Name: בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: למדו לבודד ולרצף מיקרו RNA חוץ-תאי מתאי גזע מזנכימליים אנושיים. פרוטוקול זה מציג שיטה אמינה לבניית ספריית RNA קטן ושיפור תוצאות ריצוף דור הבא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים על מר קלאוס אוטובוס, גב' ריטה Rosendahl-iNANO לסיוע טכני שלהם. תודה מיוחדת ד ר דניאל Otzen להתרת השימוש שלו ultracentrifuge תכופים. מחקר זה נתמך על ידי קרן חדשנות דנמרק (מסדר פרוייקט).

הערה: מדיום הגידול של תא גזע Mesenchymal (MSC מדיה) מוכן מראש כמצוין בטבלה של חומרים.
1. תרבית תאים
הערה: ניתן לקבל גזע אנושי mesenchymal מח העצם, רקמת שומן או מקורות אחרים11. לחלופין, ניתן לקנות hMSCs דרך הספק. BMSCs בשימוש פרוטוקול זה נגזר ממח העצם של חולים, קנה מחברה.
<ol><li>הפשרת עונה 1 פרק 106 BMSCs לתוך בקבוקון T175 המכיל 20 מ של מדיה MSC. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולהחליף את המדיה כל 2-3 ימים עד 80% confluency.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 5 מ של 1 x PBS וזורקים את PBS.</li>
	<li>לנתק את התאים על-ידי הוספת 5 מ של 0.05% טריפסין-EDTA, המקננת את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C. הקש על צידי הבקבוק כדי להקל על ניתוק.</li>
	<li>להוסיף 15 מ"ל של מדיה MSC כדי להשבית את טריפסין, לנתק את התאים מן השטח, והוא פיפטה למעלה ולמטה כדי להשיג את המתלים תא בודד.</li>
	<li>לאסוף את התאים שפופרת 50 מ ל ו ספין למטה בשביל 5 דקות ב x 300 גרם כדי הצניפה התאים.</li>
	<li>Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיה MSC ולספור את התאים באמצעות hemocytometer. הערה: ראשי אנושיים מוח העצם MSCs ב 80% confluency בבקבוקון T175 הוא בסביבות 2 x 106 תאים.</li>
	<li>HMSCs צלחת-2,000 תאים/cm2 בתקשורת MSC טריים ב- 5 מבחנות T175. לגדל את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולהחליף את המדיה כל 2-3 ימים עד 5 מבחנות של 90% confluent T175 מבחנות מתקבלים.</li>
</ol>2. EVs ואוסף מולקולות RNA-הקשורים
הערה: EV אוסף המדיה הוא הכין מראש (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco [DMEM] עם 10% סרום שור בעובר [FBS] ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין [P/S]). EV אוסף המדיה מדיה MSC נורמלי, אך המוכנים FBS מדולדל EV מסחרי (טבלה של חומרים). זה כדי למנוע זיהום exRNA שור מ FBS, אשר בדרך כלל מכילה exRNAs המשויך EVs ribonucleoproteins, lipoproteins. הכנה קטנה RNA ספריה, נדרשים exRNAs נגזר 5 מבחנות confluent של MSCs כדי לאפשר בניית ספריה.
<ol><li>לשטוף את התאים 3 x עם 20 מ של PBS לכל T175 את הבקבוק. הוסף 20 מ של EV אוסף המדיה לכל confluent T175 הבקבוק של MSCs, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות.</li>
	<li>לאסוף את המדיה ואת centrifuge את המדיה עבור 10 min ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע, centrifuge את המדיה עבור 20 min ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע, centrifuge את המדיה עבור 30 min ב 15,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. ואז לאסוף את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להעביר את המדיה ultracentrifuge צינורות, גלולה את exRNAs במשך 90 דקות ב-100,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. רוטור זווית קבועה משמש כאן ומעוגן בגדר לצד של הצינור. לסמן את הצד של המכסה וצייר מעגל בצד הצינור בו צפוי בגדר.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, יבש הפנימי של הצינור על ידי היפוך הצינור על נייר סופג ולהשתמש חתיכות קטנות של נייר סופג כדי להסיר את הנוזל בתוך הצינור מבלי לגעת התחתון של הצינור. Resuspend בגדר בμl 200 ל- PBS על ידי vortexing ב-30 s ו- pipetting לאורך 20 x.</li>
	<li>להעריך את EVs ואת מולקולות עם nanoparticle מעקב ניתוח (נ) (איור 2). הערה: EVs של מולקולות יכול להידרש עם nanoparticle מעקב ניתוח (נ), פיזור אור דינאמי (DLS) או הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)12.</li>
	<li>לאחסן את EVs ואת מולקולות ב-80 מעלות צלזיוס עד נוסף במורד הזרם ניסויים. הערה: אם EVs עומדים לשמש ללימודי פונקציונלי, 20% גליצרול להתווסף כדי להגן עליהם מפני קריעה. ניתן לאסוף את התאים באמצעות הליכים סטנדרטיים במידת הצורך.</li>
</ol>3. EVs ואוסף מולקולות RNA-הקשורים תאים
הערה: EVs ו- RNA הקשורים מולקולות ניתן גם שנאסף מהתקשורת התרבות התא ואילו התאים עוברים התמיינות. הדוגמה מתואר בפרוטוקול מתאר בידול osteoblastic ואוסף exRNA ביום 0 ו- 7 של בידול. אם אין בידול נדרשת, לאחר מכן לדלג על סעיף 3, ללכת בסעיף 4.
<ol><li>להכין בידול osteoblastic מדיה (DMEM עם 10% FBS, 1% P/S, β-glycerophosphate 10 מ מ, 10 nM דקסאמתאזון, 50 μM ascorbate-2-פוספט ו 10 מ מ 1.25-ויטמין-D3) טריים בכל פעם.</li>
	<li>לאחר MSCs 80% confluent, לשנות את המדיה MSC בידול osteoblastic מדיה.</li>
	<li>לחדש את המדיה בידול osteoblastic לאחר 2-3 ימים.</li>
	<li>ביום 5 של בידול, להסיר את המדיה ותרחץ התאים 3 x עם 20 מ של PBS לכל T175 את הבקבוק.</li>
	<li>הוסף 20 מ של EV אוסף המדיה המכילה 10 מ מ β-glycerophosphate, 10 ננומטר דקסאמתאזון, 50 μM ascorbate-2-פוספט ו- 10 מ מ 1.25-ויטמין-D3 לכל confluent T175 הבקבוק של MSCs. Incubate התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות על מנת להבטיח המשך בידול תוך איסוף EVs של מולקולות.</li>
	<li>לאסוף את המדיה על יום 7 והמשך כדי לבודד את EVs ואת מולקולות כמתואר בצעדים 2.2-2.6.</li>
