Name: ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: למדו שיטה להערכת ביטוי microRNA בריאות עכברות החשופות לאוזון או אוויר מסונן, תוך התחשבות בשלבי מחזור הייחום. טכניקה זו מאפשרת לחקור את השפעת ההורמונים על תגובות דלקתיות בריאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH K01HL133520 (PS) ו K12HD055882 (PS). המחברים מודים ד ר ג'ואנה Floros על הסיוע עם האוזון חשיפה ניסויים.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של פן סטייט.
1. הערכה של השלב ייחום
<ol><li>כמו שצריך לרסן נקבה העכבר C57BL/6 (בן 8 – 9 שבועות) באמצעות העכבר ביד אחת איפוק בטכניקה המתוארת et al. Machholz10.</li>
	<li>למלא את פיפטה פלסטיק סטרילית עם 10 μL של מים אולטרא טהורים.</li>
	<li>להציג את קצה פיפטה פלסטיק לתוך הנרתיק.</li>
	<li>לשטוף בעדינות את הנוזל 4 – 5 פעמים כדי לאסוף את הדגימה.</li>
	<li>מקם את הסומק הסופי המכיל נוזל הנרתיק על משטח זכוכית.</li>
	<li>לבחון את הסומק הנרתיק מוכתם תחת מיקרוסקופ אור עם יעד 20 x. הערה: בעלי חיים שאינם מציגים מחזורים סדירים עקב pseudopregnancy או סיבות אחרות צריך להיות נכללו בניסוי. מומלץ לבצע הפרשות מהנרתיק מדי יום לפחות שלושה מחזורים רצופים לאשר לאחר תקופת היובש.</li>
</ol>2. חשיפה אוזון
<ol><li>מקום מקסימלית של עכברים 4 שני מיכלי זכוכית 1.2 L עם חוט רשת שינוי העפעפיים, ומים ad libitum.</li>
	<li>הכניסו אחד מיכל הזכוכית החדר האוזון והשני בבית הבליעה חשיפה אוויר מסונן.</li>
	<li>התאם את ריכוז האוזון רמות האוזון 2 ppm ולפקח באופן קבוע. הערה: המנגנון האוזון מספק של זרימת האוויר מווסתת (> 30 אוויר שינויים/h) עם מבוקר טמפרטורה (25 ° C), לחות יחסית (50%). המערכת יוצרת האוזון על ידי פריקה חשמל ozonizer, אשר תחת פיקוח, נשלט על-ידי מנתח של האוזון סגול ובקרי זרימת מסה, כפי שתואר לעיל11.</li>
	<li>הסר את מיכלי זכוכית לאחר 3 שעות של חשיפה אוויר מסונן/אוזון. להחזיר לבעלי חיים בכלוב עם מצעי מיטה, מזון ומים ad libitum.</li>
</ol>3. ריאות אוסף
<ol><li>4 שעות לאחר החשיפה, עזים ומתנגד חיות עם זריקה בקרום הבטן של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים קוקטייל (90 מ"ג/ק"ג קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים 10 מ"ג/ק"ג). הערה: כדי לוודא רמה נאותה של הרדמה, בדוק העכבר על הדוושה, לכל הרוחות רפלקס (הבוהן המשרד צביטה) ולהתאים ההרדמה כנדרש.</li>
	<li>הרטיבו את העור עכבר עם 70% אתנול.</li>
	<li>עושים חתך קו האמצע 2 ס מ באמצעות מספריים הפעלה של פינצטה כירורגית כדי לחשוף את הווריד הנבוב.</li>
	<li>להקריב עכברים על ידי חיתוך של הנבוב העליון של אבי העורקים. אם יש צורך, מכניס מחט מד 21 G הווריד הנבוב מעל הורידים כליות לאסוף דם לפני דימום למוות. לחלופין, לאסוף דם באמצעות ניקוב הלב בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.</li>
	<li>השתמש מספריים כירורגיים כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את העור/אפר שרירים, ופונה כלפי מעלה הצלעות.</li>
	<li>השתמש מספריים כירורגיים כדי לנקב את הסרעפת. הערה: הריאות תתמוטט מן הסרעפת.</li>
	<li>גזור משם צלעות באמצעות מספריים כירורגיים לחשוף את הלב והריאות.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, קח של mL 1.5 ללא RNase צינור microcentrifuge, לתוכה חנקן נוזלי למלא את הצינורית. הערה: השתמש משקפי מגן וכפפות מגן כדי להתמודד עם חנקן נוזלי.</li>
	<li>להסיר את הריאות, למקם אותם לתוך נטולת RNase microcentrifuge 1.5 mL הצינורות מלאים בחנקן נוזלי snap-הקפאת הרקמה, המתן מספר שניות עד שהנוזל מתאדה.</li>
	<li>סגור את המכסה צינור ולאחסן את הרקמה ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>4. רנ א הכנה
<ol><li>Pulverize כל הריאות באמצעות הכותש מפלדת רקמות. הערה: מרסס הרקמה צריך להציב בו חנקן נוזלי לפני השימוש. לנקות את מרסס אחרי כל שימוש RNAse פתרון.</li>
	<li>לפצל את הריאות השמיד, למקם את 1.5 mL שני צינורות (חצי ריאות כל).</li>
