Name: משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: למד את שיטת הליתוגרפיה של בפור להנייח DNA באורך גן על משטחים לביטוי גנים ללא תאים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה רב-תכליתית למחקר בביוטכנולוגיה ובביולוגיה סינתטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית עבור פרויקט זה על-ידי Stiftung של פולקסווגן (גרנט מס 89 883) המועצה האירופית למחקר (גרנט הסכם מס ' 694410 - AEDNA). טרשת נפוצה-S. מאשר תמיכה מאת DFG דרך GRK 2062.

<ol><li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li>
<li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li>
<li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li>
<li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biology%3A+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Estévez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription%2Fexpression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li>
<li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104(2011).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+replication%2C+synthesis%2C+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
<li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes%3A+a+synthetic+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li>
<li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+prospects+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
<li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li>
<li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583(2018).</li>
<li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li>
<li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li>
<li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li>
<li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+by+directional+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+National+Academy+Of+Sciences+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li>
<li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li>
<li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nphys3469">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li>
<li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition+In+English%22%5BJournal%5D)">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li>
<li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li>
<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href=" Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

ליתוגרפיה Bephore היא טכניקה חזקה ופסיביות לאימוביליזציה עם תבנית ה-DNA או RNA. ובכל זאת, הפרוצדורה כוללת מספר שלבים אשר - אם משתנה - עשוי להיות מקור לכישלון או מופחתת הביצועים של המערכת.
שלב חיוני בייצור שבבי Bephore הוא PEGylation של המצע, אשר מספק את התאימות של פני השטח. . הנה, הצעד ניקוי עם שגרת RCA חשוב, מאז היא גם מפעילה על פני silanization הבאים. במהלך PEGylation בפועל, המצע בטח לא יתייבש. יתר על כן, Silane-פג-ביוטין מוכרחים להיות מאוחסנים כראוי כדי לשמר את התגובה שלה (סעיף 1.2) וכדי למ...

