Name: זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למדו שיטה לזיהוי פאנל מותאם אישית של microRNA מחולף בחולי סרטן המעי הגס הגרורתי. טכניקה זו מאפשרת הערכת ביומרקרים מרובים בו-זמנית עם כמות קטנה של חומר התחלתי ותוצאות אמינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן באופן חלקי על ידי רוש S.p.A., סוכנות התרופות האיטלקית (דמרי).

הערה: לבצע את כל הפעולות הבאות תחת ברדס fume סטיריליים על פי התרגול מעבדה טובה (GLP).
1. פלזמה האיסוף והאחסון
<ol><li>לאסוף 3 מ"ל של דם היקפיים צינור K3E EDTA.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור בטמפרטורת החדר ב x 1,880 g למשך 15 דקות.</li>
	<li>לשחזר פלזמה supernatant ב aliquots של 450 µL.</li>
	<li>לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. הערה: תהליך הצינור דם היקפיים בתוך שעתיים של אוסף. בעת התאוששות הפלזמה הצינור, נא לא להפריע השכבה לימפוציטים.</li>
</ol>2. מיצוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה (טבלה של חומרים)
<ol><li>
להכין את כל הפתרונות הנדרשים, להפשיר את הדגימות עבור הצעדים החילוץ.
	<ol>
<li>להוסיף 375 µL של מרקפטואתנול הפתרון x denaturating 2 ומערבבים היטב.</li>
		<li>להוסיף 21 מ של ACS כיתה 100% אתנול הפתרון לשטוף miRNA אני, לערבב היטב.</li>
		<li>להוסיף 40 מ של ACS כיתה 100% אתנול הפתרון לשטוף 2/3 ומערבבים היטב.</li>
		<li>לאפשר מסך פלזמה aliquot כדי להפשיר בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להתחיל את השלבים החילוץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חילוץ אורגני
	<ol>
<li>העברת µL 400 המדגם פלזמה לתוך צינור ללא RNase 2 מ"ל.</li>
		<li>להוסיף 400 µL של פתרון x denaturating 2, לערבב על-ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה.</li>
		<li>להוסיף 4 µL 1 ננומטר ספייק-אין לערבב על ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה.</li>
		<li>הוסף µL 800 של חומצת פנול-כלורופורם.</li>
		<li>מערבולת עבור 60 s ו צנטריפוגה במהירות המרבית (≥ 10, 000 x g) למשך 15 דקות.</li>
		<li>להעביר את שלב מימית העליון צינור טריים. נא לא להפריע את לאטמוספרה. הערה האחסון התאושש ולמחוק את הצינור המכיל את שלב אי-acqueous. הערה: 2 x denaturing פתרון מאוחסן ב 4 ° C, עשוי לחזק בטמפרטורה זו. לפני השימוש, חמים הפתרון 37 ° C, לזעזע מדי פעם במשך 10-15 דקות להיות זהירים כדי למשוך את שלב תחתון המכילים את חומצת פנול-סם הרדמה, לא המאגר acqueous שנמצאת מעל התערובת. מחממים את פתרון • תנאי או נוקלאז ללא מים עד 95 מעלות צלזיוס. יש להיזהר חום אמצעי אחסון נאותים של פתרון (100 µL לכל דגימה + 10% עודף).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
העשרה RNA קטנים
	<ol>
<li>מוסיפים 1/3 כמות אתנול 100% לשלב מימית מהשלב 2.2.6 ומערבבים היטב.</li>
		<li>המקום מחסנית מסנן לתוך צינור אוסף טריים עבור כל דגימה.</li>
		<li>להעביר עד 700 µL של lysate שלב 2.3.1 ואתנול לתוך מסנן מחסנית צנטריפוגה ב 10,000 x g ב-30 s.</li>
		<li>אם יש > µL 700 של תערובת שמאלה, למקם את פילטרט של צינור טריים וחזור על שלב 2.3.3; חזור עד כל התערובת עבר דרך המחסנית מסנן.</li>
		<li>למדוד את הנפח הכולל של הזרימה דרך.</li>
		<li>להוסיף נפח 2/3 של אתנול 100% filtrate ולערבב היטב.</li>
		<li>הכנס מחסנית המסנן השני צינור אוסף טריים.</li>
		<li>להעביר עד 700 µL נפח דגימה לתוך הדיו, centrifuge ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 30 של הזרימה דרך.</li>
		<li>חזור על שלב 2.3.8 עד כל התערובת עבר דרך המחסנית מסנן.</li>
		<li>חלות µL 700 miRNA שטיפת פתרון 1 הדיו מסנן, centrifuge הדיו מסנן עם הצינור אוסף ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 15 של הזרימה דרך. מקם את מחסנית מסנן בצינור אוסף אותו.</li>
		<li>החל µL 500 של שטיפת פתרון 2/3 מסנן מחסנית, צנטריפוגה הדיו מסנן עם הצינור אוסף ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 15 של הזרימה דרך. מקם את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף טריים.</li>
		<li>למקם את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף טריים וחזור על שלב 2.3.11 עם 500 µL של שטיפת פתרון 2/3. למחוק את הזרימה דרך ולהעביר את מחסנית מסנן צינור אוסף טריים.</li>
		<li>Centrifuge השפופרות עם מכלי מסנן ב x 10,000 g עבור 1 דקות.</li>
		<li>להעביר את מחסנית מסנן לתוך צינור אוסף mL 1.5 טריים ומוסיפים µL 100 של פתרון • תנאי טרופה (95 ° C) או נוקלאז ללא מים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 10,000 x g ב-30 s כדי לשחזר miRNAs ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. הערה: התמיסה לבן עשוי בצורה הפתרון לשטוף 2/3. זה עודף EDTA שוחרר מן הפתרון. הימנע ממלאים גבישים אלו במהלך השלבים pipetting.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. לבצע שעתוק במהופך miRNA קדם הגברה (טבלה של חומרים)
