Name: לוקליזציה של Coeruleus לוקוס במוח העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: למדו פרוטוקול מפורט לאיתור הלוקוס קוארולאוס במוח העכבר באמצעות חיתוך מדויק ואימונוהיסטוכימיה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי חלבונים ומטלים לחקר הפרעות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Abigael Muchenditsi על קיומו של המושבה העכבר. השימוש המקור הפוטון מתקדם ב Argonne National Laboratory נתמכה על ידי משרד האנרגיה האמריקני, משרד המדע, משרד של בסיסי אנרגיה למדעים, תחת מספר חוזה: דה-AC02-06CH11357. אנו מודים אולגה Antipova, ד ר סטפן ווגט על המשתמש תמיכה וסיוע למקור הפוטון מתקדם. עבודה זו מומן על ידי 2R01GM101502 גרנט המכון הלאומי לבריאות ל SL.

מחקרים של חיות אושרה על ידי ג'ונס הופקינס אוניברסיטת טיפול בעלי חיים, מספר פרוטוקול שימוש (ACUC) M017M385.
1. המוח חותך
<ol><li>לשתק, עזים ומתנגד עכברים על-ידי היישום של 3% איזופלוריין.<ol>
<li>לספוג כדור צמר גפן עם טיפות של איזופלוריין והנח אותו בצינור microcentrifuge 15 mL. המקום האף של החיה לתוך הצינור ולאפשר לשאוף את איזופלוריין. בדוק עומק ההרדמה לתחושה של חוסר תגובה הבוהן-קורט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום החיה על גבו, לשתק אותו על-ידי הצמדת הגפיים שלו עם סיכה T תוך גישה בבטן.</li>
	<li>לחתוך את החיה עם מספריים כירורגיים על ידי ביצוע חיתוך בעור בטן ו לחתוך העור באזור החזה. להצמיד את העור באמצעות סיכות T. ואז לשבור את קרום הצפק אל בית החזה. לחשוף את הלב על-ידי פיצוח בחלל בית-החזה וחיתוך הסרעפת.</li>
	<li>חותכים אטריום ימין כדי לאפשר את הדם לזרום מתוך החיה. הוספת מזרק 10 מ"ל עם מחט 25-מד לתוך החדר השמאלי, perfuse עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS). הערה: פעולה זו מאפשרת את הפתרון לזרום דרך מחזור מערכתי ויציאה דרך אטריום ימין.</li>
	<li>הסר את המזרק 10 מ"ל ולהוסיף מחט 25-מד המצורפת את המזרק 60 מ. Perfuse דרך החדר השמאלי עם 50 מ של קרח קר 4% paraformaldehyde (PFA).<ol>
<li>הכנת הקרח קר 4% PFA פתרון על ידי דילול 10% הפתרון PFA H2O מצמרר הפתרון הסופי של כדורגלן 4% ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד את הראש של העכבר ולהסיר למוח הגולגולת.<ol>
<li>לחתוך את העור מן הצוואר ולאחר מכן לחתוך לכיוון העיניים כדי לחשוף את הגולגולת. לפצח את הגולגולת מן הצוואר האף, ולאחר מכן מן עין אחת לאחרת. לקלף את הגולגולת החוצה, לסלק את כל המוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה המוח ב- 4% PFA במשך 24 שעות ביממה ב 4 º C.</li>
	<li>להעביר את המוח עם מלקחיים לתוך צינור חרוטי 50 מ ל מלא עם 25 מ של 30% סוכרוז פתרון. שמור אותו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 48-72 h עד המוח שוקע לתחתית של התחתית.</li>
	<li>לחתוך המוח עם מבצעה מוח עכבר למבוגרים מטריקס הפרונטליים דרך המוח האמצעי (~ 3 מ מ האחורי של bregma). לשמור על המוח ושהקטע לגזע המוח. הערה: זה יגרום בשני הסעיפים המוח – אחד רוב המכיל קליפה (קדמי של החתך), אחד המכיל את גזע המוח/המוח הקטן (האחורי של החתך). השתמש במקטע גזע המוח עבור השלבים הבאים.</li>