תא-ביטוי גנים תגובות הן עניין רב ליישומים שונים, ביוכימיה, ביוטכנולוגיה, ביולוגיה סינתטית חינם. תא ללא ביטוי של חלבונים היה אינסטרומנטלי עבור הכנת דגימות חלבון טהור, אשר היו בסיס מחקרים רבים בביולוגיה מבנית. למשל, מערכות ללא תא בהצלחה שימשו עבור הביטוי של חלבון מתחמי1 או קרום חלבונים2, אשר הם קשה לייצר שימוש בביטוי מבוססת-תא. ראוי לציין, התא ללא ביטוי גנים תגובות שימשו גם להבהיר את המבנה של הקוד הגנטי, החל הניסויים פורצי דרך על-ידי נירנברג Matthaei 19613.
לאחרונה, יש כבר עניין מחודש בשיטות ללא תאים, ביוטכנולוגיה, ביולוגיה סינתטית-4,-5,-6. מערכות ללא תא ניתן בתוספת עם תרכובות הלא-ביולוגיים, רכיבים מגוונים ממקור ביולוגי ניתן לשלב בקלות רבה יותר7. אף-על-פי מערכות ללא תא יש החיסרון לכאורה הם אינם "גדלים ומתחלקים", זה מתקבל על הדעת להכין ריאקטורים ללא תא פתוח עם פונקציות בסיסיות מטבולית ולתת להם לסנתז מטבוליטים כאשר מסופק עם פחמן פשוטה ואנרגיה תשומות8. בתוך השדה המתעוררים של ביולוגיה סינתטית, מערכות ללא תא מבטיחה להיות צפוי יותר "מארז" ליישום של תפקודים ביולוגיים סינתטי.
כיום, ללא תא ג'ין ביטוי תגובות מבוצעות או באמצעות תא תמציות (ממקורות שונים כגון חיידקים, שמרים, חרקים), או מערכות תרגום/תמלול אשר היו אופטימיזציה עבור יישומים שונים (למשל, prokaryotic לעומת האיקריוטים ביטוי גנים, הפקה של חלבוני ממברנה, וכו '). פרוטוקול פופולרי עבור הכנת תמצית תא החיידק (הפטרוני TXTL) סופק לאחרונה על ידי Noireaux (פ') ועמיתים9. תכונותיו biophysical מאופיין ביסודיות10, מערכת TXTL כבר שימש בהצלחה לבצע סדרה של משימות מורכבות הביוכימי: למשל, ההרכבה של bacteriophages פונקציונלי ויה תא ללא ביטוי של הגנום phage11, הסינתזה של חלבון חיידקי חוטים12או היישום של הגן ללא תא מעגלים13,14.
מערכת אחרת מבוקש ב ביולוגיה סינתטית ללא תא היא מערכת טהור, אשר הוא מחדש של רכיבי מטוהרים15,16. בהשוואה למערכת TXTL, הוא אינו מכיל nucleases או חלבון השפלה מכונות. תוך השפלה של DNA ליניארי, מולקולות RNA או חלבונים הוא פחות בעיה במערכת טהור, מסלולים עששת חשובים למעשה עבור מימוש פונקציות דינמיות. כדי להפחית את האפקט של אקסונוקלאז השפלה של ג'ין ליניארי תבניות למערכת TXTL (דרך RecBCD), החלבון GamS הגנה על קצה צריך להתווסף. גם את TXTL וגם מערכת טהור זמינים מסחרית.
נושא קשור קשר הדוק ל ביולוגיה תא ללא דאגות המחקר של ההשפעה של מידור על תגובות ביוכימיות, נוסף על הקמת מבנים דמויי-תא מלאכותיים או protocells17,18,19 ,20. מחקר על תאים מלאכותיים כוללת בדרך כלל את ומגעים מערכת התגובה הביו בתוך תאי vesicular זני פוספוליפידים או חומרים פעילי שטח אחרים. בעוד מערכות כאלה לעזור לחקור את ההיבטים הבסיסיים של מידור, או הופעתה של cellularity ומבנים המשכפלת, הם עומדים בפני בעיות טיפוסיות של מערכות סגורות: בהיעדר של מטבוליזם של תפקוד והולמים מנגנוני הובלה ממברנה, קשה לשמור על תגובות ממודר פועל במשך פרקי זמן ארוכים - מולקולות הדלק משמשים ולצבור הפסולת.