	<li>להוסיף 500 µL של guanidinium thiocyanate למחזור מדגם ולערבב.  Homogenize כל דגימה באמצעות 18 גרם, 21 G ו- 23 גרם מחטים, בהתאמה. הערה: דוגמאות יכול להיות מתובל 5.6 x 108 עותקים של קטן RNA ספייק-in פקד (מזן שונה) לפני שתמשיך עם מיצוי.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של אתנול כל דגימה של מערבולת 15 s.</li>
	<li>טען התערובת בעמודה ספין אוסף שפופרת, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור מינימלית 1 למחוק את הזרימה דרך.</li>
	<li>
עבור DNase אני טיפול (בעמודה);
	<ol>
<li>להוסיף 400 µL של RNA שטיפת מאגר, צנטריפוגה x 12,000 g עבור 1 דקות.</li>
		<li>בצינור נטולת RNase, להוסיף 5 µL של DNase ו- 75 µL 1 x DNA עיכול מאגר ומערבבים. להוסיף את התערובת ישירות אל המטריקס עמודה.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>µL 400 של RNA פתרון prewash להוסיף העמודה ואת צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 מינימלית להשליך הזרימה דרך, חזור על שלב זה.</li>
	<li>להוסיף 700 µL RNA שטיפת מאגר לעמודה וזורקים צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 מינימלית של הזרימה דרך.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 12,000 g למשך 2 דקות להסיר את מאגר הנותרים. להעביר את העמודה לתוך שפופרת נטול RNase.</li>
	<li>כדי elute RNA, להוסיף µL 35 DNase/RNase ללא מים ישירות אל העמודה מטריקס ואל צנטריפוגה ב 12,000 x g 1.5 דקות.</li>
	<li>למדוד את הריכוז RNA (260 ננומטר) וטוהר באמצעות ספקטרופוטומטרים. בצע את ההוראות כדי לבצע RNA כימות במדגם µL 1.5 aliquot. בלנק הכלי עם מים DNase/RNase ללא משמש • תנאי. הערה: יחס 260/280 של ~2.0 מקובל בדרך כלל בתור "טהור" עבור ה-RNA. ריכוז ה-RNA אופיינית בדרך כלל נע בין 750 ו- 2,500 ng/µL.</li>
	<li>חנות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>5. miRNA פרופיל
<ol><li>
רטרו-לתמלל RNAs קטנות, השתמש 200 ng של RNA הכולל.
	<ol>
<li>מכינים את תערובת התגובה הפוכה-תמלול על קרח (הנפח הכולל לפי התגובה הוא 20 µL). עבור כל תגובה, להוסיף 4 µL של 5 x מאגר, 2 µL של 10 x נוקלאוטידים לערבב, 2 µL של רוורס טרנסקריפטאז ו 2 µL של מים נטולי RNase. מערבבים את כל הרכיבים ו aliquot ב 600 µL נטולת RNAse צינורות פלסטיק (10 µL של תערובת לכל תגובה). הערה: המיקס מאסטר הפוכה-תמלול מכיל את כל הרכיבים הדרושים עבור הראשון-strand cDNA סינתזה מלבד תבנית הרנ א. הערה: חישוב נפח עודף (10%) בעת הכנת המיקס מאסטר.</li>
		<li>להוסיף את תבנית ה-RNA (200 ng ב- 10 µL) על כל שפופרת המכילה תערובת בסיס הפוכה-תמלול. מיקס, צנטריפוגה 15 s ב 1,000 x g, ולאחסן אותם על קרח עד הצבת thermocycler או גוש יבש.</li>
		<li>תקופת דגירה של 60 דקות ב 37 º C.</li>
		<li>תקופת דגירה של 5 דקות ב 95 ° C ומניחים הצינורות על קרח.</li>
		<li>לדלל את cDNA על-ידי הוספת 200 µL של מים נטולי RNase כל תגובה הפוכה-תמלול 20 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע PCR בזמן אמת באמצעות העכבר תגובה דלקתית, מחלת חיסון עצמי miRNA מערך ה-PCR.
	<ol>
<li>להכין תערובת התגובה (הנפח הכולל 1100 µL): עבור כל תגובה, להוסיף µL 550 של מיקס מאסטר x PCR 2, µL 110 של 10 x מיקס פריימר אוניברסלי, 340 µL של מים נטולי RNase ו µL 340 של תבנית cDNA (מדולל התגובה מ שלב 5.1.5).</li>
		<li>להוסיף 10 µL של התגובה לערבב כל טוב של miRNA טעון מראש מערך ה-PCR באמצעות של pipettor רב-ערוצי.</li>
		<li>חותם miRNA את מערך ה-PCR צלחת עם סרט דביק אופטי.</li>
		<li>Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 1,000 x g בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות.</li>
		<li>תוכנית הצנטרפוגה בזמן אמת, PCR שלב ההפעלה הראשונית למשך 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, דנטורציה המכיל אופניים 3-צעד עבור 15 s ב 94 ° C, חישול ב-30 s 55 ° C, ואת סיומת עבור 30 s-70 ° C 40 מחזורי מספר. הערה: רכיבה על אופניים בצע היצרן תנאים ההוראות כדי להתקין את הצנטרפוגה בזמן אמת. בצע את שלב עקומת דיסוציאציה מובנה בתוכנה הצנטרפוגה בזמן אמת.</li>
