Name: בידול תאי עצב באמצעות צעד אחד קר פלזמה אטמוספרי טיפול במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: למדו שיטת בידול תאי עצב באמצעות פלזמה קרה אטמוספרית במבחנה. הטכניקה משפרת בידול תאי גזע עצביים עכבריים לטיפול במחלות נוירולוגיות כמו מחלת פרקינסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית מלומד Huazhong, הקרן חדשנות עצמאית של אוניברסיטת Huazhong של המדע, הטכנולוגיה (מספר 2018KFYYXJJ071), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (' קט ' 31501099 ו- 51707012).

1. התא תרבויות Predifferentiation
<ol><li>
תאי גזע עצביים ותרבות predifferentiation
	<ol>
<li>להכין coverslips זכוכית אקרילית-D-ליזין-מצופה. לשים על coverslip סטרילי (20 מ מ קוטר) על פלטה 12-. טוב. מעיל הזכוכית המכסה עם פולי-D-ליזין, 0.1% w/v, במים (טבלה של חומרים) עבור אדהזיה תא טוב יותר על coverslips על-ידי ביצוע השלבים הבאים. הערה: תנאים אופטימליים להיקבע עבור כל שורת התאים וכל יישום.<ol>
<li>גילוח ורחיצה כירורגית מעיל פני coverslip עם פולי-D-ליזין, 0.1% w/v, במים. רוק בעדינות כדי לוודא ציפוי מבטל גם את פני השטח של coverslip.</li>
			<li>לאחר culturing לילה (~ 12 h) ב 37 מעלות צלזיוס, להסיר את הפתרון פולי-D-ליזין ולשטוף את פני השטח 3 x עם 1 מ ל מים סטריליים.</li>
			<li>יבש את התאים לפחות 30 דקות לפני זריעה אותם.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תרבות C17.2 (C17.2-NSC) מאתר תאי גזע עצביים, predifferentiation
	<ol>
<li>דגירה C17.2-NSCs בבקבוקון2 25 ס מ בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 5% הסוס סרום (HS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור d ~ 2-3.</li>
		<li>כאשר התאים מגיעים למפגש 85%, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין טריים (0.25%) לתוך הבקבוק. תשאיר את זה עבור 1 דקות; לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של תרבות בינוני את הבקבוק, פיפטה לאורך מספר פעמים כדי לוודא השעיה תא בודד.</li>
		<li>לספור את צפיפות התאים ההשעיה באמצעות hemocytometer. לחשב את הנפח הנדרש של תא ההשעיה לתת ריכוז התא האחרון של עונה 2 פרק 104 תאים/מ ל....</li>
		<li>זרע C17.2-NSCs-coverslips מצופה בצלחת 12-ובכן עם הצפיפות של ~ 2 x 104 תאים לכל טוב. בדוק את צפיפות התאים במיקרוסקופ. הערה: לקבלת תוצאה טובה יותר, צפיפות תא אופטימלית להיקבע לפני הניסוי immunofluorescence.</li>
		<li>דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תא במשך 12 שעות לאפשר את הקובץ המצורף.</li>
		<li>לאחר מצורף, לשטוף את התאים 2 x עם 1 מ"ל של PBS ולטפח את התאים בינונית בידול המורכב DMEM/F12 עם תוספת של 1% N2 במשך 48 שעות לפני הטיפול פלזמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Predifferentiation והתרבות של תאי גזע עצביים החולדה הראשית
	<ol>
<li>תרבות ההשעיה החולדה הראשית לבטחון לאומי בשנת החולדה לבטחון לאומי מדיום הגידול במבחנות T25 ללא ציפוי-צפיפות של תאים5 5 x 10. הערה: החולדה הראשית NSCs היו מבודדים בעקבות הפרוטוקול של שייה. et al. 9.</li>
		<li>בדוק את היווצרות neurospheres תחת מיקרוסקופ הפוכה. ודא שהמורפולוגיה של neurospheres מוצגים מתחמי multicellular כדורית ושקופה.</li>
		<li>כאשר neurospheres להגיע בקוטר 3 מ מ או יותר, להעביר את המתלים neurosphere שפופרת צנטרפוגה סטרילי 15 מ"ל ולתת neurospheres להתיישב על ידי הכבידה.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע בקפידה כדי להשאיר את neurospheres נפח מינימלי של המדיום.</li>
		<li>לשטוף את neurospheres 1 x 5 מ של PBS ולתת neurospheres להתפשר על ידי הכבידה. הסר את תגובת שיקוע לעזוב נפח מינימלי של PBS.</li>
		<li>להוסיף נפח מתאים של בידול בינוני כדי להתאים את צפיפות התאים כדי ~ 12-15 neurospheres למיליליטר. המדיום הבידול העיקרי העכברוש NSCs מורכב DMEM/F12, 2% B27, ו- 1% FBS.</li>
		<li>זרעי 1 מ"ל של השעיה neurosphere על גבי כל אחד מצופה coverslip בצלחת 12-. טוב. הערה: לנער את הצלחת בעדינות כדי להבטיח neurospheres מופצים בצורה שווה. שלב זה הוא קריטי לקבלת תוצאה טובה יותר immunofluorescence.</li>
		<li>למקם את הצלחת לתוך החממה ולאפשר predifferentiate במשך 24 שעות לפני הטיפול פלזמה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת מטוסי פלזמה
<ol><li>בחר צינור פתוח למחצה קוורץ עם קוטר פנימי של 2 מ מ, קוטר חיצוני של 4 מ מ. להוסיף חוט מתח גבוה בקוטר של 2 מ מ לתוך הצינור.</li>