	<li>עבור בקרת איכות, זרע תאים 96-ולס או 6-ולס להעריך בידול באמצעות assay פעילות של phosphatase אלקליין (ALP) או עם תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), בהתאמה. הערה: איור 3 הוא דוגמה מציג osteogenic התמיינות של התאים.</li>
</ol>4. RNA החילוץ ובקרת איכות
<ol><li>הפשרת דגימות שלב 2.8 על קרח. תמצית ה-RNA באמצעות ערכת בידוד ה-RNA (טבלה של חומרים).</li>
	<li>Elute את הרנ א מן העמודה המסופק בערכה בידוד ה-RNA (טבלה של חומרים) בμl 100 RNase ללא מים.</li>
	<li>לרכז את הרנ א באמצעות אתנול משקעים על-ידי הוספת 1 μL של גליקוגן, 10 μL של 2 מ' pH 5.5 סודיום אצטט μL 250 של אתנול 99% מראש צונן לתוך μL 100 של RNA מטוהרים.</li>
	<li>דגירה בדגימות ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לזרז את הרנ א. גלולה את הרנ א מאת צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. הערה: בגדר הוא לבן עקב משקעים שיתוף עם גליקוגן.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר RNA עם 1 מ"ל של 75% אתנול. גלולה את הרנ א שוב במשך 5 דקות ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להסיר האתנול ולהשאיר המכסה של הצינור RNA פתוח למשך 5-10 דקות אוויר יבש בגדר RNA. Resuspend בגדר RNA ב μL 7 RNase ללא מים.</li>
	<li>בדוק את איכות ה-RNA ואת ריכוז בעזרת מכונה מבוססי שבב אלקטרופורזה נימי כדי לזהות את הרנ א על פי הפרוטוקול של היצרן לפני הבנייה הספרייה. הערה: התפלגות גודל נציג של RNA מוצג באיור4.</li>
	<li>תמצית RNA הסלולר באמצעות ערכת טיהור מסחרי (טבלה של חומרים) במידת הצורך.</li>
</ol>5. ספריית בנייה ובקרת איכות
הערה: ספריות RNA קטנים בנויים באמצעות ערכות מסחריות (טבלה של חומרים) עם התאמות בשל הרנ א נמוכה קלט. ספריית בנייה מתבצע על הבלוק צוננת.
<ol><li>להרגיע את בלוק חימום עבור 0.2 מ"ל המבחנות על קרח, פיפטה 5 μL של RNA מהשלב 4.6 לתוך 0.2 מ"ל נטולת RNase המבחנות על גוש צוננת.</li>
	<li>לדלל 3' מתאמי (1:10) במים נטולי RNase בשפופרת 0.2 מ"ל נטולת RNase PCR. להוסיף 0.5 μL של מתאם מדולל ולערבב עם 5 μL של RNA על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x ו צנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורית.</li>
	<li>דגירה המיקס מתאם ה-RNA ו- 3' ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה תרמיות preheated ולאחר מכן מקם את הדגימה בשכונה צוננת.</li>
	<li>להוסיף 1 μL מאגר מצדו, 0.5 μL של מעכב RNase ו- 0.5 μL של T4 RNA ליגאז (מחיקה מוטציה) לתערובת מתאם ה-RNA ו- 3'. לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה.</li>
	<li>דגירה הצינור ב 28 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated.</li>
	<li>להוסיף 0.5 μL של להפסיק פתרון לאמבטיה מדגם עם הצינור שוהה הצנטרפוגה תרמי, לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, להמשיך דגירה-28 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
	<li>לדלל 5' מתאמי (1:10) במים נטולי RNase בשפופרת 0.2 מ"ל נטולת RNase PCR. להוסיף 0.5 μL של 5' מתאם נפרד ללא RNase 0.2 מ ל PCR צינור חום מתאם 5' ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה תרמיות preheated, ולאחר מכן מקם את הדגימה על הבלוק צוננת.</li>
	<li>להוסיף 0.5 μL של 10 ננומטר ATP, 0.5 μL של T4 RNA ליגאז כדי 5' מתאם צינור, לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה לאיסוף הנוזלים לתוך החלק התחתון. הערה: לשמור את מתאם 5' ברחוב צוננת ככל האפשר.</li>
	<li>להוסיף 1.5 μL של מתאם תערובת 5' לדגימת מהשלב 5.6, לערבב בעדינות על ידי pipetting 8 x לאט. דגירה המדגם ב 28 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated.</li>
	<li>לדלל RT פריימר 1:10 במים נטולי RNase צינור PCR נטולת RNase 0.2 מ"ל. להוסיף 0.5 μL של פריימר RT מדולל הדוגמה מהצעד 5.9, לערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x לאט, צנטריפוגה בקצרה.</li>
	<li>דגירה המדגם-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה התרמי preheated ולאחר מכן מקם את הדגימה על גוש צוננת.</li>
	<li>להוסיף 1 μL של 5 x הראשון מאגר סטרנד, 0.5 μL של מיקס dNTP 12.5 מ מ, 0.5 μL של 100 מ מ dithiothreitol (DTT), 0.5 μL של RNase מעכב, 0.5 μL של רוורס טרנסקריפטאז. לערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x לאט, צנטריפוגה בקצרה.</li>
	<li>דגירה המדגם ב 50 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated להשיג cDNA.</li>
	<li>בוזקים cDNA μL 4.25 מים הנדסה גנטית, μL 12.5 של PCR מיקס, μL 1 של אינדקס פריימר, μL 1 של פריימר אוניברסלי. לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה.</li>
	<li>למקם את הדגימה הצנטרפוגה תרמי ולהגדיר הצנטרפוגה כדלקמן: 98 ° C ל 30 s; 15 מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 ° C 15 s; סוף המחזור עם 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות הערה: הספרייה מוכן שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך שבוע.</li>
	<li>לטהר את ספריית ה-RNA על-ידי הפרדת את הספרייה על ג'ל DNA וחיתוך הג'ל (ג'ל מיצוי) בין 140 bp ל-160 bp וחברת eluting הספרייה של הג'ל בעקבות פרוטוקול שניתנו על ידי ערכת בנייה הספרייה. הערה: במחקר זה, הספרייה מוכן מהשלב 5.15 טעון על גבי ג'ל מסחרי (טבלה של חומרים) ואת הספריה בין 140 bp ל-160 bp מטוהר בחוץ על ידי ממוכנת DNA גודל fractionator (טבלה של חומרים) על פי הפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>להתרכז לשטוף את הספריה משלב 5.16 באמצעות מבוססי עמודה PCR ערכת טיהור (טבלה של חומרים), elute הספרייה 10 μL נטולת RNase מים סוף סוף.</li>