		<li>לבצע ניתוח נתונים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>לחלץ ערכים Ct מהתוכנה PCR בזמן אמת עבור כל דגימה לתוך תוכנה לניתוח. הערה: סי. טי הערך של 34 נחשבת הפסקת. אם הדגימות מכילים ספייק-אין שליטה (למשל, צ'ל-מיר-39), לנרמל Ct ערכים לדקר בשליטה עבור כל דגימה. ערכי הסף ייתכן שיהיה עליך להגדיר ידנית. ערכים של תוכנית בסיסית נקבעות באופן אוטומטי.</li>
	<li>לנרמל Ct ערכי ה-Ct הממוצע של פקדים משק miRNA 6: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, באמצעות המשוואה הבאה: ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)</li>
	<li>עבור קיפול לשנות חישובים, לחשב ערכים ΔΔCt באמצעות מדגם ספציפי של הפקד, באמצעות משוואת ביטוי יחסי12: ביטוי יחסי miRNA: 2-∆∆Ct, לאן - ∆∆Ct =-[מבחן ∆Ct - בקרת ∆Ct] הערה: שינוי קיפול של 200 נחשבת הפסקת.</li>
	<li>ייצוא קיפול לשנות ערכים הביטוי כדי לבצע ניתוח סטטיסטי על R באמצעות חבילת limma Bioconductor8.</li>
	<li>תיקון להשוואות מרובות באמצעות שיטת בנימיני-הוכברג13. הערה:  עותק של קובץ ה-script R הינה זמינה במלון: <a href="http://psilveyra.github.io/silveyralab/">http://psilveyra.github.io/silveyralab/</a>. Datasets ניתחו נתונים הינם גם זמינים Omnibus ביטוי גנים תחת מספר GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.</li>
</ol>7. נתוני ניתוח: אנליזה פונקציונלית תוכנה
<ol><li>לארגן את הנתונים (dataset). כוללים miRNAs עם ביטוי בהתאמה יומן יחסי שלהם ערכי-p. ראה טבלה 1 לעיצוב ערכת נתונים ספציפיים.</li>
	<li>אנליזה פונקציונלית פתוח התוכנה (גירסה 01-10).</li>
	<li>להעלות את ערכת הנתונים באמצעות התבנית הבאה: תבנית הקובץ: "תבנית גמישה", כותרת העמודה מכיל: "כן", בחר סוג מזהה: "miRBase (בוגר)", מערך פלטפורמה המשמשים לניסויים: לבחור את פלטפורמת מערך. הערה: תבניות קבצים הם. txt (בטאבים קבצי טקסט),. xls (excel קבצים), ו- .diff (קבצי. cuffdiff).</li>
	<li>בחרו "תצפיות להסיק", ודא קבוצה ניסיונית תיוג נכון.</li>
	<li>ללכת ערכת נתונים 'סיכום' כדי לתקן את הסכום הכולל של miRNAs והן לא ממופים.</li>
	<li>
לחץ על הכפתור "חדש" בחלק העליון השמאלי של התוכנית. בחר "מסנן היעד MicroRNA חדש" ולהעלות microRNA dataset.
	<ol>
<li>הגדר מקור: TarBase, תחכום מומחים ממצאים, miRecords.</li>
		<li>להגדיר ביטחון: השפעול שנצפו או גבוהה (חזה).</li>
		<li>בחר "הוסף עמודות" כדי לכלול מגוון רחב של מידע ביולוגי על המטרות כגון מין, מחלות, רקמות, מסלולים ועוד.</li>
		<li>כדי להתמקד במטרות שהשתנו ביטוי בניסוי, בחר "הוסף / להחליף את ה-mRNA הנתונים (dataset)". כדי לאתר מיקרו Rna עם רמות ביטוי זהה או שונה לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט "ביטוי זיווג". הערה: הניתוח מסנן תספק microRNA שמות, סמלים, מטרות ה-mRNA, המקור זה מתאר את היחסים יעד, ואת רמת הביטחון של קשר הגומלין החזוי (איור 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחץ על "הוסף כדי שלי מסלול" לשלוח את ערכת הנתונים המסוננים בד מסלול ולחקור קשרים ביולוגיים נוספים.</li>
	<li>השתמש מעצב נתיב כדי ליצור מודל פרסום באיכות של תופעות microRNA.</li>
	<li>
אפשרות חלופית היא ליצור ניתוח הליבה.
	<ol>
<li>עבור סוג ניתוח הליבה, בחר "ביטוי ניתוח".</li>
		<li>עבור סוג מדידה, בחר "Expr יומן יחס".</li>
		<li>ניתוח מסנן תקציר: לשקול רק מולקולות ו/או מערכות יחסים בו: (מינים = עכבר) AND (ביטחון = השפעול שנצפו) AND (מקורות נתונים = "תחכום מומחה ממצאים", "ההמצאה ExpertAssist ממצאים", "miRecords", "TarBase", או " TargetScan האדם").</li>
		<li>בחר על קיצוץ של ערך-p = 0.05.</li>
		<li>הפעל את הניתוח. הערה: הדיווח יכלול: מסלולים הקנוני, הניתוח ווסתי במעלה הזרם, מחלות ופונקציות, הרגולטור אפקטים, רשתות, מולקולות ועוד.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rebane, A., Akdis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Essential+players+in+the+regulation+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+microRNAs+regulate+gene+expression%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">How do microRNAs regulate gene expression?</a> Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).</li>