<ol><li>
ביצוע התגובה פוליאדנילציה
	<ol>
<li>הפשרת כל ריאגנטים בקרח, אז בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ספין למטה את התוכן. בנוסף, הפשרה 50% פג 8000, ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מכינים את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה 0.5 mL, קבלת נפח סופי של 3 µL של תגובה קוקטייל עבור כל דגימה. השתמש את הכרכים הבאים, בתוספת 10% עודף אמצעי אחסון עבור כל ריאגנט.</li>
		<li>להוסיף µL 1.7 RNase ללא מים, 0.5 µL של 10 x Poly(A) מאגר, 0.5 µL של 10 מ מ ATP ו- 0.3 סוף סוף µL 5 תיקים עשויים U/µL האנזים.</li>
		<li>בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.</li>
		<li>להעביר µL 2 מדגם מכל קידוח של התגובה צלחת או תגובת הצינור ולהוסיף 3 µL של התגובה קוקטייל. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ספין למטה את התוכן.</li>
		<li>מניחים על הצלחת/צינורות הצנטרפוגה תרמי ולבצע את הפעולות הבאות.</li>
		<li>דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות (שלב פוליאדנילציה).</li>
		<li>דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (stop תגובה), עם אחיזה הבאים ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע את התגובה מצדו.
	<ol>
<li>להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.</li>
		<li>להוסיף µL 0.4 RNase ללא מים, µL 3 5 x מאגר ה-DNA ליגאז, 0.6 µL של 25 x מתאם מצדו, 4.5 µL של 50% 8000 פג, µL סוף סוף 1.5 של רנ א ליגאז.</li>
		<li>בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.</li>
		<li>להוסיף 10 µL של המיקס כל שפופרת טוב-תגובה המכיל את המוצר עוקב poly(A). מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.</li>
		<li>למקם את הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות: הדגירה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, עם קהל מעריצים להחזיק ב 4 º C. הערה: 50% 8000 פג הוא בעלי צמיגות גבוהה. השתמש בטמפרטורת החדר, כ רפה בעברית ו dispensing לאט. לאחר כל שאיפה, בכל שלב, להחזיק את plugger 10 s כדי לאפשר הכימית לזרום למעלה ולמטה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע את התגובה שעתוק במהופך.
	<ol>
<li>מכינים את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה, עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.</li>
		<li>הוסף µL 3.3 של RNase ללא מים, µL 6 5 x RT מאגר, µL 1.2 של dNTP מיקס (25 מ מ כל אחד), µL 1.5 של 20 x תחל RT אוניברסלי 3 סוף סוף µL של 10 x מיקס האנזים RT.</li>
		<li>בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.</li>
		<li>להוסיף µL 15 של המיקס כל שפופרת טוב-תגובה המכיל את המוצר מצדו. מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.</li>
		<li>מקום הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות.</li>
		<li>דגירה ב 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (שעתוק במהופך).</li>
		<li>דגירה ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (stop תגובה), עם אחיזה הבאים ב 4 º C. הערה: המוצר RT עכשיו ניתן לאחסן ב-20 ° C, יישאר יציב עד 2 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע את התגובה מיר-Amp (טבלה של חומרים).
	<ol>
<li>להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.</li>
		<li>הוסף µL 17.5 RNase ללא מים, µL 25 של המיקס מאסטר של מיר-Amp 2 x 2.5 µL של 20 x מיקס פריימר מיר-Amp.</li>
		<li>בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.</li>
		<li>עבור כל דגימה, להעביר µL 45 של המיקס התגובה כל טוב של צלחת תגובה חדשה או צינור התגובה. להוסיף 5 µL של המוצר RT כל שפופרת טוב או תגובה. מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.</li>
		<li>למקם את הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל כפי שמוצג בטבלה 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ביצוע PCR בזמן אמת
<ol><li>לדלל כל cDNA מדגם 1:10 במאגר טה 0.1 x.</li>
	<li>לחשב את מספר בארות/משכפל עבור כל דגימה. להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה, הוספת 10% נפח עודף.</li>
	<li>להוסיף 4 µL של מים נטולי RNase 10 µL של 2 x מהר מתקדם מאסטר מיקס (טבלה של חומרים), µL סוף סוף 5 של cDNA מדולל.</li>
	<li>לערבב על-ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה כדי לסובב את התוכן.</li>
	<li>העברת µL 19 של תערובת התגובה כל טוב, לאטום את הצלחת, בקצרה צנטריפוגה.</li>
	<li>מבצע פרוטוקול תרמי (טבלה 2) מערכת ה-RT-PCR.</li>
</ol>