	<li>הכנס את הצינור קוורץ עם החוט מתח גבוה לתוך מזרק 5 מ ל ולהשתמש בעל כדי לטעון אותו בתוך המרכז של המזרק. לקבוע את המרחק בין קצה הצינור קוורץ אטום לבין קצה המזרק 1 ס מ.</li>
	<li>להתחבר צינור גומי סיליקון 1 מ' (עם הקוטר הפנימי של 12 מ מ) הקצה הפתוח של המזרק ולהתחבר, ואז, זה השסתום זרימה וגז ברצף.</li>
</ol>3. רכישת מטוסי
<ol><li>חבר את המעגל כמוצג באיור1. את החוט פלט של ספק הזרם ןקתהל פלזמה סילון, לאחר מכן, חבר את קצה המכשיר מתח גבוה עם החוט פלט כדי לזהות את המתח. חבר את הקצה השני של המכשיר מתח גבוה אוסצילוסקופ לרשום את המידע של המתח. בדוק את כל המסלול ולוודא שאת אספקת החשמל, אוסצילוסקופ את החללית מתח גבוה כולכם מקורקעים.</li>
	<li>בדוק את הגז. ודא שהשפופרת חובר למכשיר הפלזמה סילון; לאחר מכן, פתח שסתום הגז של הליום (שבר נפח, 99.999%) וחמצן (שבר נפח, 99.999%), מוגדר זרימת הגז 1 L:0.01 L/min (2הוא: O). הערה: תן זרימת הגז למשך מספר דקות לפני הפעלת הכוח בפעם הראשונה.</li>
	<li>הגדר את הדופק משרעת בתדר, רוחב 8 kV 8 kHz, 1600 ns, בהתאמה. . בדוק שוב המעגל והפעל, ואז, לחצן ' פלט ' כדי ליצור מטוס פלזמה. התראה: אל תיגע החוט מתח גבוה בכל עת.</li>
</ol>4. פלזמה לטיפול תאי גזע עצביים
<ol><li>קבעו את המרחק בין הצינור של המזרק החור תא טוב עד 15 מ מ. הערה: המרחק נמדד מהחלק התחתון של פלטפורמת היכן ממוקם לוח 12-. טוב.</li>
	<li>לוקח את הצלחת. ובכן 12 מתוך החממה ושנה את המדיום של התאים predifferentiated µL 800 של בידול טרי בינוני.</li>
	<li>התאים מתחלקים לשלוש קבוצות: קבוצת הבקרה שלא טופלו 60 s הוא-ו-O2 (1%) גז זרימה טיפול קבוצה, קבוצת טיפול פלזמה 60 s. הערה: יש ללא אובדן נוזלים ברור תחת התנאי טיפול.</li>
	<li>למקם את הצלחת 12-ובכן תחת הג'טס פלזמה, ודא שהזרבובית המזרק הוא קבוע במרכז כל חור ולתת את הטיפול הרלוונטי לקבוצות שונות שהוזכר בשלב 4.3. הערה: הפקדים לא מטופל הוחזקו במדיום בידול בטמפרטורת החדר במהלך ההליך ניסיוני כדי להבטיח תנאי טיפול אחיד. קבוצת הטיפול הוא-ו-O זרימת גז2 (1%) טופלה רק הוא ואת זרימת גז O2 (1%), ללא פלזמה הדור. כל הטיפולים צריכה להתבצע דולר.</li>
</ol>5. התמיינות תאי גזע עצביים
<ol><li>לאחר הטיפול, להסיר את התרבות המקורית ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום חדש בידול מכל קידוח.</li>
	<li>דגירה התאים בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2 עבור 6 ד לשנות המדיום בכל יום אחר.</li>
	<li>לבדוק את מצב בידול של קבוצות שונות מדי יום תחת מיקרוסקופ אור שלב הפוכה-ניגודיות. באופן אקראי לבחור שדות לפחות 12, לצלם להקליט את שינויים מורפולוגיים.</li>
</ol>6. immunofluorescence מכתים
<ol><li>
שטיפה
	<ol>
<li>לקחת את הדגימות מתוך החממה תא ולהסיר את המדיום על ידי השאיפה. לשטוף את התאים 1 x 1 מ ל- PBS. הערה: לאחר הבידול, התאים בקלות מנותקים. זה הכרחי להוסיף את PBS מהצד של הבארות תרבות כדי להימנע לשטוף את התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קיבעון
	<ol>
<li>לתקן את התאים עם 500 µL של 4% paraformaldehyde למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבעון, לשטוף בעדינות את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS, 5 דקות כל אחת, כדי להסיר את paraformaldehyde 4% שיורית. הערה: נקודת הזמן האופטימלי עבור קיבוע תא צריכה להיקבע על פי סוגי תאים. לאחר הקיבעון, להוסיף 1 מ"ל של PBS מהצד של הבארות תרבות ולהשאיר את הדגימה על השולחן במשך 5 דקות. אל תשתמש מטרף מעבדה, כדי להבטיח הפסד מינימלי של תאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Permeabilization
	<ol>
<li>Permeabilize את הדגימות עם 0.2% TritonX-100 ב- PBS 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר permeabilization, יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1 מ"ל PBS עבור שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד. הערה: נקודת הזמן האופטימלי עבור תא permeabilization צריכה להיקבע על פי סוגי תאים. לאחר permeabilization, להוסיף 1 מ"ל PBS מהצד של הבארות תרבות, להשאיר את הדגימה על השולחן במשך 5 דקות. אל תשתמש מטרף מעבדה כדי להבטיח אובדן מינימלי של תאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חסימת
	<ol>
<li>להוסיף 1 מ"ל של נסיוב עז 10% ב- PBS כל מדגם ולהשאיר את הדגימה בטבלה 1 h כדי לחסום את כל אינטראקציות לא ספציפית. הערה: אין להשתמש מטרף מעבדה, כדי למנוע את התאים של ניתוק של השקופית. שטיפה אין צורך בשלב זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדגירה עם נוגדן ראשוני