	<li>לטעון μL 1 של הספרייה מטוהרת על גבי שבב דנ א (טבלה של חומרים) כדי לבדוק את גודל הספרייה ע פ הפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>למהול 1 μL של הספרייה מטוהרים (1:1000) ב- 10 מ מ pH 8.0 טריס-HCl עם 0.05% polysorbate 20 ולכמת את ספריית מאת qPCR באמצעות ערכת כימות ספריית מסחרי לכמת את הריכוז הספרייה באמצעות הסטנדרטים DNA בערכה.</li>
	<li>בריכה שווה כמויות של ספריות בהתאם לדרישות של המכונה רצף, רצף על מערכת רצף תפוקה גבוהה. הערה: הקמת ספריה הסלולר RNA יכול להיעשות באמצעות ערכות אותו לפי הפרוטוקול הסטנדרטי של ערכות.</li>
</ol>6. ביואינפורמטיקה צינור
הערה: זהו צינור ללא צורך במיקור חוץ ואת התוכניות המשמשות כאן מופיעים ברשימה טבלה של חומרים.
<ol><li>לקצץ משם באיכות נמוכה קריאות מתאם רצפים ולהסיר קריאות raw.</li>
	<li>למפות את קריאות נקי סוגים שונים של RNAs.<ol>
<li>ביאור tRNAs על-ידי מתן אי-התאמות שני כי הרצפים tRNA שונה במידה רבה לגרום misincorporation הבסיס בתדירות גבוהה על-ידי רוורס טרנסקריפטאז.</li>
		<li>ביאור miRNAs על ידי מיפוי אנוש miRNAs מ miRBase v21 המאפשר אי-התאמות אפס. מאז miRNAs כפופים A ו U nontemplated 3' סוף תוספות, רצפים שאינן ממופות הם 3' גזוז של עד שלושה A ו/או T nts אחרי אשר ממופים קריאות אנוש miRNAs ו אחרים miRNAs מ miRBase v21 המאפשר אי-התאמות אפס.</li>
		<li>ביאור על אחרים רלוונטיים RNAs קטן (snRNA, snoRNA, שמריהו ו Y RNAs) בכך שהוא מאפשר התאמה אחת.</li>
		<li>למפות את קריאות לא ממופים הנותרים RNA ארוכה datasets (rRNA, אחרים RNA Rfam, ואת ה-mRNA) כדי להעריך השפלה.</li>
		<li>להוסיף את רצפי הגנום האנושי.</li>
		<li>להוסיף את רצפי הגנום חיידקי.</li>
		<li>לנרמל את הביטוי miRNA באמצעות הנוסחה הבאה: miRNA נחשב / סה כ נחשב של כל miRNAs ממופה) x 106.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity%2C+function+and+applications+of+RNA+in+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">The complexity, function and applications of RNA in circulation.</a> Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).</li>
<li>Koberle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Stability+of+Cell-Free+Circulating+microRNAs%3A+Implications+for+Their+Utilization+as+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers.</a> Plos One. 8 (9), e75184(2013).</li>
<li>Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+circulating+non-coding+RNAs+-+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances%2C+challenges%2C+and+opportunities+in+extracellular+RNA+biology%3A+insights+from+the+NIH+exRNA+Strategic+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop.</a> JCI Insight. 3 (7), (2018).</li>
<li>Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+cell-cell+communication+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: cell-cell communication function.</a> Frontiers in Genetics. 4, 119(2013).</li>
<li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3292(2014).</li>
<li>Zangari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+decay+of+engulfed+extracellular+miRNA+by+XRN1+exonuclease+promotes+transient+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition.</a> Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).</li>
<li>Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html">https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html</a> (2018).</li>
<li>NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf">https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf</a> (2018).</li>
<li>Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Potential+of+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+and+Their+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles.</a> Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).</li>
<li>Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+-+current+trends+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective.</a> Bioscience Reports. 35 (2), (2015).</li>
<li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Methods+of+Choice+for+Extracellular+Vesicles+%28EVs%29+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biases+in+small+RNA+deep+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Biases in small RNA deep sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).</li>
<li>Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomal-miRNAs+are+critical+factors+for+inducing+anti-proliferation+signalling+to+A2780+and+SKOV-3+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 38498(2016).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Asghar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomonas+sp+is+a+Novel+Cell+Culture+Contaminant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור רצף הדור הבא של exRNAs המאפשרת ניתוח דיפרנציאלית ביטוי מדגימות קלט נמוך. הקפדה על פרוטוקול ספציפי לבידוד EV ו exRNA חשוב כי שינויים קטנים אפילו (קרי, השלב ultracentrifugation או שינוי בסוג רוטור) יכולים להשפיע על transcriptome, miRNA רמות13,14'. לפיכך, ללא קשר איך exRNA הוא מבודד, חשוב להחיל את ההליך ניסיוני, bioinformatic על כל הדגימות בניסוי כדי שניתן יהיה להשוות את התוצאות.
RNA שלמות בדרך כלל שקובעת-...