<li>Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+biomarkers+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Microrna%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases.</a> Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).</li>
<li>Sessa, R., Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microRNAs+in+lung+development+and+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases.</a> Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).</li>
<li>Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+microRNA+expression+networks+in+an+acute+mouse+model+of+ozone-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Sex+Differences%22%5BJournal%5D)">Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation.</a> Biology of Sex Differences. 9 (1), 18(2018).</li>
<li>Aris, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+airway+inflammation+in+human+subjects+as+determined+by+airway+lavage+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy.</a> American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).</li>
<li>Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+analysis+approaches+in+Ingenuity+Pathway+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis.</a> Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+exposure+of+proteins+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro exposure of proteins to ozone.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hyperparameter+estimation+protects+against+hypervariable+genes+and+improves+power+to+detect+differential+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Statistics%22%5BJournal%5D)">Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression.</a> Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).</li>
<li>Smyth, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.681.4748">Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide.</a> Bioconductor. , (2002).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2346101">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+ONE%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Alves, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+Extraction+Methods+for+Molecular+Analysis+of+Oral+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Stomatologica+Croatica%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology.</a> Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Walker, S. E., Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+purification-+precipitation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">RNA purification- precipitation methods.</a> Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/0-387-29362-0_23">Limma: linear models for microarray data.</a> Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).</li>
<li>Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1385/1-59745-123-1:129">miRBase: the microRNA sequence database.</a> Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).</li>
<li>Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TarBase%3A+A+comprehensive+database+of+experimentally+supported+animal+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets.</a> RNA. 12 (2), 192-197 (2006).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRecords%3A+an+integrated+resource+for+microRNA-target+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions.</a> Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).</li>
<li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Informatics%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

