Name: Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: חקור פיתוח וקטורים אונקוליטיים מבוססי נגיפי חצבת לטיפול אימונותרפיה בסרטן. שיטה זו מאפשרת ייצור נגיפים המבטאים מולקולות אימונומודולטוריות לחיבור תאי T לתאי גידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

שיטות אלה הוקמו בקבוצה Virotherapy בראשות פרופסור ד ר ד ר גיא Ungerechts במרכז הלאומי למחלות הגידול בהיידלברג. . אנחנו חבים לו ואת כל חברי צוות מעבדה, במיוחד ד ר טוביאס שפק, ד ר Rūta Veinalde, ג'ודית פורסטר, בירגיט Hoyler ו ג'סיקה אלברט. עבודה זו נתמכה על ידי עוד Kröner-Fresenius-Stiftung (גרנט 2015_A78 כדי Engeland לספירה) של קרן המדע הלאומית הגרמנית (DFG, להעניק EN 1119/2-1 לספירה Engeland). J.P.W. Heidbuechel מקבל מלגה על ידי הלמהולץ הבינלאומי המדרשה לחקר הסרטן.

Engeland לספירה מופיע בתור שותף הממציא של וירוסים RNA לגבי פטנטים עבור סרטן Immunovirotherapy בבעלות אוניברסיטת היידלברג. J.P.W. Heidbuechel אין לחשוף.

Oncolytic חיסוני (כלומר., שעות נוספות בשילוב עם immunomodulation) טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפול בסרטן, בדרישה נוספת פיתוח ואופטימיזציה של וירוסים oncolytic קידוד חלבונים immunomodulatory. פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי ליצור ולאמת כזה וקטורים עבור בדיקות עוקבות הרלוונטיים במודלים פרה, תרגום קליניים עתידיים פוטנציאל הריפוי נגד סרטן.
רבים פלטפורמות וירוס oncolytic שונים עם יתרונות ברורים הם זמינים63. בנוסף ירידה לפרטים סרטן, וקטור הבטיחות, דרישות לייצור, יעילות פירוק...

