. Microbiopsy ספיגה דגימה והפקת RNA דם פולשנית ובו-זמניים וניתוח בעור

שיטה זו יכולה להקל על הקמת סמנים ביולוגיים למחלות עור וגם להפחית את הסיכון למשתתפים במחקר קליני. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי זה לא דורש אימון אינטנסיבי וזה לא משאיר צלקות. חמש דקות לפני המיקרוביופסה, מניחים צינור צנטריפוגה ריק של שני מיליליטר על קרח יבש במשך חמש דקות.

לובש כפפות חד פעמיות, לרסס את הידיים וכלים עם 70% אתנול לפני חיטוי אתר היישום בנושא עם לנגב אלכוהול. מוציאים את הביופסיה הזעירה מחבילת קרינת הגמא הסטרילית מבלי לגעת במיקרונידל ומושך את הבוכנה עד שנשמעת לחיצה והבוכנה ננעלת במקום. כוונו את המכשיר הטעון בזווית מאונך בערך לעור שיש לדגום, דואגים שאזור הדגימה נמצא במצב קבוע ומחילים את המכשיר על העור בתוך קילוגרם אחד לפחות של כוח.

לאחר מכן לחצו על ההדק והחזיקו את המכשיר במקומו למשך עשר שניות לפחות. אם המכשיר משוחרר לפני עשר שניות, יש סיכוי גבוה יותר לשינוי בספיגת הדם וגם בניתוח הבא. כאשר המדגם נספג, בעדינות למשוך את הבוכנה microneedle סופג מן המקרה ולהשתמש מדפים סטריליים למשוך על שני החורים של microneedle כדי להסיר אותו מן הבוכנה.

מוסיפים 50 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי לצינור על קרח יבש ומ מניחים את המיקרונידל שלם בצינור בצד מחט קרח יבש למטה. היזהר לא לתת לקצה המיקרונידל לגעת בשום דבר במהלך תהליך ההסרה. Vortex הצינור במשך שלוש עד חמש שניות כדי לאסוף כמה חומר שנדגם מן קצה microneedle דגירה הצינור בבלוק חום או אמבט מים במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, השתמש במקלות סטריליות כדי למקם את הקצה האחורי של רמת המיקרונידל עם הקצה העליון של צינור המיקרופוגה ולסגור את מכסה הצינור כך שהחלק העליון של המיקרונידל מוחזק במקום בין הכובע לצינור. צנטריפוגה הצינור כדי לאסוף את החומר שנדגם מהשכבה סופג של המכשיר ולהשתמש במקלחים כדי להסיר בזהירות את microneedle מבלי לטבול את הקצה בחזרה לתוך פתרון החיץ. צנטריפוגה המדגם שוב בזהירות להעביר את supernatant לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חדש.

לאחר מכן להוסיף 250 microliters של חיץ מיזוג על קרום מסנן עמוד טיהור עבור דגירה חמש דקות בטמפרטורת החדר לדלל את המאגר על ידי צנטריפוגה. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 70% אתנול לדגימה המופקת של RNA עם ערבוב עדין והעברת התערובת לעמודת הטיהור ה מותנית מראש. מיד צנטריפוגה הצינור פעמיים כדי להסיר את הזרימה דרך, ואחריו לשטוף מאה microliters של חיץ לשטוף אחד.

לעיכול DNA, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של דגירה DNAs טריים המוכנים ישירות על קרום עמוד הטיהור עבור דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר ואחריה שטיפה עם 40 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה אחד. בסוף הצנטריפוגה, לשטוף את העמוד עם 100 microliters של מאגר לשטוף שני ולבדוק את עמוד הטיהור עבור כל מאגר לשטוף שיורית. העבר את עמוד הטיהור לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה מיקרו 0.5 מיליליטר המסופק בערכת החילוץ RNA ולהציב את קצה פיפטה ישירות על הממברנה של עמוד הטיהור להוסיף 11 microliters של מים RNA sPRE לעמודה.

לאחר דגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה הטור פעם אחת כדי להפיץ את מי sPRE RNA לאורך העמוד, ופעם אחת כדי לחמק RNA. לאחר מכן לאחסן את מדגם RNA הכולל במינוס 80 מעלות צלזיוס אם סינתזת cDNA אינה מבוצעת באופן מיידי. מיקרונידל microbiopsy סופג מורכב משתי שכבות של צלחת פלדה עם שכבה סופגת בין לדגימה בו זמנית של העור והדם.

השימוש במיקרוביופסה סופגת גורם רק אריתמה קלה, זה לא מורגש לאחר 48 שעות. לאחר הנקב, כמה חתיכות זעירות של העור נלכדים ליד קצה המיקרונידל והדם נספג לתוך נייר המסנן. כאשר המיקרונידל הסופג מוסר מיד לאחר הניקוב, נפח המדגם והכמות הבאה של mRNA שחולץ נמוך משמעותית מזה שהושג לאחר החזקה במשך עשר שניות לאחר הדקירה.

רמות דומות של ביטוי סמן העור מזוהות לאחר השימוש במיקרוביוספיה סופגת ובמיקרוביופסה העור הקודמת שלה על ידי ניתוח PCR כמותי. אבל רמה גבוהה משמעותית של ביטוי סמן ביו תא דם לבן מזוהה לאחר דגימת microbiopsy סופג, מה שמרמז כי microbiopsy microneedle סופג מבצע טוב יותר עבור איסוף הדם תוך שמירה על אותה יכולת ללכוד דגימת העור כמו עם microbiopsy העור. אז בזמן יישום הטכניקה, חשוב לזכור כי החלת המכשיר על פי מה שאנו מציעים הוא חיוני להשגת תוצאות אמינות.

אז בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו PCR בזמן אמת, ניתן לעקוב אחר פרופיל ביטוי גנים יחסית. למרות שאנו עדיין מפתחים את המכשיר, אנו בטוחים כי הטכניקה סללה את הדרך למחקרים קליניים לביצוע דגימה, עבור קוסמטיקה דרמטולוגית או יישום ילדים כי זה פשוט כל כך פשוט וזה פולשני מינימלית.