Name: באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למדו לכמת התחייבות מול מטרות תרופתיות באמצעות הדמיה בעלת תוכן גבוה בשיטת CETSA תאית. שיטה זו מאפשרת לזהות אינטראקציות חלבון-תרופה ללא צורך בניתוק תאים מודבקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים להכיר תשתית תמיכה מן המדע החיים מעבדה קרולינסקה Institutet. המחברים להכיר גם קלט ודיונים עם מיכאלה Vallin, מגדלנה Otrocka, תומאס Lundbäck.

1. זריעה של תאים
הערה: לקבלת סקירה כללית של זרימת העבודה ראה איור 1. רשימה מפורטת של נוגדנים וחומרים זמינים את הטבלה של חומרים.
<ol><li>לפני זריעה של התאים, לקדוח חורים עם מקדח רגיל במסגרת שחורה 384-ובכן הדמיה assay צלחות כדי להימנע מלהיות לכוד מתחת לצלחת מאוחר יותר במהלך השלב חימום בועות אוויר. כדי להימנע חלקיקי פלסטיק כניסה הבארות במהלך שלב זה וכדי לשמור על תנאים סטריליים, לאטום הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק או לכסות את הצלחת לפני קידוח בשכונה תרביות רקמה. בדרך כלל, די 3 חורים בקוטר 3.5 מ מ בכל צד של הלוח (הקצר).</li>
	<li>הכן ספסל זרימה שכבתית על ידי ניקוי עם 70% אתנול. בעקבות טכניקות סטנדרטי תרביות רקמה aseptic, להסיר מדיה תא הבקבוק או צלחת. לשטוף תאים עם 5-10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל טריפסין הבקבוקון. דגירה. הבקבוק ב 37 ° C עד לנתק התאים A-431. לספור התאים או באמצעות מונה haemocytometer או תא. הכן תא השעיה של 50,000 תאים למ"ל במדיום תרבות.</li>
	<li>לוותר על 40 µL תא השעיה (ויתור צפיפות תא הסופי של 2,000 תאים לכל טוב) לתוך כל טוב של צלחת assay באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או pipet רב-ערוצי, בהתאם קנה המידה של הניסוי. בקצרה להעביר את הצלחת מצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה על החלק התחתון של הלוח.</li>
	<li>כדי למזער תופעות צלחת-קצה, לאפשר את התאים להסתפק בחלק התחתון של הלוח assay 20 דקות בטמפרטורת החדר האחורי של מכסה המנוע זרימה שכבתית. אז, במקום את הצלחת במיכל פלסטיק עם מגבות נייר לחה כדי להבטיח אווירה לח. לפני השימוש, נגב את מיכל פלסטיק עם 70% אתנול.</li>
	<li>תקופת דגירה בתיבת עם לוחית וזמינותו של 2-3 ימים-37 ° C ו- 5% CO2 ב חממה humidified המקובלת. לפקח על confluency של התאים עד 50-75%, כפי מוערך על ידי בדיקה ויזואלית עם מיקרוסקופ אור.</li>
</ol>2. טיפול מורכבות
<ol><li>ביום של הניסוי, תשאף האמצעי בכל טוב בעזרת דסקית צלחת. מניחים את הצלחת על צלחת למכונת הכביסה, בחר את התוכנית השאיפה. אם דסקית צלחת אינה זמינה, ואז הנוזל ניתן להסיר על ידי היפוך לצלחת עם טוויסט יד מהירה על מגש הפסולת או כיור. הסרה מלאה של נוזל חיוני עבור ביצועים טובים. כל נוזל עודף מוסר לאחר מכן על ידי שמרחתי עם מגבות נייר.</li>
	<li>להוסיף 30 µL של תרכובות מדולל לריכוז הופקעו בינוני התרבות התא באמצעות dispensing אוטומטיות או פיפטה רב-ערוצי בהתאם קנה המידה של הניסוי. מבטיחים להוסיף שלילי (דימתיל סולפוקסיד) ושליטה חיובי (ליגנד ידוע) של כמה בארות שהלוח וזמינותו. מאז זה וזמינותו shift תרמי, זה הכרחי כי ריכוז מתחם חורגת קבוע דיסוציאציה להתבונן ייצוב חלבונים. לפיכך, קו מנחה קשה ריכוז מתחם פי 50 - 100 IC50, אבל יותר פירוט תיאורי עבור ריכוזים במתחם נמצאים במקטע דיון. הערה: דימתיל סולפוקסיד והסבילות של הקווים התא צריך להיבדק לפני הניסוי.</li>