Oncolytic וירוסים (OVs) מפותחים כמו הרפוי אנטי סרטניים, במיוחד לשכפל בתוך ולהרוג תאים סרטניים תוך השארת רקמות בריאה ללא פגע. זה הפך נפוץ להבין את virotherapy oncolytic (ש'), ברוב המקרים, לא להסתמך רק על פירוק הגידול מלאה על-ידי שכפול יעיל והפצת של הוירוס, אבל דורש מנגנון פעולה נוספים להצלחה בטיפול, כולל כלי הדם, סטרומה מיקוד ומעל הכל גירוי המערכת החיסונית1,2,3,4. בעוד מחקרים רבים OV מוקדם בשימוש וירוסים שלא שונתה, המחקר הנוכחי יש שהרוויח ביולוגית משופרת הבנה, וירוס biobanks המכילים פוטנציאל הרומן OVs, ואת האפשרויות המוצעות על ידי הנדסה גנטית על מנת ליצור OV מתקדם פלטפורמות5,6,7.
לאור ההצלחה האחרונה של חיסוני, immunomodulatory transgenes הם עניין מיוחד בנושא הנדסה גנטית של OVs. ביטוי יישוב של המוצרים בהם הגן על-ידי תאי הגידול הנגועים OV מפחית רעילות לעומת ניהול מערכתי. פילוח מושגת באמצעות וירוסים עם oncoselectivity הגלום או על-ידי שינוי נגיפי tropism8. Immunomodulation המקומיות משפר את מנגנוני אנטי הגידול ומגובש של עבודה בשעות נוספות. יתר על כן, אסטרטגיה זו הוא אינסטרומנטלי חוקר את יחסי הגומלין בין וירוסים, תאים סרטניים את מערכת החיסון של הפונדקאי. לשם כך, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה ישימים, הניתנים לשינוי עיצוב, שיבוט, להציל, להפיץ של אמת oncolytic paramyxovirus (במיוחד וירוס חצבת) וקטורים קידוד כזה transgenes.
אפנון של התגובה החיסונית יכולה להיות מושגת על ידי מגוון רחב של מוצרים transgene מיקוד שלבים שונים של סרטן-חסינות מחזור9, כולל שיפור זיהוי אנטיגן הגידול [למשל, אנטיגנים סרטניים הקשורים (תעש) או inducers של מרכזי histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות] מעל תמיכה תא דנדריטי ההבשלה למצגת יעילה אנטיגן (ציטוקינים); גיוס והפעלת תאים חיסוניים הרצוי כגון ציטוטוקסיות helper T תאי [נוגדנים, bispecific תא T engagers (BTEs)]; פילוח מדכא תאים כגון בתאי T רגולטוריים, התאים מיאלואידית נגזר משתיק קול, מקרופאגים סרטניים הקשורים לסרטן-הקשורים fibroblasts (נוגדנים, BTEs, ציטוקינים); ומניעת עיכוב תא אפקטור ותשישות (מעכבי המחסום). לפיכך, שפע של גורמים ביולוגיים זמין. הערכה של כזה immunomodulators מקודד וירוס לגבי היעילות הטיפולית ואת הסינרגיה אפשרי, כמו גם ההבנה של מנגנונים בהתאמה יש צורך לשפר טיפול בסרטן.
וירוסי RNA חד-גדילי תחושה שלילית של משפחת Paramyxoviridae מאופיינים על ידי תורמת את השימוש בהם מספר תכונות כמו oncolytic וקטורים. אלה כוללים oncotropism טבעי, קיבולת גנומית transgenes (יותר מ 5 kb)10,11, היעילה מתפשט כולל היווצרות syncytia ו- immunogenicity גבוהה12. לכן, פלטפורמות OV בהתבסס על וירוס כלבלבת13, וירוס חזרת14, וירוס מחלת ניוקאסל15,16,סנדאי וירוס17, וירוס קופיים 518, Tupaia paramyxovirus19 פותחו. בולטת, חיים חיסון וירוס חצבת הקלוש זנים (MV) התקדמו קליניות פיתוח20,21. זני וירוס אלה שימשו במשך עשרות שנים עבור חיסונים שגרתיים עם שיא בטיחות מעולה22. יתר על כן, אין שום סיכון עבור insertional מוטגנזה מכוונת בשל השכפול בקפדנות cytosolic של paramyxoviruses. מערכת רב תכליתי גנטיקה הפוכה המבוססת על אנטי-גנומית cDNA המאפשר החדרת transgenes ליחידות שעתוק נוספים (ATUs) הוא זמין11,23,24. וקטורים MV קידוד symporter סודיום יודיד (MV-ש"ח) לדימות, הקרנות או אנטיגן carcinoembryonic מסיסים (MV-CEA) כסמן הפונדקאית על ביטוי גנים ויראליים הם שמחושב כעת בניסויים קליניים (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 ו- NCT00408590). ניהול בטוח אושרה, דווח על מקרים של יעילות אנטי הגידול הקודם מחקרים25,26,27,28,29, 30 (נבדקה על ידי Msaouel et al.31), לסלול את הדרך עבור וירוסים חצבת oncolytic נוספים יש פותחה, נבדק preclinically. MV קידוד immunomodulatory מולקולות מיקוד שלבים מגוונים של מחזור סרטן-חסינות הוכחו לעכב צמיחת הגידול ו/או להאריך את הישרדות בעכברים, עם הוכחה יעילות החיסון בתיווך, זיכרון לטווח ארוך של מערכת החיסון מגן ב- syngeneic מודלים העכבר. מקודד וקטור transgenes כוללים המושבה גרנולוציט-מקרופאג מגרה פקטור (GM-CSF)32,33, חלבון מפעיל נויטרופילים של ה פילורי 34, מעכבי המערכת החיסונית מחסום35, אינטרלוקין-12 (IL-12)36תעש37, BTEs38, אשר קשר צולב אנטיגן פני שטח הגידול עם CD3, ובכך לעודד פעילות אנטי הגידול על-ידי תאי T polyclonal, ללא קשר (ירידה לפרטים וגירוי שיתוף של קולטן תא T איור 1). תוצאות פרה מבטיח שהושג בונה דרישה נוספת translational למאמצים אלו.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), סוג אני וירוס הרפס סימפלקס קידוד GM-CSF, הוא oncolytic היחידה הטיפולית אושרה על ידי ארצות הברית מזון, והתרופות האמריקני (FDA) סוכנות התרופות האירופית (EMA). שלב המחקר השלישי המוביל אישורי בשנת 2015 מאוחר לא רק הראו יעילות באתר של הזרקת אינטרה-tumoral, אלא גם השפעות abscopal (קרי, הפוגות של נגעים ללא הזרקת) במלנומה מתקדמת39. T-VEC מאז נכנסה ניסויים נוספים עבור יישומים אחרים הישויות הגידול (למשל סרטן עור שאינו מלנומה, , NCT03458117; סרטן הלבלב, NCT03086642), הערכה של טיפולים משולבים, במיוחד עם מחסום המערכת החיסונית מעכבי (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 ו Ribas et al.40).
זה מדגים לא רק את הפוטנציאל של חיסוני oncolytic, אלא גם את הצורך בהמשך מחקר לזיהוי סופריור שילובים של תעריף שעות נוספות, immunomodulation. עיצוב רציונלית של וקטורים נוספים ופיתוח שלהם לבדיקה פרה הוא המפתח במשימה. זה גם לקדם את ההבנה של מנגנונים הבסיסית, יש השלכות על ההתקדמות לקראת טיפול בסרטן אישית יותר. לשם כך, פרסום זה מציג את המתודולוגיה שינוי ופיתוח של paramyxoviruses על חיסוני סרטן ממוקד, ליתר דיוק, של וירוסי חצבת oncolytic קידוד נוגדנים מפעיל את תא T (איור 2).