פרופיל MicroRNA היא טכניקה יתרון לאבחון המחלה והן מכניסטית מחקר. כתב יד זה, הגדרנו פרוטוקול להעריך את הביטוי של miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים בריאות של עכברים הנשי נחשפים האוזון בשלבים שונים ייחום. שיטות לקביעת ייחום, כגון שיטת זיהוי חזותי, כבר מתואר16. עם זאת, אלה מסתמכים על מדידות חד פעמי, ולכן לא אמינים. כדי לזהות במדויק בכל שלבי ייחום הנקבות זה מחזור באופן קבוע, מומלץ השיטה המתוארת כאן. בנוסף, פרוטוקול פשוט זה יכול לשמש גם כדי להעריך באופן עקיף יומי תנודות הורמונליות בעכברים. כדי למנוע ...

Rna (miRNAs) הם קצרים (19-25 נוקלאוטידים), המתרחשים באופן טבעי, ללא קידוד RNA מולקולות. רצפים של miRNAs הם אבולוציונית והתפאורה על פני מינים, רומז על חשיבות miRNAs בוויסות פונקציות פיזיולוגיים1. יצירת פרופיל ביטוי microRNA הוכח להיות מועיל לזיהוי miRNAs חשובים בוויסות מגוון רחב של תהליכים, כולל את התגובה החיסונית, התמיינות תאים, תהליכים פיתוחיים אפופטוזיס2. לאחרונה, miRNAs זוהו לשימוש שלהם פוטנציאל אבחון המחלה הרפוי. עבור החוקרים ללמוד מנגנונים של הכונה, מדידה miRNA ביטוי יכול להאיר את מערכות ברמת מודלים של תהליכים רגולטוריים, במיוחד כאשר miRNA המידע יאוחד עם פרופיל ה-mRNA, אחרים נתונים הגנום בקנה מידה3. מצד שני, miRNAs יש גם הוכח להיות יציבים יותר mRNAs במגוון סוגי הדגימה, גם הם מדידה עם רגישות גדולה יותר מאשר חלבונים4. זה הוביל עניין רב בהתפתחות miRNAs כמו סמנים ביולוגיים עבור יישומים אבחון מולקולרי שונים ומגוונים, לרבות מחלות ריאה.
הריאות, miRNAs משחק תפקידים חשובים תהליכים התפתחותיים, שמירה על הומאוסטזיס. יתר על כן, ביטוי לא תקין שלהם נמצא קשור פיתוח, ההתקדמות של מחלות שונות5. מחלות ריאה דלקתיות הנגרמת על ידי זיהום אוויר הוכיחה ביתר חומרה והפרוגנוזה עניים אצל נקבות, המציין הורמוני, את ייחום יכול לווסת את הריאה מולדת חסינות miRNA הבעה בתגובה אתגרים סביבתיים 6. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים באוזון חשיפה, המהווה מרכיב עיקרי של זיהום אוויר, לזירוז צורה של דלקת ריאות בעכברים הנשית המתרחשת בהעדר חסינות מסתגלת. באמצעות אוזון, אנחנו נמצאים גרימת הפיתוח של hyperresponsiveness דרכי הנשימה המשויך נזק תאי אפיתל דרכי הנשימה, עלייה נויטרופילים, מתווכים דלקתיים ב איירווייז proximal7. כיום, ישנם לא פרוטוקולים היטב תיאר לאפיין ולנתח miRNAs מעבר ייחום בעכברים החשופים האוזון.
להלן, אנו מתארים שיטה פשוטה כדי לזהות ייחום שלבים וביטוי miRNA ברקמת הריאה של עכברים הנשי נחשפים האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה יעיל זיהוי גילוי של היעד miRNA, עם דגש על ביולוגיה חישובית. אנחנו מנתחים את הנתונים microarray באמצעות limma, יש תוכנה R/Bioconductor אשר מספק פתרון משולב עבור ניתוח נתונים ניסויים של ביטוי גנים8. ניתוח של נתונים מערך ה-PCR limma יש יתרון מבחינת צריכת חשמל על הליכים לפי מבחן t כאשר באמצעות מספר קטן של מערכים/דוגמאות כדי להשוות את הביטוי. כדי להבין את ההקשר הביולוגי של תוצאות הביטוי miRNA, אז השתמשנו בתוכנה אנליזה פונקציונלית. על מנת להבין את מנגנוני ויסות שינויים תעתיק לחזות תוצאות סביר, התוכנה משלב miRNA-ביטוי datasets וידע הספרות9. זהו יתרון בהשוואה עם התוכנה פשוט תחפש העשרה סטטיסטי ב חופפים סטים של miRNAs.

