקוח הביתה כלוב מבוסס-פעילות. שיטה זו מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות מבוססות-EEG. זה טוב מאומת מצפני משך השינה הכולל והוא יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לפקח על שינה במודלים מכרסם של מחלות אנושיות.

נחישותם לא פולשנית, תפוקה גבוהה של משך השינה בחולדות

עבודה זו מציגה שיטה לבצע optogenetic יחיד-יחידת הקלטה אמינה מכל עכבר ער באמצעות optrode של זכוכית בהזמנה אישית.

Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער

עם מניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות או אזורים במוח, התנהגות ניתן לשנות עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה בבעלי חיים נעים בחופשיות. באמצעות כלים אופטוגנטיים שונים בשילוב עם סיבים אופטיים מושתלים כרונית, ניתן לבצע מגוון של אפנון עצבי ובדיקות התנהגותיות.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

מאמר זה מתאר פרוטוקול למניפולציה של מטרות מולקולריות בקליפת המוח באמצעות וירוסים הקשורים אדנו לניטור ההשפעות של מניפולציה זו במהלך ערנות ושינה באמצעות הקלטות אלקטרוקורטיקוגרפיות.

הקלטה אלקטרוקורטיקוגרפית של אזורי קליפת המוח מניפולציה באמצעות וירוס הקשור אדנו מיקוד Cofilin בעכברים

חקור מניפולציה אלקטרואופטית של מעגלים עצביים בזמן ניטור מצבי שינה וערות בעכברים. שיטה זו מאפשרת לחקור קשרים סיבתיים בין פעילות נוירונים לרגולציית שינה.

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

גלה סרטונים נוספים