<table><tbody><tr><td>DNA מהיר דפוס & ערכת קשירה</td><td>Roche Life Science, מנהיים, גרמניה</td><td>4898117001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שיבוט CloneJET PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>K1231</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction</td><td>Kit QIAGEN, הילדן, גרמניה</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>NEB 10-beta Qualified E. coli</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס (NEB), פרנקפורט / מיין, גרמניה</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>LB מדיום אחרי לנוקס</td><td>קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>X964.1</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>קארל רוט, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Miniprep Kit</td><td>QIAGEN, הילדן, גרמניה</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>אנזים הגבלה HindIII-HF</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס (NEB), פרנקפורט / מיין, גרמניה</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen, דרמשטדט, גרמניה</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Biosera, בוסנס, צרפת</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Promega, מנהיים, גרמניה</td><td>E2311</td><td>עשוי להיות מוחלף על ידי מגיב טרנספקציה לבחירה</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה</td><td>K0129</td><td></td></tr><tr><td>תאי Vero</td><td>ATCC, Manassas, VA, ארה"ב</td><td>CCL81</td><td></td></tr><tr><td>B16-CD46 / B16-CD20-CD46</td><td>J. Heidbuechel, DKFZ היידלברג</td><td></td><td>זמין על פי בקשה</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ, בראונשווייג, גרמניה</td><td>ACC 342</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (מדיום נטול סרום)</td> <td>Gibco Life Technologies, דרמשטדט, גרמניה</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>תא קולורימטרי ערכת כדאיות III (XTT)</td><td>PromoKine, היידלברג, גרמניה</td><td>PK-CA20-300-1000</td><td>כולל מגיב XTT</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco Life Technologies, דרמשטדט, גרמניה</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td><td>QIAGEN, הילדן, גרמניה</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Carl Roth , קרלסרוה, גרמניה</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&nbsp; kDa</td><td>Merck , דרמשטדט, גרמניה</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA</td><td>Merck Milipore</td><td>71285-3</td><td></td></tr><tr><td>IgG מסרום אנושי</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-PE</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, גרמניה</td><td>130-092-257</td><td>RRID: AB_871939</td></tr><tr><td>Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin מצומד, שיבוט MOPC-21 נוגדן</td><td>BD Biosciences, היידלברג, גרמניה</td><td>555749</td><td>RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>נוגדן נגד HA-ביוטין, שיבוט 3F10</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>12158167001</td><td>RRID: AB_390915</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotech , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotech , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>מאגר RIPA</td><td>Rockland Immunochemicals, גילברטסוויל, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>MB-030-0050</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 בדיקת ציטוטוקסיות לא רדיואקטיבית</td><td>Promega, מנהיים, גרמניה</td><td>G1780</td><td>כולל תמיסת ליזה פי 10, תמיסת מצע (תערובת מצע ומאגר בדיקה), ותמיסת עצירה</td></tr><tr><td>מרים תאים</td><td>קורנינג, ריינוסה, מקסיקו</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>כלים 10 ס"מ</td><td>קורנינג, אונאונטה, ניו יורק, ארה"ב</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>כלים 15 ס"מ</td><td>Greiner Bio-One, פריקנהאוזן, גרמניה</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות, TPP תחתון U</td><td>, Trasadingen, שוויץ</td><td>92097</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות, תחתית שטוחה</td><td>Neolab, היידלברג, גרמניה</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>Neolab, היידלברג, גרמניה</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 12 בארות</td><td>Neolab, היידלברג, גרמניה</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 50 מ"ל</td><td>nerbe plus, Winsen / Luhe, גרמניה</td><td>02-572-3001</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים T175 Thermo</td><td>Fisher Scientific, St. לאון-ריקבון</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m filters</td><td>Merck , דרמשטדט, גרמניה</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

paramyxoviruses עבור immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר vivo ועיצוב