<ol><li>Luo, H. -Y., Xu, R. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+and+prognostic+biomarkers+with+therapeutic+targets+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer.</a> World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).</li>
<li>Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+potential+liquid+biopsy+biomarkers+in+colorectal+Cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review.</a> BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).</li>
<li>Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+panels+for+the+reliable+quantification+of+circulating+microRNAs+by+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR.</a> FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).</li>
<li>Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+circulating+microRNA+expression+data+obtained+by+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).</li>
<li>Danese, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+miRNAs+for+colorectal+cancer%3A+Analysis+and+verification+of+current+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+reference+genes+for+qPCR+detection+of+serum+microRNAs+in+colorectal+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.</a> PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Original+TRIzol-Based+Technique+Improves+the+Extraction+of+Circulating+MicroRNA+from+Serum+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+laboratory%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples.</a> Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).</li>
<li>Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+extraction+kits+and+RT-qPCR+systems+adapted+to+high-throughput+platform+for+circulating+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs.</a> Scientific reports. 5, 9430(2015).</li>
<li>Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporting+Recommendations+for+Tumor+Marker+Prognostic+Studies+%28REMARK%29%3A+explanation+and+elaboration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration.</a> PLoS medicine. 9 (5), (2012).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+using+circulating+miRNAs+as+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+%28qRT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).</li>
<li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Processing+Conditions+Substantially+Influence+Circulating+microRNA+Biomarker+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels.</a> PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).</li>
<li>Moret, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+an+improved+protocol+for+plasma+microRNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction.</a> PloS one. 8 (12), (2013).</li>
<li>Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+noncoding+RNAs+from+human+serum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of small noncoding RNAs from human serum).</a> Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443(2014).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

miRNAs קטנות ללא קידוד RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) מסוגל מחייב 3' UTR האזור של המטרה שלהם RNA שליח, עיכוב או זה משפיל. הם ובכך ניתן לראות הרגולטורים ביטוי גנים ברמת translational. בעשור האחרון, מספר miRNAs בקורלציה עם סרטן ייזום ופיתוח, גורם אותם סמנים קליניים שימושי לאבחון, פרוגנוזה וטיפול. מוגן על ידי RNases, miRNAs נמצאים בטופס יציב בנוזלים ביולוגיים כגון דם, פלסמה, סרום, שתן ורוק, אשר הוביל עניין הולך וגובר ב התועלת שלהם פוטנציאל הקליני10.
למרות זאת, ההערכה של מחז...