	<ol>
<li>לדלל נוגדן ראשוני באמצעות נוגדן ראשוני דילול מאגר. הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יחס דילול הסופי של הנוגדן הראשי חייב להיקבע על ידי pretest. יחס דילול של אנטי-Nestin (עבור מובחן תאי גזע), אנטי-β-טובולין III (עבור נוירון), אנטי-O4 (עבור אוליגודנדרוציטים), אנטי-NF200 (עבור נוירונים בוגרים), אנטי-צ'אט (עבור שימוש הנוירונים), אנטי-LHX3 (עבור מוטורי לגלוקוז), אנטי-GABA (עבור GABAergic הנוירונים), סרוטונין נגד (עבור נוירונים תכולה), ה-anti (עבור נוירונים דופאמין) הם 1:80, 1:200, בטחונות, בטחונות, בטחונות, 1:200, בטחונות, 1:200 ומטריים, בהתאמה.</li>
		<li>µL 300 של נוגדנים העיקרי מדולל חלות על מדגמים שונים.</li>
		<li>דגירה הדגימות תא בן לילה ב 4 º C. הערה: מומלץ דגירה נוגדנים הראשי ב 4 ° C כדי להפחית את הרקע ואת מכתים לא ספציפית.</li>
		<li>הסר את הנוגדנים העיקרי ולשטוף בעדינות את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדגירה עם נוגדנים משניים
	<ol>
<li>לדלל הנוגדנים משני Cy3 מצומדת או מצומדת אלקסה עבור חיל הים 488 שימוש בסרום עז 3% ב- PBS. הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יחס דילול הסופי של הנוגדן המשני חייב להיקבע על ידי pretest.</li>
		<li>החל µL 300 של נוגדנים משניים הרלוונטיים כדי לזהות כל נוגדן ראשוני. הערה: כל השלבים הבאים צריך להתבצע בחושך כדי למנוע קרינה פלואורסצנטית שכבתה.</li>
		<li>דגירה המדגם תא בחושך 2 h בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר את הנוגדנים משני ולשטוף את התאים בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת גרעינית
	<ol>
<li>החל µL 500 של הפתרון עובד Hoechst 33258 לטבול את דגימת תאים.</li>
		<li>דגירה המדגם תא בחושך 8 דקות בטמפרטורת החדר לתייג את הגרעינים.</li>
		<li>לשטוף בעדינות את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS, 10 דקות כל אחד, מוגן מפני אור. הערה: עבור הפסד מינימלי של תאים, התנאי כביסה מיטביים להיקבע מדעית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הרכבה
	<ol>
<li>מקום טיפה אחת של הרכבה בינונית במרכז microslide.</li>
		<li>להוציא coverslips (עם דגימות) באמצעות פינצטה ומקם בזהירות את המדגם על המדיום הרכבה. להימנע בועות אוויר.</li>
		<li>הסר כל מדיום הרכבה עודף עם נייר סופג.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
התבוננות מיקרוסקופית קרינה פלואורסצנטית
	<ol>
<li>לבחון את הדגימות תחת מיקרוסקופיית פלורסצנטיות מצויד מסננים Hoechst 33258, 488 עבור חיל הים אלקסה של Cy3. עבור כל דגימה, בחר באופן אקראי תמונות רשומות ושדות לפחות 8-12 עם מצלמה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li>
<li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases%3A+dreams+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li>
<li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).</li>
<li>Weltmann, K. D., von Woedtke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+medicine-current+state+of+research+and+medical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Physics+and+Controlled+Fusion%22%5BJournal%5D)">Plasma medicine-current state of research and medical application.</a> Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).</li>
<li>Lloyd, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+Plasma%3A+Medical+Uses+and+Developments+in+Wound+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care.</a> Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).</li>
<li>Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+plasmas+at+atmospheric+pressure%3A+toward+new+pharmaceutical+treatments+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).</li>
<li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Treatment+of+Onychomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li>
<li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li>
<li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huazhong+University+of+Science+and+Technology.+%5BMed+Sci%5D%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li>
<li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fixatives+for+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