	<li>להטביע את המקטע גזע המוח עם משטח חיתוך מניחים בתחתית תבנית להטבעה, מוקף טמפרטורה אופטימלית חיתוך המורכב (אוקטובר); להעביר את המוח מוטבע מקפיא-80 ° C ומקפיאים במשך לפחות 12 ח' – עד שימוש נוסף.</li>
	<li>חיתוך-cryostat: המקום ההטמעה עובש המכיל המוח באוקטובר לתוך cryostat; דגירה ב cryostat במשך מספר שעות להתאים את הטמפרטורה של הרחוב המוח לזה של cryostat זה.</li>
	<li>לקלף את להטבעה לחשוף את הבלוק OCT המכיל את המוח.</li>
	<li>השתמש סכיני גילוח להסרת עודף של OCT מפני השטח של הרחוב בלי לגעת במוח.</li>
	<li>הר הרחוב OCT על הצ'אק של cryostat, חשיפת פני לחתוך המוח לעבר החזית.</li>
	<li>להתאים פני לחתוך המוח כך זה הוא מונחה במקביל razorblades של cryostat.</li>
	<li>חתוך את המוח החל לשד, חיתוך 100 מיקרומטר מקטעים rostrally.</li>
	<li>חתוך rostrally עד המוח הקטן של גזע המוח לחתוך כמו פרוסה רציפה אחת. מתחילים באיסוף פרוסות-עובי 50 מיקרומטר. הערה: כפי אחד trims rostrally מ לשד, גזע המוח, מוח מאורך אחתוך שני מקטעים נפרדים. בסעיפים rostral, גזע המוח, מוח מאורך ימזג בסופו של דבר ברמת הנוזליםה 4. לאחר הקצוות לרוחב הנוזליםth 4 בנוי היטב, ואז המוח, גזע המוח ייצאו כמו פרוסה רציפה אחת.<ol>
<li>לאסוף את המוח מוקף OCT פרוסה עם מלקחיים ומניחים אותו בטוב של צלחת 24-ובכן מלא עם PBS (איור 2 א). LC יהיה הבולט ביותר כאשר המוח ואת רקתי נחות לפגוש אחד את השני-~-5.52 מ"מ אחורי של bregma (איור 1b). הערה: החלק הקדמי ביותר של LC ייעלם ברגע הקטן למחלקה לחלוטין כבר לא המקיף את רקתי נחות-~-5.34 מ"מ אחורי של bregma (איור 1 c).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אימונוהיסטוכימיה דופמין β-Hydroxylase או Hydroxylase טירוזין (איור 2)
<ol><li>יום 1<ol>
<li>לשטוף את הפרוסות שנבחרו שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- PBS.</li>
		<li>Permeabilize במשך 24 שעות ביממה ב- 0.5% saline פוספט באגירה מלאה עם חומר ניקוי (PBSD) ב 4 º C.<ol>
<li>לדלל 125 µL של חומרי ב 25 מ של PBS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום 2<ol>
<li>לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- 0.5% PBSD.</li>
		<li>הוסף את נוגדן ראשוני, אנטי-דבח, מלך אקסום או ה-anti עבור 18 h-לדילול שבערך ב- 0.5% PBSD ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום 3<ol>
<li>לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 10 דקות ב- 0.5% PBSD.</li>
		<li>להוסיף הנוגדן הרצוי המשני (488 החמור נגד הארנב פלורסצנטיות ירוק) לדילול 1:1000 ב 0.5% PBSD עבור 16 h.</li>
		<li>לעטוף את הצלחת היטב 24 אלומיניום ובמקום ב 4 º C.</li>
		<li>לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- 0.5% PBSD.</li>
		<li>לרחוץ למשך 5 דקות ב- PBS.</li>
		<li>העברת פרוסות עם מברשת עיפרון לתוך מיכל המים.</li>
		<li>הר פרוסות צף במים בשקופיות טעונה.</li>