חוץ-תאית ופיזור RNAs (exRNAs) הן נוכח נוזלי גוף שונים עמידים לכיוון RNases1,2. שפע גבוהה, היציבות וקלות הנגישות שלהם הם אטרקטיביים להערכה קלינית סמנים אבחון ו prognostic3. מצב התחבורה עבור exRNAs כוללים חוץ-תאית שלפוחית (EVs), שיוך lipoproteins (כגון ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה; HDL) ואת מתחמי ribonucleoprotein (כגון עם מתחמי Argonaute2)4.
תת-קבוצה של exRNAs הם מיקרו Rna (miRNAs), אשר הם קטנים ללא קידוד RNAs של 22 nt המווסתים ביטוי גנים posttranscriptional. לשעבר-miRNAs היו מעורבים תקשורת ורגולציה של הומאוסטזיס תא5. לדוגמה, ה-HDL מספק לשעבר-מיר-223 לתאי אנדותל להדחיק אדהזיה המערכת מולקולה 1 (ICAM-1) ודלקת6. מעניין, מיר-223 גם נתפסת מועבר על ידי שלפוחית חוץ-תאי של לויקוציטים לתאי סרטן ריאות, תכנות אותם לקחת על פנוטיפ פולשניים יותר7. לפיכך, transcriptome של לשעבר-miRNAs מ בנוזלי הגוף השונים, תא תרבות בינוני ישפרו הבנתנו לשעבר-miRNA איתות.
RNA קטנים רצף (seq RNA קטנים) הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי להבין את transcriptomics של RNAs קטן. לא רק דוגמאות שונות ניתן להשוות בין ביטוי באופן שונה RNAs ידוע, אבל הרומן RNAs קטן גם ועוזרת מאופיין. כתוצאה מכך, זה גם שיטה חזקה כדי לזהות באופן שונה ביטוי miRNAs בתנאים שונים. עם זאת, אחד הקשיים של seq RNA קטנים הוא הקושי ליצירת ספריות seq RNA קטנות של נוזלים קלט exRNA נמוך כמו נוזלים מוחי שדרתי, רוק, שתן, חלב, סרום ומדיה תרבות. פרוטוקול TruSeq RNA קטנים הספרייה במכינה מ אילומינה דורש כ 1 µg של RNA סך באיכות גבוהה ודורשת פרוטוקול NEBNext קטן RNA הספרייה במכינה להגדיר מ ניו אינגלנד Biolabs 100 µg ng-1 /8,רנ א9. לעיתים קרובות, RNA הכולל מדגימות אלו הם מתחת למגבלה זיהוי עבור מכשירים UV-vis קונבנציונלי.
לשעבר-miRNAs נגזר נוזלי הגוף הם סמנים prognostic ואבחון פוטנציאל טוב. עם זאת, על מנת לחקור את ההשפעות פונקציונלי או כדי לקבוע את מקור ספציפי לשעבר-miRNAs, מערכות התרבות תאים משמשים לעתים קרובות במקום. גזע mesenchymal (MSCs) נחקרו בהרחבה כי היו מעורבים שלהם EVs שיכוך במחלות רבות, כולל אוטם שריר הלב, מחלת אלצהיימר, שתל מול מארח מחלות10. כאן, נדגים הטיהור של לשעבר-miRNAs מ MSCs הנגזרות מח העצם (BMSCs) והשלבים ספציפיים השתמשו כדי לייעל הבנייה ספריית RNA קטנים, רצף וניתוח נתונים (איור 1).