אלטרנטיבה מעניינת מידור בתוך תאים מחקה תא כזה הוא הארגון המרחבי של חומר גנטי בשיטות photolithographic. קיבעון של "גנים על שבב" היה חלוץ על ידי קבוצת בר-זיו במכון ויצמן לפני יותר מעשר שנים21. בין הנושאים העיקריים היו צריכים להיפתר היו של ספיחה שאינם ספציפיים של ה-DNA, את פוטנציאל דנטורציה של חלבונים על פני שבב. . בר-זיו ואח פיתח להתנגד פוטוליתוגרפיה ייעודי כינה "דייזי", אשר היה מורכב silane מסוף תגובתי על הנייח של מולקולות להתנגד על משטחים צורן דו-חמצני, כרווח ארוך פוליאתילן גליקול (PEG) זה מובטח הביו, headgroup photocleavable, אשר הוסב על אמין תגובתי על הקרנה עם אור אולטרה סגול (UV). הוכח כי דייזי יכול לשמש כדי לשתק גנים באורך במולקולות דנ א (באורכים של קילו מספר בסיסי-זוגות (kbp)) על משטח השבב. פולימר פיזיקה נקודת מבט, ייצג המערכות מברשות פולימר הושתל על גבי מצע מוצק. בשל אופיו polyelectrolyte של ה-DNA, שיאשר מברשות אלה מושפע בחוזקה תופעות ספציפיות יון ואחרים22,23.
והכי חשוב, זה הוכח כי הגנים המצע. מרותק למיטה עדיין מתפקד, יכולים להיות משועתקים, תרגום לתוך RNA וחלבון. ג'ין מברשות נגישים עבור ה-RNA polymerases מ פתרון24, לא שפגע בסימני את התערובת macromolecular תרגום/תמלול על פני השטח. אחד היתרונות של קיבעון של רכיבים גנטיים על מצע הוא כי הם יכול להיות מופעל בכל מערכת הכור microfluidic פתוח ברציפות המסופק עם מולקולות קטנות קודמן ומן אילו מוצרים פסולת יכול להיות שהוסרו25 , 26.
לאחרונה פיתחנו וריאציה של שיטה זו כינה Bephore (עבור קרינה מסתיימים ו photoresist)27, אשר היה מבוסס באופן בלעדי על רכיבים זמינים מסחרית, מנוצל ספציפיים רצף DNA סטרנד הפלישה תגובות עבור מימוש הליך ליתוגרפיה שקודמים פשוטה כדי ליישם את הקמת מבוססי שבב תאים מלאכותיים. מבט סכמטי של התהליך מוצג באיור1. הוא מבוסס על מולקולות דנ א סיכת ראש המכיל קבוצת photocleavable, אשר נמצאים ותשמרו על שכבה פג מסתיימים. Photocleavage של הסיכה חושף רצף מקום אחיזה לרגל חד-גדילי, דרך איזה DNA מולקולות עניין (המכיל את רצף דיס "והותירו") יכול להיות המחוברים באמצעות גדיל בתיווך מקום אחיזה לרגל הפלישה.
בעוד Bephore הוא שעשוי להיות פשוט ליישם, דייזי מאפשר את מימוש מאוד צפוף ונקי "ג'ין מברשות", אשר יש יתרונות ביישומים מסוימים. עקרונית, עם זאת, ליתוגרפיה Bephore ודייזי יכולים לשלב בקלות. שיטת ליתוגרפיה קשורים ניצול DNA הזחה סטרנד להבניית DNA מברשות על זהב קודם לכן פותחה על ידי הואנג. et al., אך היה מנוצל לא בהקשר של הגן ללא תא ביטוי28,29.
בפרוטוקול הבא אנו מספקים שתיאור מפורט של הייצור של ה-DNA מברשות על ביטוי גנים תא ללא שימוש בשיטת Bephore. אנו מתארים כיצד האסימונים ג'ין מיוצרים, מדגימים את השימוש רב שלבי פוטוליתוגרפיה לאימוביליזציה במרחב מובנית של גנים על שבב. נדון גם הזיוף של תגובת תאי והיישום של מיקרופלואידיקה להופעה של ג'ין על שבב ביטוי תגובות.