C17.2-NSCs הוא סוג של קו מונצחים תאי גזע עצביים מתאי שכבת פרטנית אסטרוציטומה העכבר neonatal, שפותחה על ידי שניידר ואחרים10,11. C17.2-NSCs יכולים להתמיין נוירונים, האסטרוציטים, ו אוליגודנדרוציטים, נמצאים בשימוש נרחב במדעי המוח12. במחקר הקודם שלנו, כמוסות יכול לשפר את הבידול של C17.2-NSCs לתוך הנוירונים. מחקר הוכחה של עקרון גם בוצע באמצעות עכבר ראשי NSCs, השפעת החשיפה פלזמה על החולדה הראשית NSCs היה דומה לזה של C17.2-NSCs, עם הבחנה חזקה יותר...

הבידול בבימויו של NSCs לתוך שושלת מסוימים לתחבורה רקמות נחשב של טיפולים המבטיחים ביותר עבור מחלות ניווניות, neurotraumatic1. לדוגמה, נוירונים דופאמין catecholaminergic הם בעיקר הרצוי לטיפול מחלת פרקינסון (PD). עם זאת, שיטות מסורתיות כדי להכין את התאים הרצויים עבור תחבורה יש חסרונות רבים, כגון כמות רעילה, היווצרות צלקת או אחרים, ומחבלים במידה רבה את היישומים של NSCs רפואה רגנרטיבית2. לכן, זה ממש הכרחי למצוא הרומן דרך בטוחה עבור בידול לבטחון לאומי.
פלזמה היא המדינה הרביעית של עניינים, הבאים מוצק, נוזל וגז, היא מהווה יותר מ 95% של נושאים בעולם כולו. פלזמה חשמלית ניטרליים עם חיובי/שלילי לא מאוגד וחלקיקים נייטרלי, מופק בדרך כלל על ידי הפרשות מתח גבוה במעבדה. בשני העשורים האחרונים, היישום של פלזמה ב וההתערבות משכה תשומת לב אדירה ברחבי העולם וכן פיתוח טכנולוגי פלזמה קר לחץ אטמוספירי. בזכות זה פירות טכני, יציב בטמפרטורה נמוכה פלזמה יכול להיווצר באוויר הסובב על האווירה מבלי במערך קשת ומורכבת ממינים שונים תגובתי, כגון חנקן ונבדקים מינים (האחיות המוסמכות), מינים חמצן תגובתי (ROS), אולטרה סגול (UV) קרינה, אלקטרונים, יונים ושדה חשמלי3. כמוסות יש יתרונות ייחודיים עבור מיקרו-אורגניזם איון, טיפול בסרטן, פצע מרפא, טיפול של מחלות עור, התפשטות תאים תאים בידול4,5,6,7. בעבודה הקודמת, הפגנו פלזמה אטמוספרי קר jet יכול לשפר את הבידול של NSCs תאי גזע עצביים מאתר C17.2 (C17.2-NSCs) והן תאי גזע עצביים החולדה הראשית, מפגין פוטנציאל גדול להפוך לכלי רב עוצמה בוים הבידול של NSCs8. למרות המנגנון של שיפור שווי של בידול לבטחון לאומי אינה מובנת במלואה, שנוצר על ידי אותיות לא הוכח להיות גורם מפתח בתהליך. בעבודה זו, אנו שואפים לספק פרוטוקול נסיוני מפורט של השימוש של פלזמה הליום/חמצן אטמוספרי סילון לטיפול NSCs במבחנה, הכנה תא, רעלני, מורפולוגיה תצפית על ידי מיקרוסקופ הפוכה, ו קרינה פלואורסצנטית התבוננות מיקרוסקופית של immunofluorescence מכתים.

