Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.

שיטה זו יכולה לעזור להתמודד עם אתגרים מרכזיים בתחום האימונותרפיה של סרטן על ידי הקלת הפיתוח של וקטורים אונקולקטיים עבור אימונומודולציה ממוקדת. היתרון העיקרי של המערכת הגנטית ההפוך המיושמת הוא הרבגוניות שלה;לכן, וקטורים יכולים להיות מותאמים כדי לענות על שאלות מחקר שונות ולמקד גידולים עם חתימות חיסוניות מגוונות. צעדי התפשטות וירוס במיוחד קביעת נקודת הזמן האופטימלית וירוס קציר קשה ללמוד מפרוטוקול טקסט כי היווצרות syncytia יש להעריך חזותית לאורך זמן.

להתחיל לעצב ולשכפל וקטורים אימונומודולטוריים רקומביננטיים כמתואר בכתב היד. פרוטוקול זה מתאר צעדים ספציפיים לפיתוח וקטור חיסון נגד חצבת אונקוליטי, קידוד מעורב תא T ביספקיפי. כדי להציל את נגיף החצבת מ- cDNA, 24 שעות לפני צלחת transfection נגיף חצבת יצרנית תאים באופן שווה על צלחת קיר 6.

זרעים 200, 000 תאים ב 2 מיליליטר DMEM המכיל 10 אחוז FBS לגם כדי להשיג 65 עד 75 אחוזים confluency בזמן transfection. מערבבים 5 מיקרוגרם של DNA רקומביננטי קידוד אנטיגנום וירוס חצבת שישמש כדי לשנות את התאים. פלסמידים מתאימים וכתב פלואורסצנטי בנפח כולל של 200 מיקרוליטרים של DMEM.

מוסיפים לתערובת 18.6 מיקרוליטרים של רגנט טרנספיצימאלי ליפוזומלי ומיד מצליפים בצינור כדי לערבב. דגירה זו תערובת transfection במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לשנות את התאים המפיק MV להסיר את המדיום מ 6 צלחת גם גדל 65 כדי 75 אחוז confluency ולהוסיף 1.8 מיליליטר של DMEM עם 2 אחוז FBS ו 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר Kanamycin ל באר.

לאחר מכן מוסיפים את תערובת ההטרמפים כלפי ים לכל באר ומסתחררים בזהירות. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני. למחרת להחליף את המדיום עם 2 מיליליטר של DMEM טרי עם 2 אחוז FBS ו 50 מיקרוגרם למיליליטר Kanamycin ולחזור על זה כאשר המדיום הופך חומצי מוכר על ידי הצבע הצהוב.

השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן בתאים מדי יום עבור ביטוי גנים כתב היווצרות סינקטיה. כאשר סינפיציה גדולה המורכבת מ -20 תאים או יותר גלויים או כאשר תאים הופכים צפופים מדי לקצור את הנגיף. 24 שעות לפני זרעי הקציר הצפויים כ 1.5 מיליון תאי מפיק MV ב 12 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS על מנות 10 ס"מ כדי להשיג 65 עד 75 אחוז קליטה בזמן חיסון וירוס.

כדי לאסוף את פרוגיוני וירוס להשתמש מגרד תאים כדי לגרד בזהירות תאים המפיק חסיד מ 6 לוח הקיר עם תאים מדבקים. מעבירים את המדיום המכיל את התאים השריטים לתוך צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה לפחות 2500 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת התא.

לאחר צנטריפוגה מערבבים את העל-טבעי נטול התאים עם מדיום נטול סרום לנפח סופי של 4 מיליליטר להכנת אינקולום. מוציאים את המדיום מהצלחת של 10 ס"מ עם תאי מפיק MV ומוסיפים את ה- inoculum לתאים. דגירה לפחות 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני.

לאחר הדגירה להוסיף 6 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ותאי דגירה לילה. לאחר מכן החלף את המדיום עם 12 מיליליטר של DMEM טרי עם 10 אחוז FBS ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני עד הקציר. שימו לב לתאים לפחות פעמיים ביום.

לפני סינקטיה פרץ כאשר הפרעה קרום להיות גלוי לקצור את הנגיף. כדי לקצור את המעבר הראשון להסיר על טבעי מהצלחת ולהוסיף 600 microliters של מדיום ללא סרום. לאחר מכן השתמש במעלית תאים כדי לגרד את התאים ולהעביר לצינור נקי.

מיד לאחר מכן להקפיא את ההשעיה וירוס חנקן נוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות כדי להבטיח הקפאה יסודית. כדי לקבוע titers של מניות וירוס octuplicates לכל aliquot באמצעות 96 לוחות קיר. ראשית למשוך את התאים המפיק מבקבוקי תרבות תא T75 לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.

ספור את התאים והתאם את מתלי התא ל- 150, 000 תאים למיליליטר ב- DMEM עם 10 אחוז FBS. הוסף 90 מיקרוליטרים של DMEM עם 10 אחוז FBS ל באר של צלחת קיר 96. לאחר מכן להוסיף 10 microliters מ aliquot אחד של מלאי הנגיף לכל 8 בארות בעמודה הראשונה של הצלחת.

מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. השתמש פיפטה רב ערוצית להעביר 10 microliters של כל באר, מן העמודה הראשונה אל העמודה השנייה, ומערבבים ביסודיות על ידי צינור למעלה ולמטה. חזור על זה עבור כל עמודה כדי לקבל דילול פי עשרה טוריים של הנגיף באמצעות טיפים פיפטה טריים עבור כל שלב דילול.