		<li>סעיפים Coverslip עם הרכבה hard-set מדיה (ללא דאפי).</li>
		<li>יבש הסעיפים נטען המוח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>התמונה פרוסות המוח במיקרוסקופ קונפוקלי או פלורסנט עם הגדרות כדי לזהות אות נוגדן המשני המתאים fluorophore גל.</li>
		<li>להתאים את המיקרוסקופ מוקד המטוס הפרוסה המוח ולקחת תמונה אחת בהגדלה X 10.</li>
		<li>כדי לאתר אזור LC אפשרי של הפרוסה המוח, להשתמש הנוזליםth 4 לאוריינטציה; המוח הקטן נמצא מעל הנוזלים, פונס גזע המוח נמצאים מתחת30.</li>
		<li>כדי לאתר את LC, להתמקד הקצוות לרוחב הנוזליםth 4; LC מקורו של קצות החדרth ונקודות 4 לכיוון פונס / באזור גזע המוח (איור 2b, ג 2).</li>
		<li>בעקבות הדמיה לוקליזציה של LC פרוסות המוח מסוימים, לאחסן שקופיות המכילה פרוסות המוח ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. זיהוי LC פרוסות המוח
<ol><li>כדי לאתר את המוח המקטע המכיל את LC, לחתוך את המוח העכבר כפי שתואר לעיל, לאסוף במקטעים PBS מלא 24 מנות היטב, כפי שמוצג באיור 2a.<ol>
<li>במקום סעיף מוח אחד לכל טוב כדי לאפשר לוקליזציה נאותה של LC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף סכום כולל של 48 פרוסות המוח זה יהיה immunostained לפי המוח. הערה: כל הבארות של שתי מנות שמוצג באיור 2a להכיל פרוסות המוח של חיה אחת.</li>
	<li>Immunostain כל פרוסה השלישית עד החמישית דבח, מלך אקסום, או TH. רצוי, לבצע אימונוהיסטוכימיה של אלה פרוסות המוח סמוכים אלה הם לבדיקה נוספת (באמצעות קרני רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ, XFM). הערה: הליך זה מאפשר לוקליזציה המדויק של LC פרוסות הסופית assay (איור 2 א; המסומנות במספרים בין הבארות).</li>
	<li>להתאים את מספר הפרוסות המוח כי הם immunostained בהתאם ליישום, למשל, בין אם הם דורשים את המיקום המדויק של המרכז ושל קצה של LC, או רק הערכה קשה.</li>
	<li>בעקבות אימונוהיסטוכימיה, לאתר את פרוסות המוח המכיל LC באמצעות תבנית אופיינית של ביטוי בשני הצדדים של החדרth 4 (איור 2b, ג 2). ההגדלה של האות דבח, מלך אקסום ב LC הפרוסות המוח רצופים מוצג איור דו-ממדי, 2e; התמונה בהגדלה של LC זה היא מוכתמת על תאנון מוצג איור 2f.
</li>
	<li>השתמש הסעיפים סמוכים אלה LC המכיל ללימודי - במקרה זה עבור XFM לכמת רמות מתכת (איור 3).</li>
	<li>כדי לבצע XFM, לאסוף 10-30 מיקרומטר (בהתאם ההתקנה) פרוסות דק המוח הילתית על סרט דק פולימריים שבה הם להיות רכוב על מחזיקי לדוגמה, עם תמונה-סינכרוטרון.</li>
	<li>חנות פרוסות המוח אשר מוכנים על סרט דק פולימריים XFM בטמפרטורת החדר ולבצע XFM.</li>
</ol>4. מתכת הדמיה ב LC ויה XFM
<ol><li>לחתוך מוח העכבר דוגמה כמתואר לעיל, לקבוע LC, ומדידת רמות מתכת ויה XFM מ פרוסות המוח אלה המכילים את LC.</li>
	<li>התמונה הפצות היסודות על הפרעות לקרן החלקיקים 2-מזהה-E למקור הפוטון מתקדם (Argonne National Laboratory, איל Argonne).</li>
	<li>להקליט את הנתונים "לטוס" כפי שתואר לעיל31.</li>
	<li>לקבוע ריכוז היסודות פרוסות המוח המכיל את LC באמצעות תוכנית מפות32,33.</li>
</ol>