<table><tbody><tr><td>עכברי C57BL / 6J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td>8 שבועות</td></tr><tr><td>UltraPure Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10813012</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פלסטיק סטרילית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-25</td><td>קיבולת: 1.7 מ"ל</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ חלבי</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>2951TS</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>מיקרוסקופ עולם</td><td>MW3-H5</td><td>10x ו-20x אובייקטיבי</td></tr><tr><td>Ketathesia- הזרקת קטמין HCl USP</td><td>הנרי שיין בריאות בעלי חיים</td><td>55853</td><td>90 מ"ג/ק"ג. סם מבוקר.</td></tr><tr><td>תמיסה סטרילית קסילזין</td><td>מעבדות לויד</td><td>139-236</td><td>10 מ"ג לק"ג. סם מבוקר.</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2818100</td><td>לדלל ל-70% אתנול במים.</td></tr><tr><td>מחט מד 21 גרם</td><td>BD Biosciences</td><td>מזרק 305165</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>329654</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>מספריים הפעלה</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501221, 504613</td><td>14 ס"מ, חד / קהה, מעוקל ו 9 ס"מ, ישר, דק קצה חד</td></tr><tr><td>ערכת פינצטה</td> מכשירי <td>דיוק עולמיים</td><td></td> 504616 <td></td></tr><tr><td>ספקטרום&nbsp; מרססי רקמות בסמן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-418-1</td><td>קיבולת: 10 עד 50 מ"ג</td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה ללא RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>ערכת miScript II RT</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>תגובה דלקתית של עכבר & אוטואימוניות miRNA PCR Array</td><td>Qiagen</td><td>MIMM-105Z</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR דקי דופן, נטולי DNase, ללא RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12225</td><td>ל-20 &mu; L תגובות</td></tr><tr><td>miRNeasy סרום/פלזמה בקרת ספייק אין</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>https://office.microsoft.com/excel/</td></tr> <tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td></tr> <tr><td>R Software</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>מחזורי תרמי או בלוק קירור/חימום</td> ספק <td></td><td></td><td>מעבדה כללית</td></tr><tr><td>ספק מעבדה</td><td>כללית ספק</td><td></td><td></td>מעבדה כללית</tr> בזמן <tr><td>אמת PCR מחזורי</td><td>ספק מעבדה כללית פיפטור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רב ערוצי</td><td>ספק מעבדה כללית מאגר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כביסה RNA</td><td>מחקר Zymo</td><td>R1003-3-48</td><td>48 מאגר</td></tr><tr><td>עיכול DNA</td> מ"ל <td>Zymo Research</td><td>E1010-1-4</td><td>4 מ"ל</td></tr><tr><td>RNA מאגר טרום שטיפה</td><td>Zymo Research</td><td>R1020-2-25</td><td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>מנתח אוזון אולטרה סגול</td> 25 מ"ל <td>Teledyne API</td><td>דגם T400</td><td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td></tr><tr><td>בקרי זרימת מסה</td><td>Sierra Instruments Inc</td><td>Flobox 951/954</td><td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td></tr></tbody></table>