<table><tbody><tr><td>Coverslip</td><td>NEST</td><td>801008</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בינוני</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01B</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 בינוני</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>תוסף C N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C והגנה מפני</td></tr><tr><td>תוסף B27</td> קל <td>Gibco</td><td>17504044</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהגן מפני</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td> קל <td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr><tr><td>של סרום סוס תורם</td><td>HyClone</td><td>SH30074.03</td><td>מטורף ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>HyClone</td><td>25300054</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>תמיסת C PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חסימת סרום עיזים רגילה</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>אנטי-נסטין</td><td>Beyotime</td><td>AF2215</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr><tr><td>של אנטי-&בטא;-טובולין III</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T2200</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr><tr><td>נגד O4</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>מאוחסנת ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של</td></tr><tr><td>אנטי-NF200</td><td>סיגמא</td><td></td><td>המאוחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr><tr><td>של Anti-ChAT</td><td>Sigma</td><td></td><td>המאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr><tr><td>של אנטי-LHX3</td><td>סיגמא</td><td></td><td>המאוחסן ב-20 מעלות; C, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma</td><td></td><td>המאוחסן ב-20 מעלות; C, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr><tr><td>של אנטי סרוטונין</td><td>Abcam, קיימברידג', MA</td><td></td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr><tr><td>נגד TH</td><td>Abcam, קיימברידג', MA</td><td></td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr><tr><td>מאגר דילול נוגדנים ראשוני צביעת אימונול</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Cy3 עם תווית עז נגד ארנב IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C והגנה מפני אור</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- עז מסומנת</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C ולהגן מפני אור</td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קורנינג</td> <td>צלחת 12 בארות</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>25 ס"מ 25 ס"מ</td><td>קורנינג</td> בקבוק <td></td> 430639 <td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Beyotime</td><td>C1018</td><td>מאוחסן ב -20 מעלות; C והגן מפני</td></tr><tr><td>אור הרכבה בינונית</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C ולהגן מפני אור</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>נאנג'ינג ג'יאנגנן אופטיקה חדשנית חברה</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td><td>ניקון</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>גבוה &ndash; מתח מגבר כוח</td><td>מכוון אנרגיה</td><td>PVX-4110</td><td></td></tr><tr><td>DC ספק כוח</td><td>ספלמן</td><td>SL1200</td><td></td></tr><tr><td>מחולל פונקציות</td><td>Aligent&nbsp;</td><td>33521A</td><td></td></tr><tr><td>אוסילוסקופ</td><td>Tektronix</td><td>DPO3034</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה במתח גבוה</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td></td></tr></tbody></table>