<ol><li>Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+of+central+norepinephrine+neuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity.</a> Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).</li>
<li>Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+mapping+of+the+noradrenergic+projection+from+the+locus+coeruleus.+A+model+for+studies+of+brain+neuronal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways.</a> Neurology. 25, 223-233 (1975).</li>
<li>Olson, L., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+projections+from+the+locus+coeruleus+noradrealine+neurons%3A+the+cerebellar+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation.</a> Brain research. 28, 165-171 (1971).</li>
<li>Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+MCH-containing+fibers+in+the+feline+brainstem%3A+Relevance+for+REM+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation.</a> Peptides. , 50-61 (2018).</li>
<li>Semba, J., Toru, M., Mataga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-four+hour+rhythms+of+norepinephrine+and+serotonin+in+nucleus+suprachiasmaticus%2C+raphe+nuclei%2C+and+locus+coeruleus+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat.</a> Sleep. 7, 211-218 (1984).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537, 357-362 (2016).</li>
<li>Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+turnover+of+norepinephrine+in+the+rat+cerebral+cortex+during+stress%3A+role+of+the+locus+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus.</a> Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).</li>
<li>Sara, S. J., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+sensory+responses+of+locus+coeruleus+neurons+in+the+behaving+rat%3A+implications+for+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition.</a> Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).</li>
<li>Markevich, V. A., Voronin, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+reactions+of+sensomotor+cortex+neurons+to+stimulation+of+emotionally+significant+brain+structures%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhurnal+vysshei+nervnoi+deiatelnosti+imeni+I+P+Pavlova%22%5BJournal%5D)">Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures].</a> Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).</li>
<li>File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+role+of+the+locus+coeruleus+in+anxiety+and+agonistic+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour.</a> Brain research. 169, 411-420 (1979).</li>
<li>Pamphlett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+environmental+toxicants+by+the+locus+ceruleus%3A+a+potential+trigger+for+neurodegenerative%2C+demyelinating+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+hypotheses%22%5BJournal%5D)">Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders.</a> Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanin-sensitive+magnetic+resonance+imaging+features+of+the+substantia+nigra+and+locus+coeruleus+in+de+novo+Parkinson%27s+disease+and+its+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes.</a> European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).</li>
<li>Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+locus+coeruleus+catecholaminergic+neurons+in+the+chemosensory+control+of+breathing+in+a+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model.</a> Experimental neurology. , 172-180 (2017).</li>
<li>Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+loss+is+greater+in+the+locus+coeruleus+than+nucleus+basalis+and+substantia+nigra+in+Alzheimer+and+Parkinson+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases.</a> Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).</li>
<li>Chandley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+deficits+in+pontine+locus+coeruleus+astrocytes+in+men+with+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+psychiatry+%26+neuroscience+%3A+JPN%22%5BJournal%5D)">Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder.</a> Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).</li>
<li>Bernard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+glutamate+signaling%2C+growth+factor%2C+and+glia+genes+in+the+locus+coeruleus+of+patients+with+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression.</a> Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).</li>
<li>Gos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+hydroxylase+immunoreactivity+in+the+locus+coeruleus+is+elevated+in+violent+suicidal+depressive+patients%5BTitle%5D)+AND+%22European+archives+of+psychiatry+and+clinical+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients.</a> European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).</li>
<li>Bielau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+evidence+for+impaired+nitric+oxide+signaling+of+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Brain research. 1459, 91-99 (2012).</li>
<li>Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+and+serotonin+imbalance+in+the+locus+coeruleus+in+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Bipolar+disorders%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder.</a> Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).</li>
<li>Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Stress+Persistently+Alters+Locus+Coeruleus+Function+and+Anxiety-like+Behavior+in+Adolescent+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats.</a> Neuroscience. 373, 7-19 (2018).</li>
<li>Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dichotomy+in+spinal-+vs+prefrontal-projecting+locus+coeruleus+modules+splits+descending+noradrenergic+analgesia+from+ascending+aversion+and+anxiety+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>McCall, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRH+Engagement+of+the+Locus+Coeruleus+Noradrenergic+System+Mediates+Stress-Induced+Anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety.</a> Neuron. 87, 605-620 (2015).</li>
<li>Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticotropin-Releasing+Factor+Mediates+Pain-Induced+Anxiety+through+the+ERK1%2F2+Signaling+Cascade+in+Locus+Coeruleus+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons.</a> The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).</li>
<li>Simone, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethinyl+estradiol+and+levonorgestrel+alter+cognition+and+anxiety+in+rats+concurrent+with+a+decrease+in+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+locus+coeruleus+and+brain-derived+neurotrophic+factor+expression+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus.</a> Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).</li>
<li>Carter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nature. 13, 1526-1533 (2010).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosterone+administration+up-regulated+expression+of+norepinephrine+transporter+and+dopamine+beta-hydroxylase+in+rat+locus+coeruleus+and+its+terminal+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions.</a> Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).</li>
<li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+regulates+rest-activity+cycles+through+the+locus+coeruleus-norepinephrine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system.</a> Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).</li>
<li>Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+coeruleus%3A+neurobiology+of+a+central+noradrenergic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus.</a> Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).</li>
<li>Ralle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+at+a+Single+Cell+Level%3A+intracellular+copper+trafficking+activates+compartment-specific+responses+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).</li>
<li>Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. Franklin, K. B. J. , Boston, Amsterdam. (2013).</li>
<li>Bonnemaison, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper%2C+zinc+and+calcium%3A+imaging+and+quantification+in+anterior+pituitary+secretory+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics+%3A+integrated+biometal+science%22%5BJournal%5D)">Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules.</a> Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).</li>
<li>Nietzold, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+X-Ray+Fluorescence+Data+Using+MAPS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).</li>
<li>Vogt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPS%3A+A+set+of+software+tools+for+analysis+and+visualization+of+3D+X-ray+fluorescence+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+IV+France%22%5BJournal%5D)">MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets.</a> J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).</li>
<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+pathology+in+vulnerable+brain+regions+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+aging%22%5BJournal%5D)">Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease.</a> Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).</li>
<li>Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+dyshomoeostasis+in+Parkinson%27s+disease%3A+implications+for+pathogenesis+and+indications+for+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+science%22%5BJournal%5D)">Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics.</a> Clinical science. 130, London, England. 565-574 (2016).</li>
<li>James, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+preparation+methodologies+for+X-ray+fluorescence+microscopy+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).</li>
</ol>

