ברזולוציה גבוהה בדוגמת באמצעות התצהיר Biofilm pDawn-Ag43

פיתחנו שיטה שנקראת ליטוגרפיה ביופילם כדי להאיר אור על פני השטח, וחיידקים מצטברים היכן שהאור נמצא. שיטה זו תאפשר לנו לענות על שאלת מפתח במחקר ביופילם, למשל, כיצד מבנים מרחביים משפיעים על תפקודי הקהילה. ישנם יתרונות רבים לשיטה זו.

לדוגמה, זה עובד ברזולוציה גבוהה מאוד של 25 מיקרומטר, זה לא דורש קדם דפוס פני השטח, וגם עובד בתוך התקנים נוזליים סגורים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הקשר בין מבנה לתפקוד של ביופילמים טבעיים, ניתן ליישם אותה גם על דיסציפלינות אחרות, כגון הנדסת ביופילם, ביו-חומרים וביולוגיה סינתטית רב-תאית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית גם כאשר ישנם שלבים ראשוניים מרכזיים להכנת הגדרת התרבות האופטית ודגימה חיידקית לפני דפוס ביופילם.

ראשית, להפוך pDawn-Ag43 plasmid לתוך זן E.coli של עניין, צלחת על צלחת אגר LB בתוספת ספקטינומיצין. לחסן מושבה אחת לתוך מרק LB עם spectinomycin בצינור תרבות, ולהגדיל אותו לשלב אקספוננציאלי באינקובטור רועד ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס. לאחר החיסון, הכינו מלאי גליצרול של 25% של המתח שעבר שינוי pDawn-Ag43 על ידי ערבוב מיליליטר אחד של גליצרול סטרילי של 50% עם מיליליטר אחד של תרבות בצינור קריו.

אחסן את המלאי במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להתחיל להכין את ההתקנה האופטית על ידי הצבת מקרן נייד בתחתית אינקובטור חיידקים עם הצמצם מצביע ישירות כלפי מעלה על התקרה, שם תא תרבות biofilm יהיה מחובר. חבר מחשב נישא באמצעות כבל התצוגה למקרן שבתוך החממה.

השתמש בקלטת כדי לחבר צלחת תרבות דמה ריקה לתקרת החממה. התאימו את ההתמקדות במקרן על ידי סיבוב כפתור ההתמקדות כך שמישור המיקוד יעלה בקנה אחד עם המשטח התחתון של צלחת תרבות הביופילם המחוברת לתקרת החממה. המקרן אמור להאיר תמונה חדה ולא מטושטשת בתחתית צלחת התרבות.

הסר את צלחת תרבות הבובה לאחר ההקרנה כבר אופטימיזציה. באמצעות תוכנת מחשב נייד, לכוון את המקרן כדי להאיר את שדה התצוגה המלא עם תאורה כחולה מקסימלית על ידי הצגת שקופית כחולה מלאה. למדוד את עוצמת התאורה של המקרן באמצעות מד כוח אופטי על ידי הנחת ראש photodetector בתקרת החממה וקריאת העוצמה על מד הכוח המתאים מכויל לאורך גל קל של 460 ננומטר.

לאחר מכן, התאימו את עוצמת התאורה באמצעות מסנן צפיפות ניטרלי מתכוונן הממוקם בצמצם המקרן. סובב את המסנן כדי לכוונן את עוצמת התאורה הנמדדת על-ידי מד ההדק עד שעוצמת התאורה במרכז האזור המוקרן באור כחול קוראת 50 מיקרו-וואט לסנטימטר בריבוע. חשוב לוודא שעוצמת התאורה מוגדרת לרמה נאותה באמצעות פוטודקטור מכויל המוצב בתקרת החממה.

