בידול תאי עצב באמצעות צעד אחד קר פלזמה אטמוספרי טיפול במבחנה

שיטה זו יש פוטנציאל לשפר את ההידול של תאי גזע עצביים במבחנה ולתרום לטיפול במחלות נוירולוגיות כגון מחלת פרקינסון. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא כי פלזמות אטמוספריות קרות עשוי להיות מיושם בשלב אחד עבור ההתברות מכוונת בטוח של תאי גזע עצביים להשתלת רקמות. פלזמה אטמוספרית קרה יכולה לשפר את ההתברמות של תאי גזע עצביים בתוך תקופת טיפול קצרה.

ועם צורך בנזק נוסף לתאים, מתן התאים הרצויים להשתלה. התחל על ידי זריעה על חמש פעמים עשר לתאי גזע עצביים מורין החמישי בבקבוק מרובע 25 ס"מ. מכיל חמישה מיליליטר של DMEM מלא במשך יומיים עד שלושה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני.

כאשר התאים מגיעים 85 אחוז confluency, לשטוף את התרבות עם מיליליטר אחד של PBS. לפני הטיפול, עם מיליליטר אחד של 25 אחוז טריפסין לדקה אחת. כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות.

ופיגט מספר פעמים כדי ליצור השעיה של תא יחיד. לאחר הספירה, לדלל את התאים פעמיים עשר לתאים הרביעיים לריכוז מיליליטר. זרעים מיליליטר אחד של תאי גזע על אחד פולי D-ליצין מצופה כיסוי להחליק לכל באר בתשע בארות של צלחת תרבות תא 12.

בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ. ולהחזיר את התאים לאנקובטור במשך 12 שעות. כאשר התאים מחוברים, לשטוף את הכיסוי מחליק פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS לכל לשטוף, ולטפל בתאים עם מדיום בידול במשך 48 שעות.

לרכישת מטוס, תחילה לחבר את חוט הפלט של אספקת החשמל למכשיר סילון פלזמה. וקץ הגשושית במתח גבוה עם חוט היציאה כדי לזהות את המתח. לאחר מכן חבר את הקצה השני של גשושית המתח הגבוה לאוסטילוסקופ כדי לתעד את המידע ממתח היציאה.

בדוק את המעגל כולו כדי לוודא שאספקת החשמל, אוסצילוסקופ ובדיקה במתח גבוה מקורקעים כולם. ותבדוק את צינור הגז כדי לוודא שצינור הגז מחובר למכשיר סילון הפלזמה. לאחר מכן, לפתוח את שסתומי הליום וגז חמצן ולהגדיר את זרימת הגז לליטר אחד ל 01 ליטר לדקה יחס של הליום לחמצן.

בדוק שוב את המעגל ולחץ על לחצן הפלט כדי ליצור סילון פלזמה. כדי פלזמה לטפל בתאי גזע עצביים, להגדיר את המרחק בין זרבובית המזרק ואת באר הראשונה של תאים ל 15 מילימטרים. החלף את העל-טבעיים בתרבויות תאי הגזע העצביים ב-800 מיקרוליטרים של מדיום ההתברמות הטרי.

ות מניחים את הלוחית מתחת למטוסי הפלזמה. מוודאים כי חריר המזרק קבוע מעל מרכז כל באר. צור שלוש בארות עם פלזמה במשך 60 שניות לכל טיפול, ושלוש בארות עם אחוז אחד הליום וגז חמצן במשך 60 שניות לטיפול.

משאיר שלוש בארות לא מטופלות, כפקדים. לאחר מכן החלף את העל-טבעיים במיליליטר אחד של מדיום התבוללה טרי. ולהחזיר את התאים לאנקובטור במשך שישה ימים.

בדוק את מצב ההידול של הקבוצות השונות מדי יום, תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוך. לאחר הטיפול, אפשר לתאים לצייד באופן מלא במצב בינוני במשך כשעה לפני החלפת העל-טבעי במדיום בידול טרי. לניתוח immunofluorescence, לתקן את התרבויות עם 500 microliters של ארבעה אחוז paraformaldehyde לכל באר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

ואחריו שלוש שטיפות עדינות של חמש דקות, עם מיליליטר אחד של PBS לכל שטיפה. לאחר מכן, לחלחל דגימות קבוע עם 2 אחוז טריטון X-100 ב PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ואחריו שטיפה עדינה כפי שהוכח.

לאחר הכביסה האחרונה, לחסום כל כריכה לא ספציפית עם מיליליטר אחד של 10 אחוז סרום עזים ב PBS לכל מדגם במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, סמן את התאים בכל באר עם 300 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של עניין לילה בארבע מעלות צלזיוס. ואחריו שלוש שטיפות ב- PBS כפי שהוכח.

לאחר הכביסה האחרונה, סמן את התאים עם 300 מיקרוליטרים של הנוגדנים המשניים המתאימים. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לאחר מכן לשטוף את התאים בעדינות עם מיליליטר אחד של PBS לגם במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.

תדמיין את התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים המתאימים. תאי גזע עצביים שטופלו בפלזמה מפגינים קצב בידול מואץ, ויחס בידול גבוה יותר בהשוואה לשליטה לא מטופלת, וזרימת גז טיפלה בתאי גזע. לאחר טיפול בפלזמה, נסטין פוחתת.

בטא-טובולין השלישי גדל באופן משמעותי. ו O4 מעט עולה, בהשוואה לבקרה מטופלים וזרימת גז מטופלים בתאי גזע. כמו כן, לאחר 60 שניות של טיפול בפלזמה, ביטוי חזק של נוירון בוגר, נוירון כולין, סמנים נוירון מוטורי הוא ציין.

עם מעט מאוד תאי עצב GABAergic ו serotonergic, ולא נוירונים דופאמין זוהה. בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור, לטפל בתאים עם מינון פלזמה נאותה, כי תקופת טיפול פלזמה ארוכה ואינטנסיבית יגרום אפופטוזיס התא או נמק. זכור גם לבדוק מראש את הכדאיות של התא לפני יישום במורד הזרם.