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

חיסוני סרטן מוצלח יש פוטנציאל להשגת שליטה הגידול לטווח ארוך. למרות ההצלחות האחרונות קליני, נותר צורך דחוף טיפולים יעילה ובטוחה המותאמים פרופילים המערכת החיסונית גידול בודדים. וירוסים Oncolytic לאפשר את תנאי הגיוס של תגובות חיסוניות אנטי הגידול, כמו גם ביטוי גנים בעל הגבלת הגידול. פרוטוקול זה מתאר את דור לשעבר vivo וניתוח של וקטורים oncolytic immunomodulatory. התמקדות וירוסים החיסון נגד חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה, המתודולוגיה הכללית ניתן להתאים וירוס מינים אחרים, transgenes. זרימת העבודה הציג כוללת של עיצוב, שיבוט, הצלה, הפצת וירוסים רקומביננטי. מבחני לנתח שכפול קינטיקה, פעילות lytic של וקטור הפונקציונליות של immunomodulator מבודדים ex-vivo כלולים, ובכך להקל על הדור של סוכנים הרומן להמשך פיתוח במודלים פרה, ובסופו של דבר תרגום רפואי.

איור 1 מדגימה את מנגנון הפעולה של וירוסי חצבת oncolytic קידוד bispecific תא T engagers. תרשים זרימה המתאר את זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצגת באיור2. איור 3 מראה דוגמה של גנום הוירוס חצבת oncolytic שונה. זה מספק ייצוג חזותי של השינויים מסוים מוחל על חצבת וירוס אנטי הגנום מסוים התכונות של transgenes שנוסף. Syncytia הנוצרות על-ידי וירוס חצבת טיפוסי מתוארים באיור<...

פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

שיטה זו יכולה לעזור להתמודד עם אתגרים מרכזיים בתחום האימונותרפיה של סרטן על ידי הקלת הפיתוח של וקטורים אונקולקטיים עבור אימונומודולציה ממוקדת. היתרון העיקרי של המערכת הגנטית ההפוך המיושמת הוא הרבגוניות שלה;לכן, וקטורים יכולים להיות מותאמים כדי לענות על שאלות מחקר שונות ולמקד גידולים עם חתימות חיסוניות מגוונות. צעדי התפשטות וירוס במיוחד קביעת נקודת הזמן האופטימלית וירוס קציר קשה ללמוד מפרוטוקול טקסט כי היווצרות syncytia יש להעריך חזותית לאורך זמן.להתחיל לעצב ולשכפל וקטורים אימונומודולטוריים רקומביננטיים כמתואר בכתב היד. פרוטוקול זה מתאר צעדים ספציפיים לפיתוח וקטור חיסון נגד חצבת אונקוליטי, קידוד מעורב תא T ביספקיפי. כדי להציל את נגיף החצבת מ- cDNA, 24 שעות לפני צלחת transfection נגיף חצבת יצרנית תאים באופן שווה על צלחת קיר 6.זרעים 200, 000 תאים ב 2 מיליליטר DMEM המכיל 10 אחוז FBS לגם כדי להשיג 65 עד 75 אחוזים confluency בזמן transfection. מערבבים 5 מיקרוגרם של DNA רקומביננטי קידוד אנטיגנום וירוס חצבת שישמש כדי לשנות את התאים. פלסמידים מתאימים וכתב פלואורסצנטי בנפח כולל של 200 מיקרוליטרים של DMEM.מוסיפים לתערובת 18.6 מיקרוליטרים של רגנט טרנספיצימאלי ליפוזומלי ומיד מצליפים בצינור כדי לערבב. דגירה זו תערובת transfection במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לשנות את התאים המפיק MV להסיר את המדיום מ 6 צלחת גם גדל 65 כדי 75 אחוז confluency ולהוסיף 1.8 מיליליטר של DMEM עם 2 אחוז FBS ו 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר Kanamycin ל באר.לאחר מכן מוסיפים את תערובת ההטרמפים כלפי ים לכל באר ומסתחררים בזהירות. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני. למחרת להחליף את המדיום עם 2 מיליליטר של DMEM טרי עם 2 אחוז FBS ו 50 מיקרוגרם למיליליטר Kanamycin ולחזור על זה כאשר המדיום הופך חומצי מוכר על ידי הצבע הצהוב.השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן בתאים מדי יום עבור ביטוי גנים כתב היווצרות סינקטיה. כאשר סינפיציה גדולה המורכבת מ -20 תאים או יותר גלויים או כאשר תאים הופכים צפופים מדי לקצור את הנגיף. 24 שעות לפני זרעי הקציר הצפויים כ 1.5 מיליון תאי מפיק MV ב 12 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS על מנות 10 ס"מ כדי להשיג 65 עד 75 אחוז קליטה בזמן חיסון וירוס.כדי לאסוף את פרוגיוני וירוס להשתמש מגרד תאים כדי לגרד בזהירות תאים המפיק חסיד מ 6 לוח הקיר עם תאים מדבקים. מעבירים את המדיום המכיל את התאים השריטים לתוך צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה לפחות 2500 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת התא.לאחר צנטריפוגה מערבבים את העל-טבעי נטול התאים עם מדיום נטול סרום לנפח סופי של 4 מיליליטר להכנת אינקולום. מוציאים את המדיום מהצלחת של 10 ס"מ עם תאי מפיק MV ומוסיפים את ה- inoculum לתאים. דגירה לפחות 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה להוסיף 6 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ותאי דגירה לילה. לאחר מכן החלף את המדיום עם 12 מיליליטר של DMEM טרי עם 10 אחוז FBS ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני עד הקציר. שימו לב לתאים לפחות פעמיים ביום.לפני סינקטיה פרץ כאשר הפרעה קרום להיות גלוי לקצור את הנגיף. כדי לקצור את המעבר הראשון להסיר על טבעי מהצלחת ולהוסיף 600 microliters של מדיום ללא סרום. לאחר מכן השתמש במעלית תאים כדי לגרד את התאים ולהעביר לצינור נקי.מיד לאחר מכן להקפיא את ההשעיה וירוס חנקן נוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות כדי להבטיח הקפאה יסודית. כדי לקבוע titers של מניות וירוס octuplicates לכל aliquot באמצעות 96 לוחות קיר. ראשית למשוך את התאים המפיק מבקבוקי תרבות תא T75 לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.ספור את התאים והתאם את מתלי התא ל- 150, 000 תאים למיליליטר ב- DMEM עם 10 אחוז FBS. הוסף 90 מיקרוליטרים של DMEM עם 10 אחוז FBS ל באר של צלחת קיר 96. לאחר מכן להוסיף 10 microliters מ aliquot אחד של מלאי הנגיף לכל 8 בארות בעמודה הראשונה של הצלחת.מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 10 microliters של כל באר, מן העמודה הראשונה אל העמודה השנייה, ומערבבים ביסודיות על ידי צינור למעלה ולמטה. חזור על זה עבור כל עמודה כדי לקבל דילול פי עשרה טוריים של הנגיף באמצעות טיפים פיפטה טריים עבור כל שלב דילול.