כראוי המכוונת את הדגימה היא שלב קריטי פרוטוקול זה. מאחר ואנו משתמשים תכונות אנטומיות של המשטח הגבי של המוח כדי לאתר LC (הגבול בין המוח הקטן רקתי נחות), חשוב כי הסעיפים ליישר כהלכה. הדבר דורש טיפול בקביעת כראוי המוח לתוך מאטריקס מבצעה מוח העכבר. אנו ממליצים לחתוך ~ 500 μm יותר רקמות anterior ואת אחורי כדי LC כדי למנוע חסר הגרעין. הטעות הנפוצה ביותר היא לחתוך קטעים מעטים מדי כי התוצאות מפספס לחלוטין את LC. לפיכך, לראשונה אחד בעקבות פרוטוקול זה, אנו ממליצים לחתוך קטעים יותר מהדרוש. לימוד מעמיק של המוח אטלס תמונות לפני צביעת...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.

Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Coeruleus לוקוס (LC) הוא אזור חשוב לגזע המוח, האתר העיקרי של נוראפינפרין (NE) ייצור1. LC שולחת תחזיות ברחבי המוח2 קליפת המוח, ההיפוקמפוס של המוח הקטן3 , ולאחר מווסת תהליכים פיזיולוגיים העיקריים, כולל שעון ביולוגי4,5, תשומת לב, זיכרון6, להדגיש7, תהליכים קוגניטיביים8ו9,רגש10. תפקוד לקוי של LC היה מעורב והפרעות נוירולוגיות מנוטלי11, כולל פרקינסון מחלת12,13,14, מחלת אלצהיימר14, דיכאון15 16, ,17, הפרעה דו קוטבית18,19, ו חרדה20,21,22,23, 24. בהתחשב תפקידים אלה, ניתוח של LC הוא חיוני כדי ללמוד שלה ותפקוד לקוי.
עכברים נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים של הפיזיולוגיות תהליכים pathophysiologic. עקב גודלם הקטן, העכבר LC יש של קוטר ממוצע של μm ~ 300, שמוביל קושי באיתור המבנה. במהלך המוח חלוקתה, LC ניתן בקלות לוותר בסעיפים הילתית או הווריד. מחקרים זמין המתארת זיהוי של LC בבעלי חיים לא מציעים פרוטוקול צעד אחר צעד שאינו מומחה יכול לעקוב אחר1,25. לפיכך, להציע הדרכה והסבה של LC, נתאר את פרוטוקול שפיתחנו כדי לאתר אזור זה במוח העכבר עבור מספר יישומים (איור 1, איור 2, איור 3). הפרוטוקול חלה זיהוי חלוקתה, immunohistochemical המוח מבוקר בקפידה של דבח, מלך אקסום26,27, או לחילופין ה24, שני אנזימים מאוד מועשר בתמציות של LC28. ברגע LC ממוקם על-ידי אימונוהיסטוכימיה, המוח סמוך פרוסות יכול לשמש ללימודים נוספים, כולל ניתוח מורפולוגי, חילוף החומרים, כמו גם מתכת מחקרי הדמיה באמצעות קרני רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ (XFM)29. אנו מתארים XFM כדוגמה בפרוטוקול הזה (איור 3).

<table><tbody><tr><td>מטריצת פורס מוח של עכבר בוגר</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב, Alexa Fluor 488 (מקור - חמור)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית טעונות</td><td>Genesee</td><td>29-107</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 505E</td><td></td></tr><tr><td>להבי חיתוך קריוסטט</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MX35</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיני, 9.5 ס"מ</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>503241</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן דופמין ובטא;-הידרוקסילאז (DBH) - ייצור פנימי (מקור - ארנב)</td><td>B. אייפר</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן דופמין ובטא;-הידרוקסילאז (DBH) - זמין מסחרית (מקור - ארנב)</td><td>איתות תאים</td><td>8586</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות פלקון, 50 מ"ל</td><td>ארה"ב</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>מדעי פוראן (איזופלואורן)</td><td>בקסטר</td><td>NDC 1019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו אדסון</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>501245</td><td></td></tr><tr><td>מדיה הרכבה קשיחה</td>, <td>EM sciences</td><td>17984-24</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>פסקל</td><td>LSM 5</td><td></td></tr><tr><td>צלחות מרובות בארות, 24 בארות</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)</td> <td>VWR / טכנולוגיית רקמות</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA) / פורמלין 10%</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>תבניות הטבעה חד פעמיות Peel-A-Way</td><td>Polysciences Inc. </td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>מברשת</td><td></td><td></td><td></td>עיפרון</tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td> <td>Life Tech</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>אמזון</td><td>ASIN: B000CMFJZ2</td><td></td></tr><tr><td>מרית</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>14374</td><td></td></tr><tr><td>T פינים</td><td>אופיס דיפו</td><td>344615</td><td></td></tr><tr><td>מוח העכבר בקואורדינטות סטריאוטקסיות, Paxinos ופרנקלין, מהדורה שלישית</td><td>של אמזון</td><td>ISBN: 978-0123694607</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100 (להכנת PBSD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן טירוזין הידרוקסילאז (TH) (מקור - ארנב)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Ultralene סרט דק עבור XRF</td><td>SPEX Sample Prep</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שדה רחב</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr></tbody></table>