<table><tbody><tr><td>תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח עצם</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-012</td><td>תאים המשמשים בפרוטוקול זה נקנו מ-ATCC</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>המכונה מדיום גידול תאי גזע מזנכימליים (מדיה MSC)</td></tr> <tr><td>מדולל אקסוזום FBS</td><td>Gibco</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>ExRNA מדיה לאיסוף מדיה: MSCGM אך עם FBS מוחלף ב-FBS</td><td></td><td></td> מדולדל אקסוזום<td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>T175 בקבוק</td><td>Sarstedt</td><td>833,912</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח סיגמא</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקבוק פוליקרבונט בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עם מכלול פקק</td><td>בקמן קולטר</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>בקמן קולטר סוג 60 Ti</td><td></td><td></td><td>רוטור בשימוש כאן</td></tr><tr><td>NucleoCounter</td><td>Chemometec</td><td>NC-3000</td><td>Cell Counter</td></tr><tr><td>&-glycerophosphate</td><td>Calbiochem</td><td>35675</td><td>רכיבים של אמצעי ההתמיינות האוסטיאוגני</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td>רכיבים של אמצעי ההתמיינות האוסטיאוגנית</td></tr><tr><td>2-פוספו-L-אסקורבי&nbsp; מלח טריסודיום חומצי</td><td>Sigma</td><td>49752-10G</td><td>רכיבים של אמצעי ההתמיינות האוסטיאוגני</td></tr><tr><td>1&alpha;,25-Dihydroxyvitamin&nbsp; D3</td><td>Sigma</td><td>D1530-1MG</td><td>רכיבים של מדיית ההתמיינות האוסטיאוגנית</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>miRNA וערכת טיהור RNA כוללת לשלב 4.8</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1514</td><td>מכונת אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב ושבבים לניתוח RNA ו-DNA</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>מכונת אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב ושבבים לניתוח RNA ו-DNA</td></tr><tr><td>ערכת DNA ברגישות גבוהה של Agilent</td><td>Technologies</td><td>5067-4626</td><td>מכונת אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב ושבבים לניתוח RNA ו-DNA</td></tr><tr><td>ערכות כימות ספריית KAPA Roche</td><td></td><td>KK4824</td><td>ערכת כימות ספרייה המשמשת כאן</td></tr><tr><td>ערכת הכנה לספריית RNA קטנה של TruSeq -Set A (24 rxns) (סט A: אינדקסים 1-12)</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td>ערכת הכנה לספריית RNA קטנה המשמשת בפרוטוקול זה - משמשת בשלב 5</td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td>מחלץ ג'ל DNA אוטומטי המשמש בפרוטוקול זה; ניתן לבצע מיצוי ידני גם</td></tr><tr><td>MinElute PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>PCR בשלב 5.17</td></tr><tr><td>FASTX_Toolkit</td><td>מעבדת</td><td></td> קולד ספרינג הארבור <td>זמירה קריאות באיכות נמוכה בשלב 6</td></tr><tr><td>cutadapt</td><td></td><td></td><td>הסרת מתאם בשלב 6</td></tr><tr><td>עניבת</td><td></td><td></td> פרפר <td>מיפוי של קריאות נקיות בשלב 6</td></tr><tr>Samtools <td>כדי ליצור את פרופיל הביטוי בשלב 6</td><td>Bedtools</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>כדי ליצור את פרופיל הביטוי בשלב 6</td></tr></tbody></table>

