העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות הלימפה תאי אנדותל אוכלוסיות בתוך הכבד באמצעות סמנים המתואר. אנו מנצלים collagenase הרביעי ואת DNase לקמץ עדין של רקמות, בשילוב עם cytometry זרימה, לזהות אוכלוסייה ברורים של תאי אנדותל הלימפה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בשדות הלימפה והכבד, כגון כיצד תאים אנדותל הלימפה, או LECs, להגיב לגירויים ספציפיים וכיצד זה תורם פתוגנזה המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להעריך פנוטיפ תא אנדותל לימפתי בכבד ולתפקד על בסיס לכל תא, והוא יכול לשמש עבור יישומים במורד הזרם לאחר מיון התא. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לביולוגיה הלימפתית בכבד, זה יכול לשמש גם כדי להעריך תאים אנדותל הלימפה מרקמות שונות, כגון העור ואת בלוטת החלב.

הוכחת ההליך תהיה ג'פרי פינלון, עוזר מחקר מקצועי מהמעבדה שלי. כדי להכין השעיה חד-תאית מתאי כבד מבודדים, התחל בריסוס העכבר באתנול של שבעים אחוז, ואבטחת הכפות ללוח ניתוח. השתמש מספריים ניתוח לחתוך את העור על סנטימטר אחד מעל פי הטבעת ולהשתמש ממטרים שיניים כדי להרים את העור מן הגוף.

הכנס את קצות המספריים בין העור לצפיה ופתח את המספריים כדי להפריד את הרקמות לפני שתמשיך את חתך העור עד הצוואר. אבטחו את העור ללוח הניתוח מתחת לכל רגליים ומעל כל אחורי, ומושכים את שק ההברעה כלפי מעלה כדי להאריך את החתך לכיוון הצוואר. לתפוס את האונות של הכבד לחתוך ממש מתחת עצם החזה כדי לאפשר ניתוח סביב הכבד.

לאחר מכן העבר את האיבר לארבעה מיליליטר של מדיום EHAA של קליק. השתמש באזמל כדי לחתוך את הכבד לחתיכות בקוטר של כמילימטר ולעכל את החלקים ב500 microliters של פתרון עיכול מוכן טרי וחמש מאות microliters של DNase 1. לאחר רבע שעה ב-37 מעלות צלזיוס, יש להשתמש בצינור של 500 מיליליטר כדי לערבב את הרקמות ביסודיות ולהחזיר את המיכל לאנקובטור למשך רבע שעה נוספת.

בסוף הדגירה, להעביר את המדגם מתעכל דרך מסננת מאה מיקרון לתוך צינור חרוט חמישים מיליליטר ולהשתמש בוכנה ממזרק מיליליטר אחד כדי ללחוץ בעדינות את חתיכות הנותרות של רקמה דרך רשת. לשטוף את המסנן עם חמישה מיליליטר של חיץ בידוד בעדינות ללחוץ על כל הרקמה הנותרת דרך מסננת. לאסוף את תאי הכבד מבודדים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בארבעה מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום.

לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים בעשרה מיליליטר של חיץ בידוד לספור את התאים על hemocytometer כדי לקבוע את ספירת הכבד המלאה. להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של יודיקסנול עשרים אחוז ולכסות את ההשעיה התא עם מיליליטר אחד של PBS. להפריד את התאים על ידי הפרדת שיפוע צפיפות לקצור את השכבה בין PBS לבין יודיקסנול.

ואז לסנן את התאים דרך מסננת מיקרומטר מאה לתוך צינור חרוט חמישים מיליליטר חדש. לשטוף את התאים בעשרה מיליליטר של חיץ בידוד טרי ולהשעות מחדש את גלולה וכתוצאה מכך 500 microliters של PBS, בתוספת שני אחוזים סרום בקר עוברי, או FBS. לאחר הספירה, aliquot כ חמש פעמים עשר לתאים הלא-על-טבעיים השישי לתוך כל שליטה וגם ניסיונית של צלחת באר תשעים ושש עבור צנטריפוגה מחדש להשעות את כדורי 90 microliters של PBS בתוספת FBS לגם.

מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים הראשוני הניסיוני המתאים ושולטים בכל באר ומכתימים את כל הבארות בסמן כדאיות מתאים. הצעד החשוב ביותר בהליך זה הוא טיטרציה נכונה של הנוגדנים ושימוש בפקדי סוג קרח ובקרות פלואורסצנטיות-1 כדי לאמת את הכתמים. לאחר שלושים דקות בארבע מעלות צלזיוס, צנטריפוגה לשטוף את התאים עם מאה microliters של PBS בתוספת FBS ל הבאר ולהעביר את התאים מכל באר לתוך צינורות ציטומטריה זרימה עגולה-תחתונה בודדים חמישה מיליליטר לנפח סופי של 400 מיקרוליטר של PBS בתוספת FBS לצינור.

לאחר מכן, השתמש בנפח קטן של תאים כדי להתאים את הגדרות הלייזר והפיצוי על ציטומטר הזרימה ולקרוא את כל האירועים עבור כל צינור. כאשר כל הצינורות נקראו, לייבא את הנתונים לתוכנית ניתוח cytometry זרימה מתאימה. שער על תאים חיים המבוססים על צבע סמן הכדאיות שבו ביטוי שלילי נחשב חי.

שער על התאים החיים בהתבסס על הגודל והצפיפות של התאים, כמו גם ביטוי צבע סמן הכדאיות שלהם, ואחריו gating על CD45 שלילי CD31 אוכלוסיית תאים חיוביים באמצעות בקרת איזוטיפ מתאימה ונתונים פלואורסצנטיים-1 כדי לקבוע את האוכלוסיות החיוביות והשליליות. לאחר מכן שער CD45 שלילי CD31 תאים חיוביים על פי CD16/32 שלהם ביטוי podoplanin כדי לאפשר זיהוי של CD45 שלילי CD31 חיובי, CD16/32 שלילי podoplanin שלילי אנדותל לימפתי, ו CD45 שלילי CD31 חיובי, CD16/32 חיובי podoplanin שלילי כבד סינוסואידים אנדותל אוכלוסיות תאים אנדותל. תאי אנדותל מודגשים מבטאים כלי לימפה והיאלונון אנדותל אחד, אך לא CD146.

כבד מבודד CD31 חיובי CD16/32 תאים חיוביים מבודדים כפי שהודגם הם גם CD146 חיובי podoplanin חיובי, בעוד CD31 חיובי CD16/32 תאים שליליים הם בעיקר CD146 שלילי או podoplanin חיובי או שלילי. החיוביות נקבעה על סמך כתמי פלואורסצנטיות-1. תאי ה אנדותל הלימפה הכבד הם CD146 שלילי PDPN חיובי.

לא אנדותל כלי הדם ולא מקרופאגים כבד מורין אקספרס podoplanin. כתמים Podoplanin יכול לשמש גם כדי להבחין cholangiocytes מכלי הלימפה מבוסס על מבנים גרעיניים ברורים של צינורות המרה, כמו גם על ידי כתם cytokeratin 7. כמו רק תאים אנדותל הלימפה שיתוף להביע קולטן גורם גדילה אנדותל כלי דם 3 ו חלבון הומאובוקוז Prosperobox 1 בכבד, סמנים אלה יכולים לשמש עוד יותר כדי לאשר את הטוהר של אוכלוסיית תאי האנדרותל הלימפתיים בכבד ממוין.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות ולשמור תאים על קרח. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו מיון זרימה של אוכלוסיות LEC ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון פרופיל שעתוק של LECs. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הלימפתית הספציפית לכבד כדי לחקור כיצד הלימפה משפיעה על מחלות כבד בעכברים ובבני אדם.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי תאים אנדותל הלימפה הם נדיר, אוכלוסייה הדרגתית בכבד ואת השיטה צריכה להתבצע במהירות.