לוקליזציה של coeruleus לוקוס במוח העכבר

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Coeruleus לוקוס (LC) היא מרכז חשוב של נוראדרנלין לייצר נוירונים זה לווסת את מספר פונקציות פיזיולוגיים. מומים מבניים או פונקציונלי של LC להשפיע מספר אזורים במוח כולל קליפת המוח, ההיפוקמפוס של המוח הקטן, עשוי לתרום דיכאון, הפרעה דו קוטבית, חרדה, כמו גם מחלת פרקינסון, אלצהיימר. הפרעות אלה הקשורים לעתים קרובות עם misbalance מתכת, אך התפקיד של מתכות LC מובנת באופן חלקי בלבד. מחקרים מורפולוגיות ופונקציונליים של LC נחוצים כדי להבין טוב יותר את פתולוגיות האנושית ואת התרומה של מתכות. עכברים הם מודל ניסיוני בשימוש נרחב, אבל העכבר LC הוא קטן (~0.3 מ"מ קוטר), קשה לזהות שאינו מומחה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס אימונוהיסטוכימיה צעד אחר צעד כדי להתאים לשפה של LC במוח העכבר. דופמין-β-hydroxylase. דבח, (. מלך אקסום), לחלופין, טירוזין hydroxylase (ה), שני אנזימים מאוד שבאה לידי ביטוי LC, משמשים כסמני immunohistochemical פרוסות המוח. מקטעים סמוכים למקטעים המכילים LC יכול לשמש לצורך ניתוח נוסף, כולל היסטולוגיה מחקרים מורפולוגי, בדיקות מטבוליות, כמו גם הדמיה מתכת על ידי רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ (XFM).

שינויים הומאוסטזיס מתכת (כגון Cu, Fe, Zn, Mn) הם נצפו לעתים קרובות בהפרעות רגשיות ונוירולוגיות, לרבות שינויים LC34,35. לפיכך, קביעת רמות מתכת במוח הכרחי להבנה של מנגנוני המחלה. הסעיפים המוח שנוצרו באמצעות פרוטוקול המתואר ניתן לכמת את הרמות של Cu ומתכות אחרות LC ולהשוות אותם על הרמות באזורים מחוץ LC. (איור 3). בדוגמה שלנו, הפרוסה המוח זה נחתך באמצעות LC, פוספט, אשלגן, כלוריד, נחושת נמדדה. נחושת היחיד ה...

Coeruleus לוקוס יש מקבץ קטן של נוירונים מעורב במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להתכונן חלקים במוח העכבר מחקרים של חלבונים, מתכות בגרעין הזה.