CRC מייצג השלישי מרבה אובחן גידול ממאיר, הגורם הרביעי של מוות מסרטן ברחבי העולם. עד כה, bevacizumab (B), נוגדן חד שבטי נגד כלי הדם-צמיחה אנדותל (VEGF), ו ארביטוקס (C) או וקטיביקס (P), נוגדנים חד-שבטיים נגד גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR), אושרו על טיפול השורה הראשונה בשילוב עם משטרי כימותרפיה (CT).
מוטציות בגנים K-RAS ו- N-ראס הם סמנים שימושי קלינית היחיד המסוגל לזהות חולים נוטים פחות תועלת. לא אנטי-EGFR מבוססי למרות מספר מחקרים שנערכו כדי לחפש סמנים ביולוגיים שאינם חזוי של תגובה ל CT מבוסס-B, עדיין יש חוסר משמעותי של סמים יעיל ואמין לשימוש קליני1.
miRNAs הם קטנים RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) להסדיר את התרגום של היעד גנים, לשחק תפקיד מכריע בתהליכי physiopathological רבים, כולל מופרה carcinogenesis. מולקולות אלה הן מאוד יציב נוזלים ביולוגיים כגון פלזמה/סרום, שתן, ברוק, ההופכת אותם סמנים ביולוגיים חזקים לשימוש עבור דגימה לא פולשנית2. באמצעות פאנל של miRNAs מעורב מסלול האנגיוגנזה, כיוונו כדי לזהות חדש במחזור סמנים ביולוגיים מסוגל לחזות תוצאה קליניים בחולים עם גרורות CRC (mCRC) מטופלים עם משטר CT מבוסס-B.
ניתחנו את סדרת 52 mCRC חולים שטופלו CT מבוסס-B בתוך multicenter פוטנציאליים אקראי שלב III למשפט "האיטלקי משפט ב מתקדמים סרטן המעי הגס" (ITACa). בפרוטוקול הנוכחי שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comitato e Etico באזור Vasta Istituto Scientifico Romagnolo לכל הלאו סטודיו e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 674 מס) על 19th בספטמבר 2007. כל המטופלים נתנה הסכמה מדעת לפני איסוף דגימת דם. עבור כל מטופל, דגימות דם ורידי שנאספו לפני הטיפול ועל ההערכה הקלינית הראשונה (אחרי 8 שבועות) כדי להעריך את הביטוי miRNA בסיסית וויסות שלה במהלך הטיפול ביחס לתוצאה המטופל.
דרך חיפוש של הספרות, בחרנו miRNAs 21 בקורלציה עם תהליך האנגיוגנזה, אשר ידועים להיות לזיהוי בפלסמה אנושית: p יש-מיר-107, יש-מיר-126-3, p יש-מיר-145-5, p יש-מיר-194-5, יש-מיר-199a - 5p, יש-מיר - 200 ב' - 3p, יש-מיר - 20 ב' - 5p , יש-מיר-21-5 p, יש-מיר-210-3 p, יש-מיר-221-3 p, יש-מיר-24-3 p, p יש-מיר-27האוויר - 3p, יש-מיר-29b - 3p, יש-מיר-335-5, p יש-מיר-424-5, p יש-מיר-497-5, p יש-מיר - 520d - 3p, יש-מיר-92a - 3p, יש-מיר-17-5 ו p יש-מיר-155-5. בחרנו גם יש-מיר-223-3 p וטיהרו יש-מיר-484 נורמליזציה אנדוגני3,4,5,6, צ'ל-מיר-39 מ- C. elegans ספייק-in עבור נרמול אקסוגני. כל הנתונים normalizations בוצעו באמצעות שיטת ̄(ΔΔCt) 2 ̂.
הזיהוי של מחזורי miRNAs מציג קשיים טכניים כי המולקולות נמצאים ברמות נמוכות מאוד בפלסמה הגברה שלהם הוא מאתגר מבחינה כימית בהתחשב הרצף קצר שלהם. מסיבות אלה, בחרנו הליך זה מחשיב החילוץ אורגני עם פנול והן מתודולוגיה מבוססי עמודה סיבי זכוכית. במחזור miRNA החילוץ הוא נושא חם בתחום ביופסיה נוזלי, בחרנו ערכת מסחרי זה הראה לאחד ביותר מבחינת כמות ואיכות של התשואות התאושש7,8. בחרנו פרוטוקול להיפוך לתמלל miRNAs על ידי התוספת של מתאם 5' ו זנב poly(A) כדי 3' של miRNA בוגרת כדי לשפר את מידת הבררנות וספציפיות של התגובה.
בהתחשב החוסן של השיטה, אנו תוכנן לוחות מותאמים אישית עם קדם הבחינו זונדי RT-PCR להעריך כל דגימה של כפילויות, ניתח 2 חולים בתוך כל צלחת, כפי שמוצג באיור 1.

