בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

שיטה זו יכולה לעזור לשפר את קנה המידה הגדול ואת אפיון ברזולוציה גבוהה של חלבון isoforms ושינויים חלבון שלאחר תרגום בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזה אזור נימי מציע הפרדה יעילה מאוד וזיהוי רגיש מאוד של חלבונים שלמים. כדי לטפל מראש נימי, לייבש אותו עם גז חנקן ב 10 psi לפחות 12 שעות.

לאחר מכן, מלא את נימי עם 50% נפח אחר נפח 3-propyl מתאקרילאט במתנול באמצעות משאבת מזרק. לאטום את שני הקצוות של נימי עם גומי סיליקה. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות לפחות, ממשיכים עם ציפוי פוליאקרילמיד ליניארי על הקיר הפנימי של נימי ההפרדה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לשרוף חלק נימי באמצעות להבה עדינה כדי להסיר את הציפוי החיצוני פוליאמיד סביב ארבעה סנטימטרים מקצה אחד של נימי. לנקות בעדינות את החלק השרוף של נימי על ידי ניגוב כדי להסיר את ציפוי פוליאמיד לחלוטין. לקדוח חור קטן בסוף צינור 200 microliter סביב אותו גודל כמו הקוטר החיצוני נימי מספיק להחזיק את נימי במקום ברגע שהוא מושחל דרך החור הזה.

משחילים את קצה נימי הקרוב לחלק השרוף דרך החור עד שהחלק השרוף נמצא בצינור. לאחר מכן, להוסיף כ 150 microliters של HF לצינור 200 microliter כך פתרון HF הוא בערך באמצע הדרך במעלה החלק השרוף על נימי. הדגירה נימי בתספורת HF בטמפרטורת החדר במשך 90 עד 100 דקות.

הכינו את תערובת החלבון הסטנדרטית ואת דגימת ה-E.coli כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להגדיר את אלקטרופורזה של אזור נימי, או מערכת CZE, לטעון את המדגם, אלקטרוליט הרקע, ואת נימי ההפרדה לתוך מדגם אוטומטי CZE. בחר עומס לדוגמה בעמוד הבקרה הידני של הדוגמה האוטומטית של CZE.

טען את בקבוקון האלקטרוליטים ברקע למגש המאגר של הדוגם האוטומטי, וצוין את מיקומו במגש המאגר. לאחר מכן, טען את בקבוקון הדגימה לתוך מגש הדגימה של הדוגם האוטומטי, ונומקם במיקום שלו במגש לדוגמה. מקם את הדוגמן האוטומטי במיקום היישור באמצעות בקרה ידנית.

עכשיו, לטעון את נימי ההפרדה לתוך מדגם אוטומטי CZE באמצעות הקצה הלא חרוט של נימי. התאימו את גובה קצה ההזרקה של נימי אם נפח הדגימה נמוך מ-50 מיקרוליטר. העבר את הדוגמן האוטומטי למצב המתנה באמצעות בקרה ידנית.

הקלד את מיקום הדגימה במערכת והזז את נימי לדגימה. לדחוף את קצה ההזרקה של נימי עוד יותר למטה כדי להגיע לתחתית הבקבוקון מדגם. ממשיך להשתמש בשליטה ידנית, לשטוף את נימי עם אלקטרוליט הרקע במשך 20 דקות באמצעות לחץ של 20 psi.

עכשיו, תארגן ממשק זרימת נדן מסחרי שאוב אלקטרוקינטית לחזית ספקטרומטר המסה. מלאו את מאגר מאגר הנדן במאגר המכיל מתנול בנפח נפח של 10% וחומצה פורמית בנפח נפח של 0.2% במים ברמה LCMS. לשטוף את T בממשק עם מאגר נדן באמצעות הפעלת לחץ באופן ידני עם מזרק.

משחילים את הקצה החיצוני המילימטר אחד של פולט אלקטרוספריי דרך צינורות שרוול ולחבר את המקרן עם יציאה אחת של T באמצעות הולם. כל שעליך לעשות הוא לשטוף את T באופן ידני שוב עם מזרק כדי למלא את המקרן עם מאגר נדן. התאימו את המרחק בין פתח המקרן לבין הכניסה של ספקטרומטר המסה לכ-2 מילימטרים בעזרת המצלמה שהגיעה עם הממשק.

החל מתח 2 עד 2.2 קילו-וולט בבקבוקון חיץ הנודנים עבור אלקטרוספריי. לאחר מכן, כוונן את מתח הריסוס כדי להגיע לאלקטרוספריי יציב. החל לחץ נמוך בקצה ההזרקה של נימי במהלך תהליך זה כדי לוודא שאין בועות נימי.

מכבים את מתח הריסוס ומשחילים בעדינות את הקצה החרוט של נימי ההפרדה דרך ה- T לתוך המקרן עד שלא ניתן לדחוף אותו עוד יותר. לאחר עצירת הלחץ הנמוך בקצה ההזרקה של נימי, לשטוף את המקרן קצת עם חיץ נדן. שוב, להחיל שניים עד 2.2 קילו-וולט של מתח ספריי כדי לבדוק את התרסיס.