לוקליזציה של Coeruleus לוקוס במוח העכבר

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

תפקוד לקוי של לוקוס קורוליאוס היה מעורב בהפרעות נוירולוגיות ונוירופסיכיאטריות, כולל מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, דיכאון, הפרעה דו קוטבית וחרדה. בהתחשב בתפקידים אלה, ניתוח של לוקוס coeruleus הוא חיוני כדי ללמוד את תפקודו ואת תפקוד לקוי. במהלך ניתוח המוח של העכבר, ניתן לפספס בקלות את הלוקוס קורוליאוס בחלקים של קורונטל או קשת בשל גודלו הקטן.לכן, כדי להציע הדרכה עבור לוקליזציה של לוקוס coeruleus, אנו מתארים פרוטוקול שפיתחנו כדי לאתר את האזור הזה במוח העכבר עבור מספר יישומים. התחל על ידי הצבת מוח מבודד טרי של עכבר הרדמה ולאחר מכן מנוון ב 4% PFA בצינור 50 מיליליטר. דגירה המוח במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.השתמש במקלפים כדי להעביר את המוח לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר מלא 25 מיליליטר של 30% פתרון סוכרוז. דגירה זה בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 עד 72 שעות עד המוח שוקע לתחתית הצינור. כדי להטמיע את החלק של גזע המוח, מניחים את המשטח החתוך שלו בתחתית תבנית הטבעה, ומוסיפים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית כדי להקיף את גזע המוח.להקפיא את המוח המוטבע במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות 12 שעות עד לשימוש נוסף. מניחים את התבנית עם המוח לתוך cryostat ו דגירה אותו במשך כמה שעות כדי להתאים את הטמפרטורה שלה לזה של קריוסטט. כדי לחשוף את בלוק OCT המכיל את המוח, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את ארבעת הקצוות של התבנית כל הדרך לתחתית, ולאחר מכן לקלף את התבנית הטבעה ממנו.השתמש בסכיני גילוח כדי להסיר עודף של OCT מפני השטח של הבלוק, הקפד לא לגעת במוח. ואז לעלות בלוק OCT על צ'אק של cryostat, חשיפת פני השטח החתוכים של המוח לכיוון החזית. כדי לכוונן את המוח, כוון את פני השטח החתוכים במקביל לסכיני הגילוח של ההקפאה.כוון נכון של הדגימה הוא צעד מכריע בפרוטוקול זה. מכיוון שאנו משתמשים בתכונות אנטומיות של פני השטח הגביים של המוח כדי לאתר LC, כגון גבול בין המוח הקטן לקוליקולוס נחות, חשוב שהקטעים יהיו מיושרים כראוי. זה דורש טיפול כראוי הגדרת המוח לתוך מטריצת כלי פריסה במוח העכבר.לקצץ את המוח החל medulla, חיתוך 100 מיקרומטר קטעים rostrally. לאחר המוח הקטן ואת brainstem להתחיל לחתוך כמו פרוסה רציפה אחת ברמה של החדר הרביעי, להתחיל לאסוף פרוסות בעובי 50 מיקרומטר. השתמש מדפים כדי לאסוף כל פרוסת מוח ול למקם אותו באר של צלחת 24 באר מלא PBS.לוקוס coeruleus יהיה בולט ביותר בפרוסה שבה המוח הקטן קוליקולוס נחות לפגוש אחד את השני על 5.52 מילימטרים האחורי של bregma. ביום הראשון, לשטוף את פרוסות המוח בצלחת 24 היטב שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד PBS. לאחר מכן הוסיפו 0.5% PBS עם חומר ניקוי וחלחלו אליהם בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.למחרת, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם 0.5% PBSD. לאחר מכן מוסיפים את הנוגדן העיקרי בדילול של 1 עד 500 ב 0.5% PBSD ודגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. ביום השלישי, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם 0.5% PBSD, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדן המשני בדילול של אחד עד 1000 ב 0.5% PBSD.עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ודגירה בארבע מעלות במשך 16 שעות. לאחר הדגירה, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם 0.5% PBSD, ולאחר מכן במשך חמש דקות PBS. לכסות את המקטעים באמצעות מדיום הרכבה קשה ללא DAPI.מכסים בכיסוי זכוכית ויבשים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ קונפוקל עם הגדרות כדי לזהות אות מאורך גל פלואורסצנטי מתאים לפרוסות מוח תמונה. לאחר התאמת המיקרוסקופ למישור המוקדי של פרוסת המוח, יש להשתמש בהגדלה פי 10 כדי לצלם תמונה אחת.השתמש בחדר הרביעי הממוקם מתחת למוח הקטן ומעל פונס ו גזע המוח כדי לאתר אזור LC אפשרי בפרוסת המוח. התמקדו בקצוות האופטיביים של החדר הרביעי וה- LC ימוקם החל משולי החדר הרביעי ויצביע לכיוון אזור גזע המוח של הפונס. התפלגות תאית של דופמין בטא הידרוקסילאז, חלבון לידי ביטוי LC, הוערך באמצעות פרוטוקול זה על מנת לחקור מורפולוגיה LC וצפיפות עצבית.חלבון אחר לידי ביטוי LC, טירוסין hydroxylase, הראה גם אות פלואורסצנטי ירוק חזק בפרוסות המוח המכיל את LC.Changes בהוקמפוס מתכת נצפו לעתים קרובות בהפרעות נוירולוגיות, כולל שינויים ב- LC.In דוגמה זו, כאשר פרוסת מוח לחתוך דרך LC נמדד עבור פוספט, אשלגן, אבץ, ונחושת, רק נחושת הראה עלייה ספציפית של האות. אנו ממליצים לחתוך סביב 500 מיקרון יותר רקמה לפני ו אחורי LC, כדי למנוע החמצת הגרעין, וחיתוך חלקים רבים יותר מהנדרש, במיוחד אם בפעם הראשונה ביצוע פרוטוקול זה. מחקר זהיר של תמונות אטלס המוח לפני הכתמים הוא מאוד מועיל.לאחר LC ממוקם על ידי immunohistochemistry, פרוסות המוח הסמוכות ניתן להשתמש למחקרים נוספים, כולל ניתוח מורפולוגי מטבולי, כמו גם מחקרי הדמיה מתכת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי רנטגן. חלקי המוח הנוצרים באמצעות הפרוטוקול המתואר יכולים לשמש לכימות רמות הנחושת ומתכות אחרות ב- LC ולהשוות אותן לרמות באזורים מחוץ ל- LC, אשר הכרחי להבנת מנגנון המחלה. יישומים אפשריים נוספים של פרוטוקול זה כוללים זיהוי של שפע והפצה תאית של דופמין בטא הידרוקסילאז, טירוסין הידרוקסילאז, וחלבונים אחרים לידי ביטוי LC בנפרד, או בבדיקות כתם משותף, מחקרים של מורפולוגיה LC וצפיפות עצבית.

localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

מקור: Xavier, A. L. R., et al. השתלת צינורית בבור המים של מכרסמים. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את הליך השתלת צינורית בבור המים של עכבר מורדם. הטכניקה כוללת הנחיית צינורית המותקנת על מחט דרך הדורה לתוך הבור המשולש ההפוך ואבטחתה לאספקה ממוקדת לנוזל השדרה.