בידול תאי עצב באמצעות צעד אחד קר פלזמה אטמוספרי טיפול במבחנה

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

כמו התפתחות הטכנולוגיה פלזמה הפיזי, פלזמות אטמוספרי קר (כמוסות) נחקרו באופן נרחב בטיהור, טיפול בסרטן, ריפוי פצעים, טיפול שורש, וכו ', יוצרים שדה מחקר חדש בשם פלזמה רפואה. להיות תערובת של מינים תגובתי חשמלית, כימית וביולוגית, כמוסות הראו את היכולות שלהם כדי לשפר עצב תאי גזע בידול בשני במבחנה והופך ויוו ואינם ניתנים דרך מבטיחה לטיפול מחלה נוירולוגית בעתיד. בחדשות הרבה יותר מרגשת היא באמצעות כמוסות עשויים להבין בשלב אחד, בבטחה ביים, התמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs) בשביל לרקמות תחבורה. נדגים כאן הפרוטוקול ניסיוני מפורט של שימוש בהתקן שווי מטוס מתוצרת עצמית לשיפור לבטחון לאומי בידול C17.2-NSCs, תאי גזע עצביים החולדה הראשית, וכן התבוננות גורל התא על ידי הפוכה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עם העזרה של immunofluorescence מכתים טכנולוגיה, מצאנו שני NSCs את הראה שיעור דיפרנציאלית מואצת יותר בקבוצה ללא טיפול, ~ 75% NSCs מובחן באופן סלקטיבי נוירונים, אשר הינם בעיקר בוגרים, שימוש, מנוע נוירונים.

מורפולוגיה תאים נצפתה תחת המיקרוסקופ הפוכה בכל יום לאחר הטיפול CAP. איור 2 מציג את הדימויים במיקרוסקופ אור רגיל ניגודיות שלב הפוכה הבידול תא בשתי השורות התא. הקבוצה שטופלו פלזמה תערוכות שיעור בידול מואצת, יחס התמיינות גבוהה לעומת הקבוצה זרימת גז ובקרה.
תוצאות immunofluorescent C17.2-NSCs, החולדה הראשית NSCs תרבותי עבור 6 d לאחר הטיפול מוצגים באיור 3 ,<...

פרוטוקול זה שואפת לספק שלבים מפורטים ניסיוני של טיפול פלזמה אטמוספרי קר על תאי גזע עצביים וזיהוי immunofluorescence עבור שיפור בידול.