<table><tbody><tr><td>מנעול כספת ללא Rnase 1.5 מ"ל צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>מנעול כספת ללא Rnase 2 מ"ל צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.344</td><td></td></tr><tr><td>ללא Rnase 20 ומיקרו; טיפים L</td><td>Starlab</td><td>S1123-1810</td><td></td></tr><tr><td>ללא Rnase 200 ומיקרו; טיפים</td><td>L Starlab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>ללא Rnase 1,000 ומיקרו; טיפים L</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>mirVana PARIS ערכת טיהור RNA וחלבון מקומי</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan ערכת סינתזה מתקדמת של miRNA cDNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>A28007</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול אנידרוס ACS</td><td>ריאגנטים של קרלו ארבה</td><td>414605</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטו-אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4444558</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan בדיקות miRNA מתקדמות</td><td>Thermo Fisher</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>7500 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 ומיקרו; L מעבדה פיפטות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספסל מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוק</td><td></td><td></td><td></td>חימום ספסל</tr><tr><td>מכסה מנוע</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינורות</td><td></td><td></td><td></td> PCR</tr></tbody></table>

זיהוי של לוח מותאם אישית microrna במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

שם היא הגדלת ההתעניינות ביופסיה נוזלי על אבחון סרטן, פרוגנוזה טיפולית ניטור, יוצרים את הצורך של סמנים ביולוגיים אמין ושימושי עבור הקלינית. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לחלץ, הפוכה לתמלל ולהעריך את רמות הביטוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה של חולים עם סרטן המעי הגס (CRC). מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של אי קידוד RNAs של נוקלאוטידים 18-25 אורך לווסת את הביטוי של גנים היעד ברמת translational, לשחק תפקיד חשוב, כולל זו של הפונקציה pro - ו anti-אנגיוגנזה, physiopathology של איברים שונים. miRNAs יציבים ב נוזלים ביולוגיים כגון סרום, פלזמה, ההופכת אותם במחזור סמנים ביולוגיים לקבלת החלטות אבחון, פרוגנוזה וטיפול בסרטן וניטור אידיאלי. במחזור miRNA החילוץ בוצע באמצעות שיטה מהירה ויעילה הכרוכה האורגני והן מבוססי עמודה מתודולוגיות. עבור miRNA retrotranscription, השתמשנו תהליך רב שלבי ומתחשב פוליאדנילציה 3' ו את מצדו של מתאם-5' של miRNAs בוגרת, ואחריו miRNA אקראיים קדם הגברה. אנו נבחר לוח מותאם אישית 24-miRNA להיבדק ע י כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית), זיהה את הגששים miRNA על מערך לוחות מותאמים אישית. ביצענו לרביעיית-PCR צלחת פועל על מערכת ה-PCR בזמן אמת. משק miRNAs על נירמול נבחרו באמצעות תוכנת GeNorm (פס' 3.2). הנתונים נותחו באמצעות ביטוי חבילת תוכנה (v 1.1), בוצעו ניתוחים סטטיסטיים. השיטה הוכיחה להיות אמין וחזק מבחינה טכנית, יכול להיות שימושי להעריך את רמות סמן דגימות נוזלים כגון פלזמה ו/או סרום.

ניתחנו את פאנל של הקשורות אנגיוגנזה miRNAs במחזור ביחס ההישרדות ללא התקדמות המחלה (PFS), הכולל הישרדות (OS) ותגובות האובייקטיבית לדרג (אור) ב mCRC 52 חולים שטופלו עם טי מבוסס-B הערכת סמנים כזה בדגימות הפלסמה הוא מאתגר בשל קשיים טכניים. השתמשנו בשיטות הוקמה לחילוץ miRNA דגימות פלסמה החולה, שעתוק במהופך, הגברה מראש. עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, עם רק כמה שינויים נדרש, במיוחד בשלבים החילוץ, הערכנו בהצלחה כל המטרות שלנו בתוך האוכלוסייה המטופלת (איור 2).
...

