DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום biopesticide, כגון כיצד גדיל כפול RNA ההשפעה של ביטוי גנים, ו fecundity בדיפטרנים מבוגרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מינונים הניתנים לכימות של RNA גדיל כפול מועברים יתוש או זבוב, וכתוצאה מכך משפיע על קטלניות רב דורית אז ניתן להעריך. למרות שיטה זו מוצגת עבור יתוש, aedes aegypti, ואת זבוב הבית, musca domestica, זה יכול להיות מיושם גם על מינים אחרים של יתושים וזבובים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי מאסטרינג הליך ההזרקה עצמו היא השקעה בזמן. הזרקת כל חרק עם גודל קצה המחט האופטימלי היא קריטית כדי להבטיח את הלידה תוך מזעור פציעה ותמותה. כדי להתחיל, להשתמש בממטרים כדי לביים בזהירות יתושים כך שהם נחשפים בסופו של דבר על שקופית מיקרוסקופ כחצי סנטימטר זה מזה.

כדי לסייע בטיפול בשקופיות, השאר רווח של סנטימטר וחצי בקצה השמאלי או הימני של השקופית. ואז למקם את השקופית של חרקים מבוימים בארבע מעלות צלזיוס בצלחת פטרי גדולה. הגדר מיקרוסקופ ניתוח microinjector מעל שולחן צמרמורת.

לאחר משיכת נימי זכוכית לקצה דק, מניחים את מחט נימי לתוך microinjector ולשבור את קצה המחט עם מלקחיים. ואז לשטוף את המחט על ידי ציור וגירוש מים חופשיים גרעין שלוש פעמים. שים לב כי גדלי פתיחת מחט זכוכית משתנים בין יתושים זבובים בבית.

לאחר מכן, להכין פתרון הזרקה עם ריכוז מתאים עבור יתושים. הוסף שלושה מיקרוגרם למיליליטר של רודמין B לפתרון כדי לסייע בהדמיה. השתמש פיפטה להעביר שלושה עד ארבעה microliters של פתרון למשטח נקי, ולמשוך אותו לתוך מחט זכוכית מבלי לקחת אוויר.

לדכא את כפתור ההזרקה שוב ושוב עד הנוזל מתחיל לוותר מן המחט. השתמש סמן נקודה דק במיוחד כדי לצייר סימני חשיש על מילימטר אחד זה מזה, החל מניסקוס נוזלי כדי שוק מחט. הגדר את השקופית של יתושים מתחת למחט ולהבטיח כי שדה הנוף הוא רחב מספיק כדי לראות את המניסקוס הפתרון במחט.

ליישר את המחט עם שליש באמצע עצם החזה mesocarape. מכינים את היתוש כנגד המחט עם מלקעות מונחות על הצד הנגדי של היתוש, ומנקבים בעדינות את החותך עם קצה המחט. בעדינות להחליק את המחט לתוך היתוש עד הקצה עבר דרך קו האמצע.

לדכא את כפתור ההזרקה עד הכמות הרצויה של נוזל הוזרק. אם המניסקוס לא זז, לאט להחליק את היתוש או לעוף את המחט תוך כדי צפייה לתנועת מניסקוס. אם חלק של חטוזי פתרון מוזרק מתוך קוטיקל על הסרת מחט, או אם המניסקוס אינו מצליח לזוז, להשליך את החרק כמו הזריקה לא הצליחה.

על זבוב הבית, ליישר את המחט עם mesopleuron. מכינים את הזבוב כנגד המחט עם מלקעות מונחות על הצד הנגדי של הזבוב, ומנקבים בעדינות את החותך עם קצה המחט. מעבירים את החרקים המוזרקים כדי לנקות 3.5 אונקיות מחזיק כוסות בקבוצות של עשר עד 15.

לאחר מכן לכסות את ה עם רשת, ולאפשר להם להתאושש בטמפרטורת החדר. לאחר שהחרקים התאוששו, הפוך את האחזקה מעל כדור כותנה ספוג בתסכות סוכרוז 10%. ראשית, ממלאים קרום מלאכותי בגודל 12 אינץ' בדם טרי, ומחממים אותו ל-60 מעלות באמבט מים חמים.