<table><tbody><tr><td>פרוסת סיליקון עם 50 ננומטר צורן דו-חמצני (מצע Bephore)</td> עובי <td>פרוסת</td><td></td> סיגרט <td>(ומיקרו; m): 525 &plusmn; 25, קוטר (מ"מ): 100</td></tr><tr><td>פרוסת סיליקון (לתבנית מאסטר PDMS)</td> עובי <td>רקיק</td><td></td> Siegert <td>(ומיקרו; m): 525 &plusmn; 25, קוטר (מ"מ): 76.2 (3 אינץ')</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית מס' 4</td><td>מנזל</td><td></td><td>22 מ"מ x 50 מ"מ</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית מס' 1.5</td><td>מסייע</td><td></td><td>24 מ"מ x 24 מ"מ</td></tr><tr><td>ביוטין-PEG-סילאן</td><td>לייסן ביו</td><td></td><td>MW 5,000</td></tr><tr><td>טולואן נטול מים</td><td>סיגמא אולדריץ' (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות ( IDT)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>תערובת מאסטר PCR בנאמנות גבוהה עם מאגר HF</td> ניו <td>אינגלנד Biolabs</td><td>M0531S</td><td>ערכת PCR</td></tr><tr><td>אשף SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>ערכת ניקוי PCR עמודה ספין</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E6800S</td><td>מערכת ביטוי ללא תאים</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PTFE (ID: 0.8 מ"מ, OD: 1.6 מ"מ)</td> <td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>מיקרו התנגדות טכנולוגיה&nbsp; GmbH</td><td></td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>מיקרו התנגדות טכנולוגיה&nbsp; מפתח GmbH</td><td></td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>מקדם הידבקות</td><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td></tr> דבק <tr><td>סיליקון דו-רכיבי</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>רדיד צהוב להגנה מפני UV</td><td>Lithoprotect (באמצעות MicroChemicals)</td> <td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסכות לפוטוליתוגרפיה</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>אולימפוס</td><td>BX51</td><td>פוטוליתוגרפיה והדמיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>60x מטרת טבילה במים</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>בשימוש עם Olympus BX51, NA 0.9</td></tr><tr><td>20x מטרת טבילה במים</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>בשימוש עם Olympus BX51, NA 0.5</td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>פוטומטרית</td><td>Coolsnap HQ</td><td>בשימוש עם Olympus BX51</td></tr><tr><td>מקור Ligtht</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>בשימוש עם</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>פלואורסצנטי הדמיה של ביטוי גנים</td></tr><tr><td>4x אובייקטיבי</td><td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda</td><td>בשימוש עם מצלמת Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>בשימוש עם מקור אור Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td><td>בשימוש עם חממת כלוב Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>קו מודגש</td><td>Okolab</td><td>בשימוש עם בקר לחץ Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Elveflow</td><td></td><td>OB1 MK3</td><td></td></tr><tr><td>ננו-פוטומטר</td><td>אימפלן</td><td></td><td>מדידת ריכוז DNA</td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W, מופעל ב-0.8 mbar עם הדגימה בכלוב פאראדיי</td></tr></tbody></table>