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר התרגומי, כגון הקשר בין סמנים ביולוגיים במחזור לבין הפרוגנוזה של המטופל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ההזדמנות להעריך את הביטוי של פאנל של סמנים ביולוגיים במחזור עם מתודולוגיה קלה ואמינה עם כמות נמוכה של חומר קלט. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב כלפי טיפול של חולי סרטן כי זה יכול לזהות סמנים ביולוגיים במחזור שימושי בקבלת החלטות וניטור טיפול של חולים.כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה על ניתוח סמנים ביולוגיים במחזור. זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון ניתוח ביטוי סמן ביולוגי רקמות עבור אפיון מולקולרי של מחלה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו שלבי החילוץ קשה ללמוד.כדי להתחיל, להעביר 400 microliters של דגימת הפלזמה לתוך RNase חינם, שני מיליליטר צינור. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של פתרון denaturing לצינור. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של ספייק-אין ננו-מולאר אחד.לאחר ערבוב הפתרון, מוסיפים 800 מיקרוליטרים של חומצה פנול-כלורופורם. Vortex הפתרון במשך 60 שניות, צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך 15 דקות. לאחר מכן, להעביר את lysate הכלול בשלב המים העליון לצינור נקי, דואג לא להפריע interphase.למדוד את נפח השלב הממיקי התאושש, ולהוסיף 1/3 נפח של אתנול לליזט. לאחר מכן, מניחים מחסנית מסנן לתוך צינור איסוף טרי. מעבירים עד 700 מיקרוליטרים של תערובת האתנול-ליסאט למחסנית המסנן.צנטריפוגה מחסנית המסנן במשך 30 שניות ב 10, 000 פעמים כבידה. לאחר מכן, למדוד את הנפח הכולל של זרימה דרך. לאחר מכן, מוסיפים 2/3 מנפח האתנול לסינון, ומערבבים היטב.מניחים מחסנית סינון שנייה בצינור איסוף טרי. לאחר מכן, להעביר עד 700 microliters של המדגם למחסנית, וצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 30 שניות לפני השלכת הזרימה דרך. הוסף 700 מיקרוליטרים של פתרון שטיפת microRNA למחסנית המסנן, וצנטריפוג אותו עם צינור איסוף ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 15 שניות.השלך את הזרימה דרך, והחזר את מחסנית המסנן לאותו צינור. לאחר מכן, העבר את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון אלוט שחומם מראש למחסנית.צנטריפוגה מחסנית המסנן ב 10, 000 פעמים כבידה במשך 30 שניות כדי לשחזר את microRNAs. מכינים את תערובת תגובת הפוליאדנילציה לפי פרוטוקול הטקסט. מעבירים שני מיקרוליטרים של הדגימה לכל באר של צלחת תגובה.לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של קוקטייל התגובה לכל באר. מערבולת וצנטריפוגה הצלחת בקצרה כדי לסובב את התוכן. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט.מכינים את תערובת תגובת הקשירה בצינור צנטריפוגה. לאחר מכן, מוסיפים 10 microliters של הקוקטייל לכל באר של צלחת התגובה. לאחר מכן, מערבבים את התוכן של צלחת התגובה על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת.לאחר מכן, מקם את לוח התגובה במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את תגובת שעתוק הפוכה, להכין את תערובת התגובה בצינור צנטריפוגה על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר של הצלחת המכילה מוצר קשירה.מערבבים את תכולת הצלחת על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הכינו את תערובת התגובות miR-Amp, והוסיפו 45 מיקרוליטרים של התערובת לכל באר של צלחת תגובה חדשה.לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של המוצר RT לכל באר של צלחת התגובה. מערבבים את הצלחת על שייקר ב 1, 900 סל"ד במשך דקה אחת, ואחריו צנטריפוגה קצרה של הצלחת. לאחר מכן, מקם את הלוח במחזור תרמי ובצע את ההליך המתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.תחילה, לדלל כל דוגמת cDNA במאגר TE. לאחר מכן, להכין את התגובה PCR לערבב צינור צנטריפוגה. הוספת 10% מאמצעי האחסון עודף.מעבירים 19 מיקרוליטרים של תערובת התגובה לכל באר של הצלחת. לאטום את הצלחת, צנטריפוגה זה לזמן קצר. לבסוף, בצע את הפרוטוקול התרמי במערכת RT-PCR, כמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט.דילול סדרתי של שליטה ספייק-in בוצעו על מנת לבחור איזה היה הריכוז הטוב ביותר להוסיף את כל דגימות הפלזמה של סדרת מקרה מסוימת זו. הודות לפרוטוקול זה, ניתן היה להעריך את כל סמנים ביולוגיים בכל חולה, כמו גם סמן ביולוגי יחיד בסדרת המקרים הכוללת. בפרוטוקול זה, פאנל של miRNAs במחזור הקשורים אנגיוגנזה ביחס הישרדות ללא התקדמות, ההישרדות הכוללת, שיעור התגובה האובייקטיבית נותחה בחולים עם סרטן המעי הגס שטופלו במשטר כימותרפיה.השוואת רמות הביטוי של miRNA בין הערכה קלינית בסיסית הראשונה, עלייה יש-miR-155-5p נצפתה. עלייה זו הייתה משויכת ל- PFS ו- OS קצרים יותר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את השלבים באמצעות פנול-כלורופורם מתחת למכסה המנוע אדים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד וניתוח של חלבונים במחזור או RNAs קידוד על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו הערכה של פאנל ממצה יותר של סמנים ביולוגיים במחזור.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופסיה הנוזלית לחקור את הביטוי של סמנים ביולוגיים במחזור חולי סרטן. אל תשכח כי עבודה עם דם וריג'ים כימיים יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות כגון כפפות מעיל מעבדה תמיד צריך לקחת בעת ביצוע הליך זה.