השלך 10 מיקרוליטרים מכל באר של העמודה האחרונה. הוסף 100 microliters של השעיית תא עם 150, 000 תאים למיליליטר לכל באר לוודא שאין גושי תאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5 אחוז פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.בדוק אם יש סינקטיה באמצעות מיקרוסקופ אור. ספירת סינקטיה בכל באר של העמודה עם גורם הדילול הגבוה ביותר המכיל סינקטיה גלויה. עבור וירוסים הממקמים כתב פלואורסצנטי, ניתן לספור סינקטיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.לניתוח של קינטיקה שכפול וירוס חצבת יום אחד לפני זיהום זרע 100, 000 תאי ורו ב 1 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ל באר על 12 צלחות קיר עם לפחות 2 בארות עבור כל נקודת עניין זמן. כדי להדביק את התאים להחליף את המדיום עם 300 microliters של מדיום ללא סרום המכיל את הכמות המתאימה של הנגיף. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני לפחות 2 שעות.הסר inoculum ולהוסיף 1 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ולהמשיך דגירה. בנקודות זמן רלוונטיות לאחר זיהום לקצור פרוגיוני ויראלי על ידי גירוד ישיר של תאים לתוך המדיום. מעבירים תוכן מכל באר לצינור בודד.יש להקפיא את החנקן הנוזלי ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד להקפאה ולאחר מכן להמשיך כמתואר בכתב היד. כדי להתחיל בהערכה של ציטוקסיות מתווכה על ידי תא BTE על ידי שחרור LDH, תחילה לבודד מוצרי מהומש מופרשים לידי ביטוי על ידי תאי יעד נגועים בנגיף ולבודד תאים משפיעים חיסוניים כמתואר בכתב היד. לאחר מכן זרע תאי יעד בצלחת קיר U-bottom 96 וכוללים דגימות כמתואר בכתב היד.הוסף immunomodulators מבודדים בעבר בריכוזים הרצויים לדגימות המתאימות. מוסיפים תאי עריק חיסוני ביחסים הרצויים ומוסיפים נפח בינוני לנפח כולל של 100 מיקרוליטרים ל באר. דגירה עבור מסגרות הזמן שנקבעו בעבר הרצוי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני.45 דקות לפני איסוף הדגימה להוסיף 10 microliters של פתרון Lysis 10X ל בארות המכילות דגימות T max ואת הפקדים הבינוניים המתאימים ולהמשיך דגירה. צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים G במשך 4 דקות. להעביר 50 microliters של supernatant מכל באר ל בארות של צלחת שטוחה למטה 96 קיר הקפדה לא להעביר את התאים.לאחר הכנת פתרון מצע על פי היצרן להוסיף 50 microliters לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות או עד דגימות T מקסימום להפוך אדום עמוק. לאחר הדגירה מוסיפים 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר.צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 4000 פעמים G ולאחר מכן להשתמש במחט חלולה כדי להסיר בועות אוויר. למדוד ספיגה אופטית ב 490 ננומטר ולחשב כמתואר בכתב היד. לאחר חיסון עם קידוד ללא שינוי ו- BTE קידוד על עקומות צמיחה וירוסי חצבת אונקוליטית של הווקטורים בהשוואה על תאי vero נראים דומים.עקומות הכדאיות של התאים בתאי קרצינומה של המעי ה-mc38 מורין מבטאות באופן יציב אנטיגן קרצ'ינומבריוניק אנושי ואת קולטני ה-MV CD46 לאחר החיסון מראים שפעילות ליטית של נגיף הקידוד הטרנסג'יני מפגרת מאחור בקו התאים של גידול המורין. ציטומטריית זרימה של אנטיגן היעד מבטא תאים דגירה עם BTE של בחמש דילולים שונים הראו BTE מחייב על ידי תאים באופן תלוי ריכוז. ב immunoblot לאחר משיכה מגנטית למטה של תאים הקשורים BTE הראו כי כאשר לא מיקוד BTE של שימשו לא היו כמויות לזיהוי של תאים;ואילו כאשר מיקוד דגימות BTE שימשו תאים מאוגדים היו נוכחים בשבר אלוטיון.BTE מתווך אנטיגן היעד ספציפי וריכוז תלוי cytotoxicity של תאי מורין T מסומן על ידי בדיקה שחרור LDH נציג ומראה כי בדוגמה הנוכחית 15 אחוז הרג תאים ספציפי הושג בריכוז BTE גבוה יחסית של 1 מיקרוגרם למיליליטר לעומת תאי התייחסות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפקח באופן קבוע על תאים כדי לבדוק את התקדמות הזיהום. אל תשכח כי זני חיסון חצבת רקומביננטי למרות שהומתק עלול להיות מסוכן במיוחד לאנשים מדוכאי חיסון.הימנע מחשיפה על ידי ביצוע נהלי הבטיחות הביולוגיים המתאימים. יש לחסן אנשים המטפלים בווירוסים לפני ביצוע שיטות אלה. בעקבות הליך זה ביטוי ויראלי של transgenes נוספים ניתן להשיג על מנת לנתח וירוס מארח אינטראקציות והשפעות טיפוליות.הפיתוח של טכניקות אלה סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום הביותרפיה לחקור את ההשפעות של immunomodulators לידי ביטוי מקומי בישויות גידול רבות;In Vitro, In Vivo, וגם בניסויים קליניים.