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

קיבעון של גנים על משטחים lithographically מובנה מאפשר המחקר של ג'ין ממודר ביטוי תהליכים במערכת ביוריאקטור microfluidic פתוח. בניגוד גישות אחרות כלפי מערכות סלולריות מלאכותי, כזו מלכודת מאפשר אספקה רציפה עם ריאגנטים ביטוי גנים וניקוז סימולטני של חומרי פסולת. זה מקל על ביצוע תהליכי ביטוי הגן ללא תא במשך תקופות זמן, וזה חשוב עבור מימוש מערכות משוב רגולטוריות ג'ין דינמי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט הזיוף של biochips גנטי בטכניקה פשוטה לשימוש ליטוגרפית בהתבסס על DNA סטרנד תגובות הדחק, המשתמשת אך ורק רכיבים זמינים מסחרית. אנו מספקים גם פרוטוקול על האינטגרציה של גנים ממודר polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic מערכת מבוססת. יתר על כן, אנו מראים כי המערכת הוא תואם עם מיקרוסקופ גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF), אשר יכול לשמש בהתבוננות ישירה של אינטראקציות מולקולרי בין DNA מולקולות הכלול המיקס ביטוי.

ליתוגרפיה בשני שלבים: איור 5 מראה התוצאה של תהליך בן שני שלבים ליטוגרפיה על משטח זכוכית עם דפוסים של גדילי דיס fluorescently שכותרתו חופפים.
הביטוי של חלבון פלואורסצנטי של מברשת ג'ין: איור 6 מדגים את הביטוי של החלבון הניאון YPet מ- DNA קיבוע. במספר נקודות זמן שאנחנו לאומדן הקצב ביטוי גנים חלקית הלבנת החלבון הניאון והתבוננות ההתאוששות של האות פלורסצנטיות, התעלמות התאוששו...