detection-circulating-microrna-custom-panel-patients-with-metastatic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר מיצוי מיקרו-רנ"א במחזור הדם מדגימות פלזמה של חולי סרטן המעי הגס באמצעות מיצוי אורגני ואחריו העשרת עמודי זכוכית. miRNAs יציבים בנוזלים ביולוגיים כגון סרום ופלזמה, מה שהופך אותם לסמנים ביולוגיים אידיאליים במחזור הדם לאבחון סרטן, פרוגנוזה וקבלת החלטות טיפול וניטור. שיטה זו תסייע לזהות סמנים ביולוגיים חדשים במחזור המסוגלים לחזות תוצאות קליניות בחולים.

מיצוי miRNA במחזור: שיטה לבידוד miRNA מדגימות פלזמה באמצעות מיצוי אורגני והעשרת RNA קטנה

פרוטוקול זה מתאר את ההיתכנות לבצע פרופיל miRNA באקסוזומים, המשתחררים בפלזמה של חולי NSCLC, באמצעות ערכת בידוד אקסוזום מסחרית עם טיפולי Proteinase K ו-RNAse, על מנת למנוע זיהום miRNA במחזור ולהעריך את תכונות הסמנים הביולוגיים שלהם ב-NSCLC.

ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיתור ביטוי miRNA בדגימות חולות סרטן השד באמצעות הכלאה של miRNA באתר.

ניתוח Clinicopathological ביטוי מירנה שד רקמות סרטן על ידי שימוש מירנה<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

אנו מתארים את השימוש בפלטפורמת ביטוי גנים מרובת תפוקה גבוהה המכמתת את ביטוי הגנים על ידי ברקוד וספירת מולקולות במצעים ביולוגיים ללא צורך בהגברה. השתמשנו בפלטפורמה כדי לכמת את ביטוי המיקרו-רנ"א (miRNA) בדם מלא בנבדקים עם ובלי תסמונת המעי הרגיז.

הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט אימצה את BioMILD הקרנת ניסיון לביצוע המבדק המסווג במחזור של החתימה microRNA לגילוי מוקדם של סרטן ריאות.

MicroRNA מבוסס נוזלי ביופסיה: החוויה של miRNA פלזמה החתימה מסווג (MSC) לסינון סרטן ריאות

כדי לאפשר זיהוי רגישה מאוד של סרטן המעי הגס האנושי disseminating (CRC) תאים להמדינות רקמות, במסמך זה נראה עבור התמרה חושית יעילה של חלקיקים lentiviral חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוך תאים תא צורב PDX-derived CRC פרוטוקול לפני הזרקת שלהם לתוך עכברים הנמען, עם תצפית מיקרוסקופית סטריאו-זריחה.

רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למדו שיטה לזיהוי פאנל מותאם אישית של microRNA מחולף בחולי סרטן המעי הגס הגרורתי. טכניקה זו מאפשרת הערכת ביומרקרים מרובים בו-זמנית עם כמות קטנה של חומר התחלתי ותוצאות אמינות.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

גלה סרטונים נוספים