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו rna חוץ-תאי של גזע mesenchymal אנושי

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

RNAs חוץ-תאית, מחזורי (exRNA) מיוצרים על ידי סוגי תאים רבים של הגוף, קיימים רבים בנוזלי גוף שונים כגון, פלזמה, סרום, חלב שתן ורוק. תת-קבוצה אחת של אלה RNAs הן הרגולטורים posttranscriptional – מיקרו Rna (miRNAs). להתוות את miRNAs המיוצר על ידי סוגי תאים ספציפיים, מערכות התרבות במבחנה ניתן לקצור, פרופיל exRNAs נגזר ערכה אחת של תאים. הגורמים המופרש של גזע mesenchymal הם מעורבים שיכוך במחלות רבות ומשמשת כמערכת מודל במבחנה כאן. מאמר זה מתאר את התהליך של איסוף, טיהור של RNA קטנים, ספריית לדור רצף miRNAs חוץ-תאית. ExRNAs ממדיה תרבות שונים מ- RNA הסלולר על ידי כך נמוך דגימות קלט של RNA, שלאיראן נהלים מיטביים. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף כדי exRNA קטן רצף ממדיה תרבות, מציג בקרת איכות מחסומים בכל שלב במהלך טיהור exRNA ורצף.

השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה ממוטבת כדי לאסוף exRNA מתרבות MSC עבור רצף הדור הבא. המזימה של זרימת העבודה באיור 1 בצד השמאל, המחסומים בקרת איכות המתאימים נמצאים בצד הימין.
המורפולוגיה של תאי ביום של אוסף עבור מובחן (איור 3 א), מבודלים (איור 3B) והתאים מוצגים. יתר על כן, נציג מנורמל רמות של ALP פעילות של תאים המושרה במשך 7 ימים גם מוצגים (<str...

פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

זהו המאמר הראשון המטפל בבעיות טכניות ברצף RNAs קטנים הנגזרים מנוזלים חוץ-תאיים מתאים. דגימות NGS דורשות הכנה מחמירה ובקרת איכות. בשל אופי של כלי רכב חשמליים, תהליך QC של דגימות EV חורג מהנורמה.היתרון של פרוטוקול זה הוא שלבי QC בו עבור משתמשים בפעם הראשונה. הדגימה של ההליך תהיה ג'וני סו, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, צלחת תאי גזע mesenchymal אנושי ב 2, 000 תאים לסמטר מרובע במדיה MSC טריים בחמישה בקבוקונים T175.לאחר מכן לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני ולהחליף את המדיה כל יומיים עד שלושה ימים, עד חמישה בקבוקונים של 90% תאים confluent מתקבלים. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 20 מיליליטר של PBS לכל בקבוק. הוסף 20 מיליליטר של מדיה אוסף EV לתוך כל בקבוקון.ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. לאסוף את התקשורת צנטריפוגה זה במשך 10 דקות ב 300 גרם וארבע מעלות צלזיוס. ואז לאסוף את supernatant, ו צנטריפוגה התקשורת במשך 20 דקות ב 2, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.לאסוף את supernatant שוב, צנטריפוגה התקשורת במשך 30 דקות ב 15, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant בפעם האחרונה. לאחר מכן, העבר את התקשורת לצינורות אולטרהצנטריפוגה.רוטור זווית קבועה 60Ti משמש כאן, ואת גלולה יהיה מעוגן בצד של הצינור. סמן את הצד של המכסה שבו גלולה צפויה, ולצייר עיגול בצד של הצינור שבו גלולה צפויה. ו גלולה exRNAs במשך 90 דקות ב 100, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.לאחר הצנטריפוגה הסופית, הסר את העל-טבעי. השתמש חתיכות קטנות של נייר סופג לייבש את החלק הפנימי של הצינור מבלי לגעת בחלק התחתון של הצינור. ואז להפוך את הצינור על נייר סופג.כדי להשתמש מחדש את גלולה, להוסיף 200 microliters של PBS לתוך כל צינור, ומערבולת הצינור במשך 30 שניות. פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים. לאחר מכן להעריך את הווסקולים החוץ-תאיים וביומולקולות אחרות עם ניתוח מעקב חלקיקים.ולאחסן את גלולה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד ניסויים נוספים. לאחר הפשרת הדגימות, השתמש בערכת בידוד RNA כדי לחלץ RNA בהתאם לפרוטוקול היצרן. אלוט RNA מהטור המסופק בערכת בידוד RNA ב 100 microliters של מים ללא RNAse.כדי לרכז את ה-RNA באמצעות משקעים אתנול, להוסיף מיקרוליטר אחד של גליקוגן, 10 microliters של pH-5.5 נתרן אצטט שני טוחן, ו 250 microliters של 99% אתנול מקורר מראש לתוך 100 microliters של RNA מטוהרים. ואז להדגיר את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס לילה כדי לזרז את RNA. כדי גלולה RNA, צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 16, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להסיר את supernatant, ולשטוף את גלולת RNA עם מיליליטר אחד של 75%אתנול. צנטריפוגה שוב במשך חמש דקות ב 16, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה RNA. הסר את האתנול, ולהשאיר את המכסה של צינור RNA פתוח במשך חמש עד 10 דקות כדי לייבש את האוויר גלולת RNA.השתמשו שוב את גלולת ה-RNA בשבעה מיקרוליטרים של מים נטולי RNAse, ולהשתמש במכונת אלקטרופורזה נימית מבוססת שבב כדי לזהות את האיכות והריכוז של ה-RNA. כדי להתחיל בבניית הספרייה, פיפטה חמישה מיקרוליטרים של ה-RNA לתוך צינור PCR מקורר מראש 0.2 מיליליטר. לאחר מכן, לדלל 3'מתאמים במים ללא RNAse ביחס נפח של 1 עד 10.הוסף 0.5 microliters של המתאם מדולל לתוך צינור RNA, ו pipette את התערובת למעלה ולמטה שמונה פעמים. צנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינור. דגירה תערובת מתאם RNA ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות במחזור תרמי שחומם מראש.ואז למקם את המדגם בחזרה על הבלוק מקורר. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של מאגר הרצועות, 0.5 מיקרוליטרים של מעכבי RNAse ו-0.5 מיקרוליטרים של ליגאז T4 RNA לתערובת מתאם ה-RNA. פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים, וצנטריפוגה לזמן קצר.ואז דגירה הצינור ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת במחזור התרמי שחומם מראש. לאחר מכן, להוסיף 0.5 microliters של פתרון עצירה לתוך הצינור מדגם, עם הצינור להישאר רוכב האופניים התרמי. פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים, וממשיכה להידגר ב-28 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.לדלל מתאמים 5'במים ללא RNAse ביחס נפח של 1 עד 10. הוסף 0.5 מיקרוליטר של המתאם המדולל לצינור PCR נפרד של 0.2 מיליליטר. מחממים את ה-5 ב-70 מעלות במשך שתי דקות.ואז מניחים את הדגימה על הבלוק המצונן. הוסיפו 0.5 מיקרוליטרים של ATP של 10 ננומול ו-0.5 מיקרוליטרים של רצועת ה-T4 RNA לצינור המתאם 5'. פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים.וצנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזלים לתחתית. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מיקרוליטרים של תערובת ה-5 אינץ' לדגימה של ה-RNA. פיפטה פי שמונה בעדינות רבה, ודגירה את המדגם ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.כדי להשיג cDNA, לדלל את פריימר תעתיק הפוך במים ללא RNAse ביחס נפח של 1 עד 10. הוסף 0.5 microliters של פריימר מדולל לתוך מדגם RNA, פיפטה שמונה פעמים בעדינות רבה, צנטריפוגה בקצרה. לאחר מכן הדגירה את RNA ואת תערובת פריימר ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות במחזור התרמי שחומם מראש.ואז מניחים את הדגימה על בלוק מצונן. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של חיץ סטרנד ראשון 5X, 0.5 מיקרוליטרים של תערובת DNTP 12.5 מילימולאר, 0.5 מיקרוליטרים של DTT 100 מילימולאר, 0.5 מיקרוליטרים של מעכב RNAse, ו 0.5 מיקרוליטר של תעתיק הפוך לתוך צינור המדגם. פיפטה שמונה פעמים בעדינות רבה.וצנטריפוגה לזמן קצר. דגירה המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת במחזור התרמי שחומם מראש. לאחר מכן, הוסיפו 4.25 מיקרוליטרים של מים אולטרה-יציבים, 12.5 מיקרוליטרים של תערובת ה-PCR, מיקרוליטר אחד של פריימר האינדקס ומיקרוליטר אחד של פריימר אוניברסלי לדגימה של CDNA.פיפטה למעלה ולמטה שמונה פעמים, וצנטריפוגה לזמן קצר. לבסוף, מניחים את המדגם במחזור תרמי, ולהגדיר את העגל על פי כתב היד. כדי לטהר את ספריית ה- RNA, השתמש בשבר גודל דנ"א אוטומטי כדי להפוך את הרצועות בין 140 ל- 160 זוגות בסיסים.הפעל את הספריה שחולצו על ערכת טיהור PCR מבוססת עמודה, והטיף את הספריה ב- 10 מיקרוליטרים של מים ללא RNAse. כדי לבדוק את גודל הספרייה, טען מיקרוליטר אחד של הספרייה המטוהרת על שבב DNA ופעל בהתאם לפרוטוקול היצרן. כדי לכמת את ריכוז הספרייה, תחילה לדלל מיקרוליטר אחד של הספרייה המטוהרת ב pH-8.0 טריס-Hcl 10-מילימולרית עם 0.05%polysorbate 20 ביחס נפח של אחד ל-1, 000.לאחר מכן הפעל QPCR באמצעות תקני ה- DNA של ערכת כימות הספרייה המסחרית. לבסוף, מאגר כמויות שוות של הספריות בהתאם לדרישות מכונת הרצף, ורצף על מערכת ריצוף תפוקה גבוהה. האלקטרופרוגרמה של RNAs חוץ-תאיים כללה מגוון רחב של רנ"א.לעומת זאת, RNA הסלולר הראה פסגות ברורות מאוד, המקביל 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA, ו 28SrRNA. האיכות הנובעת משתי הספריות הייתה גבוהה ודומה. התפלגות האורך של שתי הספריות הראתה שיא אחד ב-22 נוקלאוטידים, עם קורלציה עם מיקרו-רנאים.לעומת זאת, הספריות מ- RNAs חוץ-תאיים היו הטרוגניות יותר, שהכילו שתי פסגות נוספות המתואמים עם tRNAs, חצאים וקטעים, או piRNAs. 65% מהקריאות מ-RNA תאי מופו למיקרו-רנ"א אנושי, וכל אחד מה-RNAs הקטנים האחרים היווה חלק קטן מהקריאות הממופות. לעומת זאת, רק 8% מ- RNAs חוץ-תאיים תואמים למיקרו-RNAs אנושיים.ה- RNA הקטן הנפוץ ביותר שאליו מופו ההיקראות היו tRNAs, והקריאות שאין כמוהן תאמו מאוחר יותר לרצפי חיידקים. השוואה לגנום בקר הציעה כי FBS לא היה מקור לזיהום. לפיכך, RNAs חוץ-תאיים מציגים פרופיל לא טיפוסי בהשוואה ל-RNA תאי רגיל.הכנת הספרייה היא חלק חיוני בפרוטוקול זה. ערבוב חייב להיעשות בעדינות רבה כדי למנוע בועות מלהרכיב. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את הפרופיל של exRNAs מסוגים אחרים של תאים, אשר מסייע ללמוד את הפונקציה של exRNAs.