השתלת צינורית לתוך Cisterna Magna במודל עכבר

סרטון זה מדגים הקלטה in vivo של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) מאזורי M2 דו-צדדיים במוח העכבר. עכבר מורדם מאובטח ומוכן להליך. כדי להקליט LFPs, הכנס מיקרואלקטרודות לקואורדינטות המטרה של אזורי M2 הדו-צדדיים, האחראים על תנועות מוטוריות מורכבות.

רישום פוטנציאל שדה מקומי משתי ההמיספרות של מוח העכבר

פרוטוקול זה מתאר את השימוש באימונוהיסטוכימיה לזיהוי אזורי לוקוס קורולאוס במקטעי מוח של עכברים. על ידי התמקדות בדופמין β-הידרוקסילאז עם נוגדנים ירוקים המסומנים בפלואורופור, נוירונים המייצרים נוראדרנלין מוצגים כפלואורסצנטיות ירוקה תחת מיקרוסקופ.

אימונוהיסטוכימיה לזיהוי אזור ה-locus coeruleus בחלקי מוח של עכברים

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית של סיבים כולינרגיים בגרעין הבסיסי של אזור מיינרט של מקטעי מוח של עכבר. הקטעים נחסמים ומטופלים בראשוני כנגד כולין אצטילטרנספראז, ואחריו נוגדנים משניים ביוטיניליים. מתווספים קומפלקסים של אבידין-ביוטין-פרוקסידאז, הנקשרים לנוגדנים משניים, ואחריהם המצע הכרומוגני. לאחר מכן החלקים מיובשים ומורכבים לפני ההדמיה מתחת למיקרוסקופ.

צביעה אימונוהיסטוכימית של סיבי עצב בגרעין הבסיסי של מיינר במוח העכבר

כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

אנו מציגים הקלטה vivo electroפיסיולוגית של פוטנציאל השדה המקומי (lfp) בקליפת המנוע הדו המשני (M2) של עכברים, אשר ניתן להחיל על הערכת האונה הצדדית. המחקר חשף רמות ששונו של סנכרון בין M2 שמאל וימין ב-APP/PS1 עכברים לעומת שולטת WT.

הערכה של החצי הכדור השני עם הקלטה הפוטנציאלי השדה המקומי בקליפת המנוע המשני של עכברים

כדי לוודא אם ההשפעות השליליות על הביצועים הקוגניטיביים כרוכות לוקוס הפעילות כפיית, שני פרוטוקולים מוצגים כי המטרה להעריך את היחסים האפשריים בין הביצועים הקשורים לפעילות שינויים בגודל התלמיד הנגרמת על ידי לעיסת. פרוטוקולים אלה עשויים להיות מיושם על תנאים שבהם התרומה כפיית לוקוס מהווה חשד.

הערכת שינויי האישון בליקום כפיית-עוררות בתיווך באמצעות גירוי מעורר

עם מניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות או אזורים במוח, התנהגות ניתן לשנות עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה בבעלי חיים נעים בחופשיות. באמצעות כלים אופטוגנטיים שונים בשילוב עם סיבים אופטיים מושתלים כרונית, ניתן לבצע מגוון של אפנון עצבי ובדיקות התנהגותיות.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

ניתוח סטריאוטקסי למיקוד אתרי מוח בעכברים כולל בדרך כלל גישה דרך עצמות הגולגולת ומונחה על ידי ציוני דרך בגולגולת. כאן אנו מתווים גישה סטריאוטקסית חלופית כדי להתמקד בגזע המוח הקאודלי ובחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ה-cisterna magna המסתמך על הדמיה ישירה של ציוני דרך של גזע המוח.

גישה כירורגית סטריאוטקסית למיקרו-איניג'קט גזע המוח הקאודלי וחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ציסטרנה מגנה בעכברים

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

למדו פרוטוקול מפורט לאיתור הלוקוס קוארולאוס במוח העכבר באמצעות חיתוך מדויק ואימונוהיסטוכימיה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי חלבונים ומטלים לחקר הפרעות נוירולוגיות.

לוקליזציה של Coeruleus לוקוס במוח העכבר

גלה סרטונים נוספים