מייבשים את הממברנה במגבת נייר ומניחים אותה על מכסה הרשת של ההחזקה. לאחר היתושים להאכיל, להחליף את כדור הכותנה ולאפשר את היתושים לנוח במשך 24 שעות. לאחר מכן, לבנות כוסות oviposition על ידי מילוי כוסות ביו אצטט 3.5 גרם ברור עם כ 30 מילימטרים של מים deionized.

לאחר מכן מניחים חתיכת נייר נביטת זרעים בתחתית ה. מכסים את ה עם רשת, וחותכים חריץ קטן בכובע הרשת. 24 שעות לאחר ההאכלה, חותכים חתך קטן בכובע של ההחזקה ומעבירים את הנקבות שניזונו בהצלחה ל כוסות oviposition.

לאחר מכן לאטום את חריץ קטן בכובע oviposition עם כדור כותנה רווי 10%sucrose. לפקח על היתושים, ולעקוב אחר התמותה היומית. לאחר מתן אפשרות ליתושים לביצית במשך חמישה עד שבעה ימים, לספור את הביצים תחת מיקרוסקופ ניתוח.

הדגמת ההליך תהיה ד"ר כריסטופר גדן, אנטומולוג מחקר ARS משרד החקלאות האמריקאי. שלושה ימים לאחר ההזרקה, הרדמה הזבובים עם פחמן דו חמצני. ואז להעביר את הזבובים לכלוב נקי עם מים דיאטה זבוב מוכן.

רשום נתוני תמותה, ולהסיר זבובים מתים מדי יום. לאחר מכן, יש לערבב סובין חיטה 75% עם 25% להאכיל מלאי חי לפי משקל כדי להכין את מדיום גידול הזחלים. מוסיפים מים לתערובת עד לקבלת 62% לחות.

מוסיפים את סובין החיטה הלח במלאי חי לריבוע של בד שחור, ומגלגלים אותו לכדור. השתמש גומייה כדי לשמור על הבד במקום, וללחוץ בעדינות עד בינוני נוזלי מחלחל דרך. מניחים את הכדור ב 60 מיליליטר, ומ מניחים אותו בכלוב לטוס במשך חמש שעות.

לאחר מכן, לשטוף את הביצים את הכדור, להבטיח כי הביצים מוסרים מתחת לקפלים של הבד. לנער את הביצים כדי לשבש את כל האשכולות, ולהעביר אותם לצינור צנטריפוגה בוגר 20 מיליליטר. אפשר את הביצים להתיישב, ושים לב לנפח של ביצים מיושבים בצינור.

לאחר מכן מוסיפים מספיק מים כדי להביא את הנפח ל 20 פעמים את נפח הביצים התיישבו. לאחר מכן, השתמש בר ערבוב מגנטי לערבב את המים ואת השעיית הביצה. לבסוף, השתמש בקצה פיפטה שונה כדי לוותר על 0.5 מיליליטר של ההשעיה על פיסת מטלית שחורה לחה מראש בסדרה של קווים.

בפרוטוקול זה, יתושים נקבה הוזרקו מיקרו כדי להעריך ביטוי גנים. הזרקת נקבות עם RNA גדיל כפול הראה ירידה משמעותית ביטוי יחסי על פני מחזורי oviposition מרובים. גודל מצמד ממוצע יתושים במחזור gonotrophic הראשון הופחתו באופן משמעותי עבור שתי קבוצות dsRPS6 ו dsRPL26 מטופלים.

אפקט מינון ברור נצפתה בגדלים מצמד בעת הזרקת dsRPS6 ממיקרוגרם אחד ל 50 ננוגרם אצל יתושים נקבה. זבובי בית הוזרקו גם עם חמישה מיקרוגרם של מבני RNA גדיל כפול. בדומה לתצפיות היתושים, נרשמה הפחתה משמעותית הן בביטוי התמליל הספציפי והן בגודל המצמד.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשליך חרקים שלא הוזרקו בהצלחה. באמצעות הליך זה, כל מבנה RNA גדיל כפול או biorational אחר יכול להיות מועבר יתושים או זבובים. אל תשכח כי עבודה עם מחטי זכוכית יכול להיות מסוכן, והם תמיד צריכים להיות מסולקים במיכלי פסולת חדים המתאימים.