isolating-sequencing-analyzing-extracellular-micrornas-from-human

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) יש פוטנציאל התמיינות לקראת שושלת אוסטאובלסטית כאשר הם מגורים עם גורמים מסיסים או ביו-חומרים ספציפיים. עבודה זו מציגה אפשרות חדשה להעברת MSCs מקרום מי השפיר האנושי (AM-hMSCs) המעסיק את מטריצת עצם הבקר Nukbone (NKB) כפיגום.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

נוזל המרה הוא מקור יקר לשלפוחיות חוץ-תאיות/אקסוזומים המכילים סמנים ביולוגיים בעלי פוטנציאל חשוב. פרוטוקול זה מייצג שיטה חזקה לבידוד אקסוזומים ממרה אנושית לניתוחים נוספים כולל פרופיל miRNA.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

המתואר כאן הוא השימוש בשיטה ספציפית הגברה בדיקה כדי לנתח את רמות המטלציה של האלמנטים קו 1 בתאי גזע mesenchymal שטופלו אוסטאוסרקומה נגזר שלפוחיות. בנוסף, הליך פופולרי עבור הפרדת שלפוחיות ושלפוחית של הפרה העובר סרום, הוא הפגינו גם.

קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצ'אל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.

שיטת סינון פשוטה לבידוד בועיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הצנטריפוגה הדיפרנציאלית לבידוד ואפיון כלי רכב חשמליים מייצגים (אקסוזומים ומיקרובוסיקלים) מתאי MSC אנושיים מתורבתים. יישומים נוספים של כלי רכב חשמליים אלה מוסברים גם במאמר זה.

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

למדו לבודד ולרצף מיקרו RNA חוץ-תאי מתאי גזע מזנכימליים אנושיים. פרוטוקול זה מציג שיטה אמינה לבניית ספריית RNA קטן ושיפור תוצאות ריצוף דור הבא.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

גלה סרטונים נוספים