paramyxoviruses-for-tumor-targeted-immunomodulation-design-evaluation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

אקס הרחבה vivo של גידול תאים T-reactive באמצעות 1/Ionomycin Bryostatin ואת גמא נפוצים שרשרת גיבוש ציטוקינים

פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו"ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

חלקיקים נגיפיים צמח (VNPs) מבטיחים פלטפורמות ליישומים ביו. כאן, אנו מתארים את ההליכים להתפשטות צמח VNP, טיהור, אפיון, וbioconjugation. לבסוף, אנו מראים את היישום של VNPs לביות והדמית גידול תוך שימוש במודל עכבר xenograft ודימות פלואורסצנטי.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

סרטון זה מדגים בדיקת חיסון לגידול מבוסס תאים. עכבר, המוזרק תוך עורית עם תאי מלנומה B16-F10 להיווצרות גידול, מחוסן בתאי B16-F10 המפרישים ציטוקין Flt3L בסמוך לגידול המפותח. ה- Flt3L המופרש מהחיסון מקדם את ההבשלה וההתרבות של תאים דנדריטיים המציגים אנטיגנים סרטניים לתאי T בבלוטות הלימפה, ומעוררים תגובה חיסונית ממוקדת נגד הגידול.

השתלת גידול והזרקת חיסון נגד גידול במודל עכבר

פפטידים ויראלי-derived מצמידים נוגדן-conjugates (ACs) היא גישה צובר תאוצה בשל הפוטנציאל להעברת מטענים מולקולרית עם הצטברות תאי הגידול מוגברת. ניצול שיטות נפוצות כדי להעריך את ההטיה פפטיד, AC הצטברות תאיים המטען ואת הגידול מיקוד, פרוטוקול זה מסייע החוקרים במהלך שלבי הפיתוח מפתח.

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

אנו מתארים כאן הזרימה cyvivo try מבוסס בתוך שיטת ההרג המאפשרת לבדוק את החיסונית של האימונוטוקסיט T לימפוציטים (CTL) התגובות של הגידול מודל אנטיגן. אנו מספקים דוגמאות לאופן השימוש בבחינה אלגנטית זו למחקרים מכניסטיים ולבדיקת יעילות בסמים.

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

פרוטוקול זה מתאר את הדור כירורגי של גידולים הלבלב אורתודפית ואת העיכול המהיר של גידולים מבודדים מבודד מורטין הלבלב. לאחר העיכול, אוכלוסיות קיימא תאים החיסונית יכול לשמש ניתוח נוסף במורד הזרם, כולל לשעבר גירוי vivo של תאים T לאיתור ציטוקינים תאיים ידי הזרימה cy, try.

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

כאן אנו מציגים פרוטוקול השתלת גידול לאפיון לימפוציטים חודרים לגידולים שמקורם בגידול ובפריפריה במודל גידול בעכבר. מעקב ספציפי אחר זרם תאי מערכת החיסון שמקורם במקבל עם ציטומטריה של זרימה חושף את הדינמיקה של השינויים הפנוטיפיים והתפקודיים של תאים אלה במהלך תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות.

השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8+ בעכברים

כתב יד זה מתאר כיצד להעריך במערכת החיסונית של vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי הגידול (EVs) באמצעות ציטומטריית זרימה. רכבים חשמליים שמקורם בגידולים העוברים מוות תאי אימונוגני שנגרם כתוצאה מהטיפול נראים רלוונטיים במיוחד במערכון הגידול. פרוטוקול זה מדגים את ההערכה של אוקסליפלטין-induced emunostimulatory גידול EVs אבל יכול להיות מותאם להגדרות שונות.

ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול

הפרוטוקול מציג מודל אימונותרפיה לסרטן באמצעות חיסון מבוסס תאים עם מלנומה B16-F10 המבטאת Flt3L. פרוטוקול זה מדגים את ההליכים, כולל הכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת צמיחת הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה.

מודל אימונותרפיה ניסיוני למלנומה באמצעות חיסון לגידול עם ציטוקין המטופויאטי

חקור פיתוח וקטורים אונקוליטיים מבוססי נגיפי חצבת לטיפול אימונותרפיה בסרטן. שיטה זו מאפשרת ייצור נגיפים המבטאים מולקולות אימונומודולטוריות לחיבור תאי T לתאי גידול.

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

גלה סרטונים נוספים