ריאות microrna פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

פרופיל MicroRNA (miRNA) הפך לעניין חוקרים עובדים בתחומים שונים מחקר בביולוגיה ורפואה. מחקרים הנוכחי מראים התחלה מבטיחה בעתיד הכרוכים miRNAs באבחון, טיפול של מחלות ריאה. . כאן, אנחנו להגדיר עבור miRNA פרופיל כדי למדוד את השפע היחסי של קבוצת miRNAs חזה להסדיר גנים דלקתיים רקמת הריאה של מודל העכבר דלקת דרכי הנשימה אוזון-induced פרוטוקול. כי הוכח כי במחזור רמות הורמון המין יכול להשפיע ברגולציה של הריאה מולדת חסינות אצל נקבות, מטרת שיטה זו היא לתאר את miRNA דלקתיות של פרופיל פרוטוקול בעכברים נקבה, אם לוקחים בחשבון את ייחום שלב של כל בעל חיים בזמן החשיפה האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה ישים miRNA של גילוי ושל יעד שיטות זיהוי באמצעות limma, תוכנה R/Bioconductor, ו אנליזה פונקציונלית תוכנה כדי להבין את ההקשר הביולוגי ואת מסלולים הקשורים ביטוי דיפרנציאלי miRNA.

סוגי תאים שונים שנצפתה מריחות משמשים לזיהוי השלב ייחום העכבר (איור 1). אלו מזוהים על ידי תא מורפולוגיה. במהלך proestrus, תאים הם באופן כמעט בלעדי אשכולות של צורת עגול, בנוי היטב nucleated לתאי האפיתל (איור 1 א'). כאשר העכבר נמצא בשלב ייחום, תאים הם cornified לתאי האפיתל הקשקש, נוכח בצפיפות אשכולות (איור 1B). במהלך metestrus, תאי אפיתל cornified ואת אורך חייהם נראים (איור 1C</stro...

כאן אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי ריאות miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים שימוש בעכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר בשלבים שונים של ייחום.

ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חסינות ריאות על איך להעריך את הביטוי של microRNAs כי הם צפויים לווסת גנים דלקתיים בתוך הריאה. טכניקה זו מציעה את הדרך הפשוטה לזיהוי התרומות של הורמונים במחזור ביטוי microRNA ריאות. כדי להעריך את שלב מחזור estrous, לרסן באופן ידני עכבר נקבה בן שמונה עד תשעה שבועות ולהציג את הקצה של פיפטה פלסטיק 10 מיקרוליטר מלא מים טהורים במיוחד לתוך הנרתיק.יש לשטוף בעדינות ארבע עד חמש פעמים כדי לאסוף דגימה, ולהפקיד את הסומק הסופי של נוזל הנרתיק על מגלשת זכוכית. לאחר מכן התבונן סומק הנרתיק מוכתם תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 20X. לחשיפות לאוזון ואוויר מסונן, מניחים עד ארבעה עכברים באחד משני מיכלי זכוכית בודדים באורך 1.2 ליטר עם מכסי רשת תיל.שים מיכל זכוכית אחד בתא אוזון ואחד בתא חשיפה לאוויר מסונן. לאחר מכן להתאים את ריכוז האוזון לשני חלקים למיליון, הסרת המיכל לאחר שלוש שעות. ארבע שעות לאחר החשיפה, לחטא את פני העור החשופים של העכבר הניסיוני הראשון עם 70% אתנול לחתוך את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות.השתמש מדפים כדי לטבול 1.5 מיליליטר RNase ללא צינור מיקרו צנטריפוגה בחנקן הנוזלי, ו הצמד להקפיא את הריאה שנקטפה בחנקן הנוזלי. לאחר מכן השתמש pulverizer רקמת נירוסטה כדי mascerate את הריאה כולה, ולפצל את הרקמה מרוסקת בין שני צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר

lung-microrna-profiling-across-the-estrous-cycle-in-ozone-exposed-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן, אנו מתארים כיצד לזהות את השלב של הרבייה העכברית (proestrus, ייחום, metestrus, או diestrus) על ידי אוסף פשוט, לא פולשנית והערכת ציטולוגיה של דגימות למרוח בנרתיק. בנוסף, אנו מתארים כיצד ציטולוגית נרתיק משקפת רמות הורמונים במחזור שעשו את המעבר דרך מחזור הרבייה העכברי.