השלך 10 מיקרוליטרים מכל באר של העמודה האחרונה. הוסף 100 microliters של השעיית תא עם 150, 000 תאים למיליליטר לכל באר לוודא שאין גושי תאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5 אחוז פחמן דו חמצני במשך 48 שעות.

בדוק אם יש סינקטיה באמצעות מיקרוסקופ אור. ספירת סינקטיה בכל באר של העמודה עם גורם הדילול הגבוה ביותר המכיל סינקטיה גלויה. עבור וירוסים הממקמים כתב פלואורסצנטי, ניתן לספור סינקטיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

לניתוח של קינטיקה שכפול וירוס חצבת יום אחד לפני זיהום זרע 100, 000 תאי ורו ב 1 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ל באר על 12 צלחות קיר עם לפחות 2 בארות עבור כל נקודת עניין זמן. כדי להדביק את התאים להחליף את המדיום עם 300 microliters של מדיום ללא סרום המכיל את הכמות המתאימה של הנגיף. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני לפחות 2 שעות.

הסר inoculum ולהוסיף 1 מיליליטר של DMEM עם 10 אחוז FBS ולהמשיך דגירה. בנקודות זמן רלוונטיות לאחר זיהום לקצור פרוגיוני ויראלי על ידי גירוד ישיר של תאים לתוך המדיום. מעבירים תוכן מכל באר לצינור בודד.

יש להקפיא את החנקן הנוזלי ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד להקפאה ולאחר מכן להמשיך כמתואר בכתב היד. כדי להתחיל בהערכה של ציטוקסיות מתווכה על ידי תא BTE על ידי שחרור LDH, תחילה לבודד מוצרי מהומש מופרשים לידי ביטוי על ידי תאי יעד נגועים בנגיף ולבודד תאים משפיעים חיסוניים כמתואר בכתב היד. לאחר מכן זרע תאי יעד בצלחת קיר U-bottom 96 וכוללים דגימות כמתואר בכתב היד.

הוסף immunomodulators מבודדים בעבר בריכוזים הרצויים לדגימות המתאימות. מוסיפים תאי עריק חיסוני ביחסים הרצויים ומוסיפים נפח בינוני לנפח כולל של 100 מיקרוליטרים ל באר. דגירה עבור מסגרות הזמן שנקבעו בעבר הרצוי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 אחוז פחמן דו חמצני.

45 דקות לפני איסוף הדגימה להוסיף 10 microliters של פתרון Lysis 10X ל בארות המכילות דגימות T max ואת הפקדים הבינוניים המתאימים ולהמשיך דגירה. צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים G במשך 4 דקות. להעביר 50 microliters של supernatant מכל באר ל בארות של צלחת שטוחה למטה 96 קיר הקפדה לא להעביר את התאים.

לאחר הכנת פתרון מצע על פי היצרן להוסיף 50 microliters לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 30 דקות או עד דגימות T מקסימום להפוך אדום עמוק. לאחר הדגירה מוסיפים 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר.

צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 4000 פעמים G ולאחר מכן להשתמש במחט חלולה כדי להסיר בועות אוויר. למדוד ספיגה אופטית ב 490 ננומטר ולחשב כמתואר בכתב היד. לאחר חיסון עם קידוד ללא שינוי ו- BTE קידוד על עקומות צמיחה וירוסי חצבת אונקוליטית של הווקטורים בהשוואה על תאי vero נראים דומים.

עקומות הכדאיות של התאים בתאי קרצינומה של המעי ה-mc38 מורין מבטאות באופן יציב אנטיגן קרצ'ינומבריוניק אנושי ואת קולטני ה-MV CD46 לאחר החיסון מראים שפעילות ליטית של נגיף הקידוד הטרנסג'יני מפגרת מאחור בקו התאים של גידול המורין. ציטומטריית זרימה של אנטיגן היעד מבטא תאים דגירה עם BTE של בחמש דילולים שונים הראו BTE מחייב על ידי תאים באופן תלוי ריכוז. ב immunoblot לאחר משיכה מגנטית למטה של תאים הקשורים BTE הראו כי כאשר לא מיקוד BTE של שימשו לא היו כמויות לזיהוי של תאים;ואילו כאשר מיקוד דגימות BTE שימשו תאים מאוגדים היו נוכחים בשבר אלוטיון.

BTE מתווך אנטיגן היעד ספציפי וריכוז תלוי cytotoxicity של תאי מורין T מסומן על ידי בדיקה שחרור LDH נציג ומראה כי בדוגמה הנוכחית 15 אחוז הרג תאים ספציפי הושג בריכוז BTE גבוה יחסית של 1 מיקרוגרם למיליליטר לעומת תאי התייחסות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפקח באופן קבוע על תאים כדי לבדוק את התקדמות הזיהום. אל תשכח כי זני חיסון חצבת רקומביננטי למרות שהומתק עלול להיות מסוכן במיוחד לאנשים מדוכאי חיסון.

הימנע מחשיפה על ידי ביצוע נהלי הבטיחות הביולוגיים המתאימים. יש לחסן אנשים המטפלים בווירוסים לפני ביצוע שיטות אלה. בעקבות הליך זה ביטוי ויראלי של transgenes נוספים ניתן להשיג על מנת לנתח וירוס מארח אינטראקציות והשפעות טיפוליות.

הפיתוח של טכניקות אלה סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום הביותרפיה לחקור את ההשפעות של immunomodulators לידי ביטוי מקומי בישויות גידול רבות;In Vitro, In Vivo, וגם בניסויים קליניים.