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

שבבי DNA הם פלטפורמת מחקר אטרקטיבית לביולוגיה סינתטית עצמית, שפותחה במקור על ידי קבוצת BASF, המאפשרת תפעול מעגלי גנים במבחנה לאורך פרקי זמן ממושכים. עם פרוטוקול זה, אנו מקווים להפוך את הטכנולוגיה הזו לזמינה למגוון רחב יותר של חוקרים. השיטה שלנו, הנדונה ליתוגרפיה של בפור, מייצגת אסטרטגיה לשתק את הדנ"א בהתבסס על תגובת עקירת גדילי הדנ"א.עוצמתה של טכניקה זו טמונית ביכולות הליתוגרפיות הרב-שלבית שלה, בשחזור הפשוט שלה ובזמינות המסחרית של כל הרכיבים. בדומה לפתרונות ביו-שבב אחרים, ניתן לשלב את bephore עם טכנולוגיות שונות. לדוגמה, מברשות גנים פונקציונליות ניתן להרכיב בתוך מיקרו תאים לביטוי חלבון.כדי להתחיל, להכין תערובת RCA על ידי ערבוב מים חמישה חלקים עם חלק אחד של תותב אמוניה 30% ב זכוכית. מחממים את התערובת ל-70 מעלות צלזיוס על צלחת חמה תוך כדי ערבוב. ברגע שהוא מגיע 70 מעלות צלזיוס, להוסיף חלק אחד 30% מי חמצן.לאחר מכן מניחים רקיק סיליקון בקוטר 100 מ"מ לתוך הפתרון, כדי להסיר ממנו חומר אורגני וחלקיקים. לאחר 30 דקות, מוציאים את המצע, שוטפים אותו ביסודיות במים מבקבוק כביסה, ומייבשים אותו באקדח חנקן. מיד להמשיך עם PEGylation של המצע.כדי להשיג זאת, תחילה לדלל ביוטין-PEG-Silane בטולואן יבש ל 5 מיליגרם למיליליטר, ומערבולת הפתרון עד שהוא מעורבב היטב. עם המצע ממוקם צלחת פטרי זכוכית, לאט pipette הפתרון על המצע, מכסה את כל פני השטח, אבל להימנע לאפשר את הפתרון לזרום מעבר לקצה. לאחר המשטח מכוסה, לסגור את צלחת פטרי, ולאחר מכן להוסיף כיסוי נוסף.לאחר 30 דקות, להסיר את הכיסוי, ולהוסיף כ 40 מיליליטר של אלכוהול isopropyl לצלחת פטרי. ואז להוציא את המצע, לשטוף אותו שוב ביסודיות עם אלכוהול isopropyl, ולייבש אותו עם אקדח חנקן. כאשר יבש, לאחסן את המצע בחושך עד שהוא נחוץ.הכן מצע באמצעות חותך זכוכית או אזמל כדי ליצור סנטימטר אחד על ידי חתיכות סנטימטר אחד. לאחר מכן, הוסף סימון יישור פשוט על-ידי יצירת שריטה קצרה מהמרכז לכיוון קצה המצע. לפוצץ את כל החלקיקים הקטנים את השבב באמצעות אקדח חנקן.לאחר מכן, מערבבים שתי טיפות של דבק סיליקון דו-רכיבי, ומחילים את הדבק על פני השטח של השבב, ומשאירים את האזור סביב קצה השריטה ריק. שם הדבק מספק מחסום הידרופובי, שמירה על פתרונות מים על השבב. זה מקל על צעדי הכביסה הבאים, ומפחית את כמות ה-DNA הנדרשת עבור דגירה.בשלב מאוחר יותר, הדבק ניתן לקלף בקלות. בשלבים הבאים, DNA photocleavable מטופל רק בסביבת אור צהוב. מכסים את השבב בכ-10 מיקרוליטרים של תערובת בפור בטמפרטורת החדר, ומציבים את השבב בקופסה מלאה חלקית במים כדי להפחית את האידוי.לאחר שעה אחת, לשטוף את השבב מספר פעמים עם PBS כדי להסיר כל תערובת bephore מאוגד. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של תערובת פסיבציה לשבב. לאחר שעתיים, לשטוף את השבב מספר פעמים עם PBS כדי להסיר את סוכני פסיבציה מאוגדת.חותכים מסכת צילום מודפסת לגודל המתאים כדי להתאים למחזיק מסכה מתאים. הוסף אותו במיקום עצירת השדה ולהשתמש ב סימוני היישור כדי ליישר את המסיכה במחזיק. כאשר המצע ממוקם על שלב המיקרוסקופיה, הכנס מסנן אדום לנתיב התאורה והתמקד על משטח המצע.לאחר מכן, נווט אל אזור המצע אשר ייחשף. לאחר מכן, הכנס את מחזיק המסיכה, חסום את התאורה ושנה למסנן UV. בעוצמת אור נמוכה, פתח את התריס ולהשתמש במצלמה כדי למקד במהירות את המסכה על המצע.כאשר המצע מיושר כעת והמסכה ממוקדת, חסום את נתיב האור למצלמה והאיר את המצע בעוצמת אור גבוהה לזמן החשיפה הרצוי. לאחר החשיפה, הסר את הדגימה מהמיקרוסקופ, והסר בזהירות מאגר רב ככל האפשר מהמצע מבלי לייבש אותו. לאחר מכן, להוסיף 10 עד 20 microliters של DNA עם הרצף עבור חיבור על פני השטח.