ביצוע שטיפת נרתיק, כתמים ויולטו קריסטל, והערכת ציטולוגית נרתיק לאחסון זמני מחזור הייחום חולל זיהוי עכבר

שתי פרדיגמות תרגיל נבדקו על חדש שפותח במודל עכבר בגיל המעבר כימי שגרם לבחון את ההשפעה של גיל המעבר על יכולת גופנית והסתגלות לב לפעילות גופנית.

שיטה לחקר ההשפעה של כשל שחל מושרה כימי ביכולת גופנית ולב הסתגלות בעכברים

מחקר זה מתאר את הדור מוצלחת של מודל חדש של בעלי חיים מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון.

דור של מחלת ריאות חסימתית כרונית מודל בעכברים על ידי חשיפה חוזרת ונשנית האוזון

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לקביעת האם חשיפה לאוזון, קריטריון מזהם אוויר, פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis בvivo. פרוטוקול זה מנצל בדרך כלל ריאגנטים וטכניקות והוא יכול להיות מותאם מודלים מרובים של פגיעה בריאות כדי לקבוע את ההשפעות על מכתשי מקרופאג efferocytosis.

בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון

אוזון משולב ועכברים חשופים אנדוטוקסין חיידקי מראים מוות תאי נרחב, כולל זה של נויטרופילים. ראינו התאמות תאיות כגון שיבוש של lamellipodia ציטוסלטל, ביטוי תאי מוגבר של subunit סינתאז V ATP מורכב β ואנגיוסטין בשטיפת ברונכו-מכתשית, דיכוי התגובה החיסונית ריאות וגיוס נויטרופילים מעוכבים.

הדמיה של התאמות תאיות ריאות במהלך אוזון משולב ו- LPS המושרה פגיעה ריאות חריפה מורין

מוצגת שיטה למיקרודיסקציה של oviduct העכבר המאפשרת איסוף של מקטעים בודדים תוך שמירה על שלמות RNA. בנוסף, הליך פירוק תאים oviductal לא אנזימטי מתואר. השיטות מתאימות לניתוח גנים וחלבון לאחר מכן של מקטעי oviductal שונים מבחינה תפקודית ותאי oviductal מנותקים.

ניתוח מיקרו-דיסקט וניתוק של אובידוקט מורין: זיהוי מקטע בודד ובידוד תא בודד

בפרוטוקול זה, שיטת טיהור זיקה ריבוזום מתרגם (TRAP) ובידוד גרעינים המתויגים בסוגי תאים ספציפיים (INTACT) הותאמו לחקירה זוגית של שעתוק השחלות הספציפי לתא ואפיגנום באמצעות מודל עכבר NuTRAP שחצו לקו עכבר Cyp17a1-Cre.

חקירה זוגית ספציפית לתא של העכבר, השחלות אפיגנום ושעתוק

הורמון מגרה זקיק (FSH) ברקמות ואיברים חוץ-גונדליים שונים קשור לפתוגנזה של מחלות מרובות. ניתן להשתמש במודל העכבר שעבר כריתת שחלות וטיפול ב- FSH (OVF) כדי לחקור את הפעולות החוץ-גונדליות של FSH.

חקר השפעות עצמאיות של הורמון מגרה זקיקים in vivo במודל עכבר

מאמר זה מספק תיאור מפורט של מבחן המזון הקבור וניסוי אפליית ריח חברתי כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה למזהמים סביבתיים בשאיפה על תפקוד חוש הריח בעכברים.

חקר ההשפעות של מזהמים סביבתיים בשאיפה על תפקוד חוש הריח בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת היפוקסיה בעכברים יילודים על ידי מסירתם בסביבות מבוקרות עם ריכוזי חמצן משתנים. מודלים של עכברים שנחשפו לשינויי חמצן בלידה שינו לאורך זמן את הביטוי של miRNAs המעורבים באינדוקציה של שינויים פנוטיפיים התנהגותיים כגון אוטיזם.

היפוקסיה משנה את רמות ה-miRNAs המעורבים בתורשה לא מנדלית של הפרעת הספקטרום האוטיסטי בעכברים

למדו שיטה להערכת ביטוי microRNA בריאות עכברות החשופות לאוזון או אוויר מסונן, תוך התחשבות בשלבי מחזור הייחום. טכניקה זו מאפשרת לחקור את השפעת ההורמונים על תגובות דלקתיות בריאות.

ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

גלה סרטונים נוספים