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

שיטה זו יש פוטנציאל לשפר את ההידול של תאי גזע עצביים במבחנה ולתרום לטיפול במחלות נוירולוגיות כגון מחלת פרקינסון. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא כי פלזמות אטמוספריות קרות עשוי להיות מיושם בשלב אחד עבור ההתברות מכוונת בטוח של תאי גזע עצביים להשתלת רקמות. פלזמה אטמוספרית קרה יכולה לשפר את ההתברמות של תאי גזע עצביים בתוך תקופת טיפול קצרה.ועם צורך בנזק נוסף לתאים, מתן התאים הרצויים להשתלה. התחל על ידי זריעה על חמש פעמים עשר לתאי גזע עצביים מורין החמישי בבקבוק מרובע 25 ס"מ. מכיל חמישה מיליליטר של DMEM מלא במשך יומיים עד שלושה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני.כאשר התאים מגיעים 85 אחוז confluency, לשטוף את התרבות עם מיליליטר אחד של PBS. לפני הטיפול, עם מיליליטר אחד של 25 אחוז טריפסין לדקה אחת. כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות.ופיגט מספר פעמים כדי ליצור השעיה של תא יחיד. לאחר הספירה, לדלל את התאים פעמיים עשר לתאים הרביעיים לריכוז מיליליטר. זרעים מיליליטר אחד של תאי גזע על אחד פולי D-ליצין מצופה כיסוי להחליק לכל באר בתשע בארות של צלחת תרבות תא 12.בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ. ולהחזיר את התאים לאנקובטור במשך 12 שעות. כאשר התאים מחוברים, לשטוף את הכיסוי מחליק פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS לכל לשטוף, ולטפל בתאים עם מדיום בידול במשך 48 שעות.לרכישת מטוס, תחילה לחבר את חוט הפלט של אספקת החשמל למכשיר סילון פלזמה. וקץ הגשושית במתח גבוה עם חוט היציאה כדי לזהות את המתח. לאחר מכן חבר את הקצה השני של גשושית המתח הגבוה לאוסטילוסקופ כדי לתעד את המידע ממתח היציאה.בדוק את המעגל כולו כדי לוודא שאספקת החשמל, אוסצילוסקופ ובדיקה במתח גבוה מקורקעים כולם. ותבדוק את צינור הגז כדי לוודא שצינור הגז מחובר למכשיר סילון הפלזמה. לאחר מכן, לפתוח את שסתומי הליום וגז חמצן ולהגדיר את זרימת הגז לליטר אחד ל 01 ליטר לדקה יחס של הליום לחמצן.בדוק שוב את המעגל ולחץ על לחצן הפלט כדי ליצור סילון פלזמה. כדי פלזמה לטפל בתאי גזע עצביים, להגדיר את המרחק בין זרבובית המזרק ואת באר הראשונה של תאים ל 15 מילימטרים. החלף את העל-טבעיים בתרבויות תאי הגזע העצביים ב-800 מיקרוליטרים של מדיום ההתברמות הטרי.ות מניחים את הלוחית מתחת למטוסי הפלזמה. מוודאים כי חריר המזרק קבוע מעל מרכז כל באר. צור שלוש בארות עם פלזמה במשך 60 שניות לכל טיפול, ושלוש בארות עם אחוז אחד הליום וגז חמצן במשך 60 שניות לטיפול.משאיר שלוש בארות לא מטופלות, כפקדים. לאחר מכן החלף את העל-טבעיים במיליליטר אחד של מדיום התבוללה טרי. ולהחזיר את התאים לאנקובטור במשך שישה ימים.בדוק את מצב ההידול של הקבוצות השונות מדי יום, תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוך. לאחר הטיפול, אפשר לתאים לצייד באופן מלא במצב בינוני במשך כשעה לפני החלפת העל-טבעי במדיום בידול טרי. לניתוח immunofluorescence, לתקן את התרבויות עם 500 microliters של ארבעה אחוז paraformaldehyde לכל באר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.ואחריו שלוש שטיפות עדינות של חמש דקות, עם מיליליטר אחד של PBS לכל שטיפה. לאחר מכן, לחלחל דגימות קבוע עם 2 אחוז טריטון X-100 ב PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ואחריו שטיפה עדינה כפי שהוכח.לאחר הכביסה האחרונה, לחסום כל כריכה לא ספציפית עם מיליליטר אחד של 10 אחוז סרום עזים ב PBS לכל מדגם במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, סמן את התאים בכל באר עם 300 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של עניין לילה בארבע מעלות צלזיוס. ואחריו שלוש שטיפות ב- PBS כפי שהוכח.לאחר הכביסה האחרונה, סמן את התאים עם 300 מיקרוליטרים של הנוגדנים המשניים המתאימים. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לאחר מכן לשטוף את התאים בעדינות עם מיליליטר אחד של PBS לגם במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.תדמיין את התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים המתאימים. תאי גזע עצביים שטופלו בפלזמה מפגינים קצב בידול מואץ, ויחס בידול גבוה יותר בהשוואה לשליטה לא מטופלת, וזרימת גז טיפלה בתאי גזע. לאחר טיפול בפלזמה, נסטין פוחתת.בטא-טובולין השלישי גדל באופן משמעותי. ו O4 מעט עולה, בהשוואה לבקרה מטופלים וזרימת גז מטופלים בתאי גזע. כמו כן, לאחר 60 שניות של טיפול בפלזמה, ביטוי חזק של נוירון בוגר, נוירון כולין, סמנים נוירון מוטורי הוא ציין.עם מעט מאוד תאי עצב GABAergic ו serotonergic, ולא נוירונים דופאמין זוהה. בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור, לטפל בתאים עם מינון פלזמה נאותה, כי תקופת טיפול פלזמה ארוכה ואינטנסיבית יגרום אפופטוזיס התא או נמק. זכור גם לבדוק מראש את הכדאיות של התא לפני יישום במורד הזרם.