הדבר מאפשר כוונון מדויק של עוצמת התאורה על-ידי סיבוב מסנן הצפיפות הניטרלית. עכשיו לצייר דפוסים שרירותיים באמצעות תוכנת מקרן המצגת במחשב הנייד, ולהציג דפוסים אלה על תקרת החממה, באמצעות המקרן. לפני התאורה, פסים זן pDawn-Ag43 ממלאי גליצרול על צלחת אגר LB בתוספת מפרט.

אפשר למושבות לגדול בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס. לחסן מושבה של חיידקים pDawn-Ag43 מצלחת אגר במרק LB פלוס מפרט, ולהגדיל את התרבות לילה לשלב נייח באינקובטור רועד ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, subdilute את התרבות ביחס של אחד ל 1, 000 במרק LB עם spectinomycin.

אפשר לתרבות התת-מדולסת לגדול באינקובטור רועד בשש שעות ב-250 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס עד לשלב מאוחר של נייחות מוקדמת. חשוב לדלל לאחור את תרבות הלילה ולצמוח לשלב מעריכי מאוחר לפני התאורה. זה מבטיח את החיידקים הם בריאים באופן אמין ופעיל עם אינדוקציה.

לאחר הדגירה, תן משנה את תרבות השלבים המעריכיים המאוחרת ביחס של 1 עד 100 עם מדיית M63 שהוכנה בעבר בתוספת ספקטנומיצין של 50 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, להציג את הדילול לתוך צלחת תרבות biofilm. כשהדגימות מוכנות כעת להארה, מדביקים את צלחת התרבות לתקרת החממה, ומבטיחים שהמשטח בתחתית המנה יהיה שקוף להארה מלמטה על ידי המקרן.

לאחר הצמיחה הלי לילה של דגימות ביופילם, להסיר את צלחת התרבות מן החממה. המנה תהיה חיידקים biofilm מחובר למשטח התחתון שלה שבו הוא כבר מואר, כמו גם חיידקים פלנקטוניים מפוזרים במדיה הנוזלית לעיל. השלך את התאים פלנקטוניים על ידי הסרת התקשורת הנוזלית מן צלחת התרבות.

לאחר מכן, לשטוף את המדגם פעמיים עם PBS כדי להסיר את התאים פלנקטוני הנותרים על ידי צינור בעדינות PBS, ואחריו שאיפה. אם התאים מתויגים באופן פלואורסצנטי, תדמיין ישירות את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כפי שניתן לראות כאן, חיידקי pDawn-Ag43 שימשו לייצור ביופילמים בדוגמת צלחות באר פוליסטירן עם תאורת מקרן.

ביופילמים ניתן לדמיין באמצעות כתם סגול גביש או לחילופין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אם באמצעות חיידקים פלואורסצנטיים. דגימות ביופילם פלואורסצנטי יכול גם להיות בתמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל כדי לקבל תמונות של biofilm ב 3D. דפוס ברזולוציה גבוהה אפשרי באמצעות מסכת צילום סרט כדי לספק תאורה בדוגמת מדגם biofilm.

דוגמאות של דוגמאות מילוי על משטחי זכוכית ו- PDMS, כמו גם תאי תרבות PDMS סגורים, מוצגים כאן וממחישים את הסוגים השונים של סביבות שבהן ניתן להחיל תבניות pDawn-Ag43. בעת ניסיון הליך זה, חשוב תחילה להפוך pDawn-Ag43 לתוך המתח של עניין שלך, לאחר מכן כראוי למקד ולכייל המקרן שלך, ולבסוף בצע את התרבות הנדרשת ואת צעדי דילול גב כדי להכין את החיידקים שלך להארה. בעקבות שיטה זו, טכניקות אחרות ניתן לפרוס, למשל, ניטור biofilm לטווח ארוך בתנאי תרבות שונים.

בדרך זו, אנו יכולים להבין כיצד מבנה ביופילם משפיע על תפקודו. טכניקה זו תהיה ישימה באופן נרחב, למשל, עבור ביולוגיה סינתטית ומחקר חומרים, כדי להנדס ביופילמים כלפי יישומים שונים.