מניחים את המצע בקופסה רטובה כדי למנוע ממנו להתייבש, ודגירה את ה-DNA על המצע במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. על מנת להתבונן בביטוי הגן המודר במיקרוסקופ הפוך, הכינו תחילה בנפרד את שני החלקים של מחזיק הדגימה. התחל על ידי הדבקת שבב bephore עם מברשת גנים משותקת על מחזיק השבב, באמצעות סרט דבק דו צדדי.לאחר מכן, הוסיפו קצת שומן ואקום סביב החור המרכזי של החלק התחתון של המחזיק, והכניסו את מחזיק השבב. עכשיו להרכיב את החלק העליון של המחזיק. חותכים שבב PDMS דק עם תאים קטנים ככל האפשר, משאיר ערוץ פתוח לצד אחד מאוחר יותר לאפשר חילופי פסולת ומולקולות מבשר על ידי דיפוזיה הבא, פלזמה לטפל להחליק כיסוי זכוכית בצד האחורי של שבב PDMS עם פלזמת חמצן.מיד לאחר הטיפול, מניחים את שבב PDMS במרכז מגלשת הזכוכית, כאשר התאים מצביעים כלפי מעלה. לאחר מכן, אופים את ה עם PDMS במשך שעה אחת ב 70 מעלות צלזיוס. זמן קצר לפני הרכבת מחזיק הדגימה כולו, פלזמה לטפל במגלשת הזכוכית עם שבב PDMS כמו קודם.לאחר מכן, הוסיפו קצת שומן ואקום סביב החור הגדול של המחזיק העליון, והצבו עליו את מגלשת הזכוכית עם ה-PDMS. לוחצים בעדינות את הזכוכית על השומן. בזהירות להסיר את המאגר מהשבב, ולשטוף אותו פעם אחת עם 10 microliters של מערכת ביטוי עצמי.לאחר מכן, הוסיפו 60 מיקרוליטרים של מערכת ביטוי עצמי לשבב, והסירו את דבק הסיליקון הדו-רכיבי מהקצוות. עכשיו, להוסיף 20 microliters של מערכת הביטוי על PDMS. לאחר הנחת טיפה על PDMS, לבדוק במהירות את המיקרוסקופ סטריאוסקופי כי התאים רטובים היטב וללא בועות אוויר.אם יש בועות אוויר, לנסות לשטוף אותם משם. כדי להרכיב את שתי החלקים של המחזיק, וליישר תאים ומברשות DNA, לעבוד תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. שתק את המחזיק התחתון בזרוע אחיזה כך ששני הברגים וגני הכנפיים יהיו נגישים בקלות בשתי הידיים.הכנס את המחזיק העליון למחזיק התחתון והורד אותו עד ששחררות מערכת הביטוי ללא תאים יתמזגו. לאחר מכן, ודאו שהתאים וסימן היישור נמצאים באזור דומה במישור XY. מלמטה, לדפוק את כנף עד שהם נוגעים בצד התחתון של המחזיק.תוך יישור התאים ואת השבב במישור XY, הדק בעדינות את כנפי הכנף. שלב זה דורש ניסיון מסוים, ותלוי בבניית בעל הדגימה. יש ללחוץ על ה-PDMS על השבב רק בכוח עדין.לאחר מכן, לרסס ספוג במארז נגד אידוי עם מים, ולהכניס את המחזיק לתוך התיבה. לאחר מכן, מלא מזרק חמישה מיליליטר עם דבק סיליקון שני רכיבים, ולהשתמש בו כדי לאטום את התיבה. לבסוף, מעבירים את התיבה למיקרוסקופ מבוקר טמפרטורה, ומדמים את מברשת הדנ"א ואת התגובה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.תהליך ליתוגרפי בן שני שלבים, המבוצע כאן על מגלשת זכוכית בפור, מניב דפוסים חופפים של גדילי דנ"א המסומנים באופן פלואורסצנטי. בהדגמה זו של ביטוי גנים על שבב, DNA משותק בתא בצד השמאל. כאשר נחשפים לתערובת הביטוי, חלבון הפלואורסצנט הצהוב YPet מסונתז מהדנ"א משותק.כדי להעריך את הפעילות של מערכת ביטוי הגנים, התאוששות הפלואורסצנטיות נצפית לאחר שלב הלבנה. במשך שעתיים, עוצמת הפלואורסצנטיות התאוששה במהירות. עם זאת, לאחר ארבע ושש שעות, זה לא התאושש, המציין כי ללא אספקה טרייה של תערובת הביטוי, התגובה הסתיימה סביב שעה ארבע.למרות ביטוי גנים מוגבל במערכת סגורה, זה יכול להתקיים על פני פרקי זמן ארוכים יותר על ידי אספקת תאי הביטוי עם מולקולות מבשר נוספות באמצעות מיקרו נוזלים. שיטת bephore משמשת לשתק אוליגונוקלאוטידים או DNA באורך גנים, אשר ניתן ליישם כדי לבנות מערכות של מברשות DNA אינטראקציה לביטוי גנים מחדש עצמית. הטכניקה עשויה לשמש גם עבור יישומים אחרים בביופיזיקה, כגון מחקרי פלואורסצנטיות מולקולה אחת.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לפברק ביוצ'ים bephore מן ופלים או שקופיות זכוכית, ולשלב אותם בפרויקטים המחקר שלך.