nerve-stem-cell-differentiation-one-step-cold-atmospheric-plasma

Research

JoVE Journal

Engineering

הנדסה

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים, או תאי גזע עובריים אנושיים, ישירות לתאי אב עצביים ללא שימוש בתאי הזנה או בשלבי ביניים כלשהם. עיכוב סלקטיבי של חלבון מורפוגנטי עצם או BMP והפיכת גורם גדילה-בטא, או TGF-β, מסלולי איתות מוביל להתמיינות תאי גזע עובריים עובריים עצביים לתאי אב עצביים, או NPCs.

התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לאבות עצביים

סרטון זה מציג שיטה להפעלת התמיינות בתאי גזע עצביים על ידי שימוש בפלזמה אטמוספרית קרה. זה מייצר קרינת UV ומולקולות תגובתיות כדי לעורר תאי עצב לייצר הקרנות, המציין התמיינות תאים עצביים.

גירוי התמיינות תאי גזע עצביים באמצעות טיפול פלזמה אטמוספרי קר

סרטון זה מדגים את התהליך של יצירת תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) מתאי גזע עובריים אנושיים, ואחריו הבשלת OPCs לאוליגודנדרוציטים. תהליך זה של יצירת אוליגודנדרוציטים פותח דרכים רבות לשיפור המחקר והטיפול במחלות נוירודגנרטיביות, כולל אלצהיימר.

התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לאוליגודנדרוציטים

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

פרוטוקול זה מתאר את התכנות של ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal לתוך תאי גזע pluripotent המושרה באמצעות גישה episomal-שילוב בתנאים מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית. תהליכי מיצוי, תרבות, התכנות, ואפיון של תאי גזע pluripotent המושרה הנוצרת על ידי שיטות מחמירים מפורטים.

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

יצירת סוגי תאים הבדיל מתאי גזע האדם הרב עוצמה (hPSCs) מחזיק הבטחה טיפולית גדולה אך נשאר מאתגר. PSCs לעתים קרובות מפגין חוסר יכולת מובנית להבדיל גם כאשר מגורה עם קבוצה נאותה של אותות. מתוארים כאן הוא כלי פשוט כדי לשפר בידול רב היוחסין על פני מגוון של קווי PSC.

הטיפול הארעי של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית עם DMSO כדי לקדם בידול

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

למדו שיטת בידול תאי עצב באמצעות פלזמה קרה אטמוספרית במבחנה. הטכניקה משפרת בידול תאי גזע עצביים עכבריים לטיפול במחלות נוירולוגיות כמו מחלת פרקינסון.

בידול תאי עצב באמצעות צעד אחד קר פלזמה אטמוספרי טיפול במבחנה

גלה סרטונים נוספים