בחר שיטה חדשה תחת התפריט הנפתח של הקובץ במסך הכלי הראשי. שם, בחר inlet כמו בקבוקון מדגם מתחיל, סיום בקבוקון מדגם, מגש כמו מדגם, לחץ כמו חמישה psi, kilovolts כאפס, ומשך כמו 95 שניות עבור הזרקת מדגם. לאחר מכן, הגדר את המפץ כ- inlet vial, מגש כחוצץ, לחץ כאפס psi, קילו-וולטים כ- 30 ומשך זמן של 4, 200 שניות להפרדת דגימת תערובת החלבון הסטנדרטית.

להפרדת דגימת הפרוטום E.coli, הגדר את המפץ כ- inlet vial, מגש כחוצץ, לחץ כאפס psi, קילו-וולטים כ- 20 ומשך זמן של 6, 600 שניות. לבסוף, בחר inlet כמו סיגלית inlet, מגש כמו חיץ, לחץ כמו 10 psi, קילו-וולטים כמו 30, ומשך כמו 600 שניות עבור שטיפה נימי. עכשיו, להגדיר את הפרמטרים MS ו MS / MS לניתוח חלבון שלם באמצעות ספקטרומטר מסכת מלכודת יון מרובע.

כדי לכוונן את הגדרות קובץ הכוונון, הפעל מצב חלבון שלם ולהשתמש בלחץ השמנה של 0.2. הגדר את טמפרטורת נימי העברת היון ל 320 מעלות צלזיוס ואת רמת RF עדשת S ל 55. כדי לבצע את ניסוי CZE MS/MS, הפעל את שיטת איסוף הנתונים במחשב ספקטרומטר המסה, תחילה על-ידי בחירת רצף ריצה.

לאחר מכן, התחל את רצף האלקטרופורזה נימי במחשב אלקטרופורזה נימי מדגם אוטומטי. בצע חיפוש במסד נתונים עם TopPIC בחבילת TopPIC ובממשק המשתמש הגרפי TopPIC. לחץ על קובץ מסד הנתונים ובחר מסד נתונים מתאים לחיפוש.

לחץ על קובץ ספקטרום ובחר את ms2 שנוצר. msalign קובץ שנוצר כקלט. בחר את קובץ התכונות של MS1 ובחר את קובץ התכונות שנוצר.

הגדר ציסטאין קרבמידומטיל C57 כשינוי קבוע עקב טיפול iodoacetamide. בחר את תכונת מסד הנתונים של הפיתיון ותחת הגדרות ניתוק, בחר קצב גילוי כוזב בתפריט הנפתח לצד רמת הספקטרום. הגדר את קצב הגילוי הכוזב ל- 0.01 ברמת הספקטרום.

השאר את פונקציית יצירת הפונקציה לא מסומנת והגדר את עמידות השגיאה ל- 15 חלקים למיליון. הגדר את שיעור הגילוי הכוזב ל- 0.05 ברמת הפרוטופורם. תחת פרמטרים מתקדמים, בחר שתיים עבור המספר המרבי של משמרות מסה בתפריט הנפתח.

הגדר את התזוזה ההמונית המרבית של שינויים לא ידועים ל- 500 דלתונים. השאר את כל הפרמטרים האחרים בערכי ברירת המחדל שלהם ולחץ על לחצן התחל בפינה השמאלית התחתונה של ממשק המשתמש הגרפי. האלקטרופרוגרמה הייצוגית לתערובת החלבון הסטנדרטית מוצגת.

תערובת החלבון הסטנדרטית מופעלת בדרך כלל לפחות בשכפול כדי להעריך את יעילות ההפרדה ואת יכולת הרבייה של המערכת. ניתן להעריך את יעילות ההפרדה עם מספר הלוחות התיאורטיים של חלבונים מסוימים. ניתן להעריך את הרבייה על ידי סטיות התקן היחסיות של עוצמת החלבון וזמן הנדידה.

פלטפורמת MS/MS של CZE יכולה לשמש לאפיון בקנה מידה גדול של פרוטאופורמים בפרוטומות מורכבות שונות, זיהוי מעל 500 פרוטאופורמים ו-190 חלבונים מ- E.coli proteome בהפעלה אחת בביטחון גבוה. כאן, תצוגה מוגדלת של האלקטרופרוגרמה יכולה לשמש להערכת חלון ההפרדה של המערכת. ערך E נמוך מאוד רוזוולט ספקטרלי מציע את הביטחון הגבוה של ID.The מספר גבוה של היונים שבר תואם עוד יותר מציין את הביטחון הגבוה של ID.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשחיל את נימי ההפרדה חרוט לתוך פולט electrospray לאט ובעדינות.

תיוג איזוטופ יציב או שיטות ללא תווית ניתן לשלב לתוך הליך MS CZE כדי לקבוע כיצד שפע proteoform משתנה בתאים על פני תנאים שונים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטומיקה מלמעלה למטה לחקור את תפקידם של פרוטאופורמים בוויסות תהליכים ביולוגיים שונים בתאים. אל תשכח כי עבודה עם חומצה הידרופלואורית יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי תקין שיש נהלי חירום במקום תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.