functional-surface-immobilization-genes-using-multistep-strand

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

במאמר זה אנו מתארים כיצד נקבל סריג עקבות של מולקולות דנ"א בודדות משותקת על משטח באמצעות מיקרוסקופ סריקה אוטומטית confocal.

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

אנו מציגים גישת microfluidic לביטוי של מערכי חלבון. המכשיר מורכב מאלף תאי תגובה הנשלטים על ידי מייקרו שסתומים מכאניים. מכשיר microfluidic הוא הזדווגו לספריית גן microarray-מודפסת. גנים אלו אז מתועתקים ומתורגמים על שבב, וכתוצאה מכך מערך חלבון מוכן לשימוש ניסיוני.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

טכנולוגיית הדפסה מיקרופלואידית תלת מימדית זו מדפיסה מערכי תאים על משטחים שקועים.  אנו מתארים כיצד מערכי תאים מועברים באופן מיקרופלואידי, בתאי זרימה תלת מימדיים על משטחים שקועים.  על ידי הדפסה על משטחים שקועים, יוצרו מיקרו-מערכי תאים המאפשרים סינון תרופות והערכת ציטוטוקסיות במספר רב של תחומים.

הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה

מחקרים אלה מדווחים על הצמדה הפיכה של וקטורים של גנים אדנו-ויראלים למשטחי מתכת חסרי ציפוי של סטנטים ודיסקי רשת מודל. שחרור ממושך של חלקיקים נגיפיים בעלי יכולת התמרה המותנה בהידרוליזה של קישורים צולבים המשמשים לקיבוע וקטור מביא לביטוי טרנסגן עמיד ספציפי לאתר בתאי כלי דם ובעורקים סטנטים.

העברת כלי דם ג&#39;ין ממתכת סטנט משטחים באמצעות adenoviral וקטורי Tethered דרך Hydrolysable חוצה linkers

למצעי תרבית תאים המתפקדים עם דפוסים בקנה מידה מיקרו של ליגנדים ביולוגיים יש תועלת עצומה בתחום הנדסת הרקמות. כאן, אנו מדגימים את הייצור הרב-תכליתי והאוטומטי של מצעי תרבית רקמות עם מברשות פולי (אתילן גליקול) מרובות ומיקרו-דפוסיות המציגות כימיה אורתוגונלית המאפשרת קיבוע מדויק מרחבית וספציפי לאתר של ליגנדים ביולוגיים.

בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיית הדפסה ביולוגית באמצעות מערכת הפקדה רובוטית אוטומטית המשלבת רמזי הנחיה טופוגרפיים חרוטים עם תצהיר מדויק של תא הנושא דיו הידרוג'ל. התאים המודפסים מועברים ישירות לתכונות החרוטות ומסוגלים לחוש ולהתמצא איתם.

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

תהליך הייצור של מכשיר מבוסס PDMS, רב שכבתי, microfluidic המאפשר שעתוק ותרגום מבחנה (IVTT) התגובות להתבצע על פני תקופות ממושכות מתוארת. יתרה מזאת, סקירה מקיפה של החומרה והתוכנה הדרושה להפיכת תגובות אלה לאוטומטיות ולשמירה על המשך ממושך מסופקת.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

ליגתאי מטריקס ניתן להיות בתבנית על הידרואקרילאמיד הידרו כדי לאפשר את התרבות של תאים גזע האדם העובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ביוכימיה ביוכימית לבחון את הגומלין בין הגיאומטריה רקמה, כוחות שנוצר התא, ואת מפרט הגורל.

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

פרוטוקול זה מציג שיטת המיקרו-ליתוגרפיה ללא הגבלה, פשוטה ונגישה לבעלי רקע ביוהנדסי מוגבל. שיטה זו משתמשת בסטנסילים מותאמים אישית לחתוך לייזר כדי מיקרו מטריצות חלבונים מטריצה בצורה של עניין עבור מודלדירוג תאים מורפולוגיות. ההליך עבור מיקרופנינג הוא הפגין באמצעות מושרה המושרה תא גזע המופק הקרדיוציטים.

פשוט ליתוגרפיה-ללא מיקרוהדפס תא יחיד באמצעות סטנסילים לייזר לחתוך

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתאים זעירים ברזולוציה של תא בודד באמצעות הידבקות מתוכנתת DNA. פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת פוטוליטוגרפיה על הספסל כדי ליצור דפוסים של אוליגונוקלאוטידים DNA על שקופית זכוכית ולאחר מכן תוויות קרום התא עם אוליגונוקלאוטידים משלימים זמינים מסחרית. הכלאה של אוליגוס גורמת הידבקות תאים מתוכנתים.

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

למד את שיטת הליתוגרפיה של בפור להנייח DNA באורך גן על משטחים לביטוי גנים ללא תאים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה רב-תכליתית למחקר בביוטכנולוגיה ובביולוגיה סינתטית.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

גלה סרטונים נוספים