	<li>חותם הצלחת assay שטופלו מתחם עם צלחת לנשימה לאטום, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה humidified במשך 30 דקות.</li>
</ol>3. לחמם אתגר
<ol><li>ראשית, הגדר את המים הרותחים לטמפרטורה הרצויה. שימו לב כי הטמפרטורה הסופית אליה ניתן להגיע בתוך הבארות של צלחת assay יכול להיות שונה הטמפרטורה הסופי באמבט מים. לחקור את ההיסט מראש עם מד חום דמה צלחת, צמד תרמי. זה בדרך כלל לוקח 30 דקות על האמבטיה לייצב את הטמפרטורה הרצויה.</li>
	<li>כדי לוודא כי הטמפרטורה הרצויה היא להגיע בתוך הבארות של צלחת assay במהלך השלב חימום, להכין צלחת דמה unsealed המכיל באותו אמצעי אחסון בינוני כמו הצלחת וזמינותו.</li>
	<li>הסר את הצלחות וזמינותו של החממה. . תוריד את החותם לנשימה, לאטום מחדש את הצלחת assay המכילות את התאים שטופלו מתחם ברדיד אלומיניום דבק חזק על מנת להבטיח כי אין מים לדלוף לתוך הבארות במהלך החימום עוקבות באמבט מים. ודא קדיחת חורים במסגרת צלחת נגיש.</li>
	<li>הניחו את הצלחת assay ואת את הצלחת דמה באמבט מים עם חלקו התחתון של הלוח לכיוון פני המים כדי לאלץ את כל האוויר שנותרו בחוץ מתחת הצלחות.</li>
	<li>נטר את הטמפרטורה בתוך הבארות של צלחת בובה חדשה באמצעות מדחום צמד תרמי.</li>
	<li>מחממים את הצלחת assay באמבט מים במשך 3 דקות. מיד העברה assay וצלחת טמבל אחר המים הרותחים עם מזג חדר מים להתקרר למשך 5 דקות. הצלחת assay מוכן כעת עיבוד נוסף.</li>
</ol>4. קיבוע
<ol><li>לוותר על µL 10 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) ישירות לצלחת assay באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. הערה: כמה כתות ומייצבים מסווגים מסרטנים, צריכה להיות מלווה תקנות הבטיחות מוסדיים.</li>
	<li>האחות הפתרון PFA ולשטוף את התאים עם 300 PBS µL בעזרת דסקית צלחת. מניחים את הצלחת על צלחת למכונת הכביסה, בחר את התוכנית השאיפה. הערה: הליך זה מוטבה באמצעות פרוטוקול גלישה על צלחת למכונת הכביסה בו נוזלי הוא בו זמנית בגליל, הוסר. אם הצלחת מכונת. כביסה או הליך דומה אינה זמינה, הצעד כביסה לחלופין ניתן לבצע באופן ידני.</li>
	<li>
ידני שטיפה הליך: הסר את הנוזל מן הבארות על ידי היפוך לצלחת עם טוויסט יד מהירה על מגש הפסולת או כיור. הסרה מלאה של נוזל חיוני עבור ביצועים טובים. להוסיף µL 80 ל- PBS עם פיפטה רב-ערוצי להפוך את הצלחת שוב כמפורט לעיל, חזור על התהליך הכביסה פעמיים. לאחר שעבר כביסה, כתם את הצלחת נגד מגבות נייר נקי כדי להסיר עודפי הנוזל.</li>
</ol>5. permeabilization
<ol><li>הוסף 20 µL של 0.1% (v/v) NP-40 לבארות עם pipet רב-ערוצי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשטוף את התאים באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).</li>
	<li>לחלופין, בעת הצורך, החל אנטיגן אחזור פרוטוקול, למשל:<ol>
<li>להוסיף µL 20 1% למען חברה דמוקרטית הבארות עם pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ולשטוף לפי אותו הנוהל המתואר לעיל (שלב 4.2).</li>
		<li>מוסיפים 80 μL של גליצין 10 מ מ ב- pH 7.2, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. האחות הפתרון גליצין בעזרת דסקית צלחת על-ידי הצבת מכונת כביסה צלחת ובחירה פרוטוקול השאיפה. עיין בהערות 2.1 ו- 4.2 אם דסקית צלחת אינה זמינה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. חסימת
<ol><li>להוסיף 15 µL של 1% (w/v) אלבומין שור (BSA) ב- PBS הבארות באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה, או ללון ב 4 ° C בחותם צלחת רדיד אלומיניום.</li>
</ol>7. נוגדן ראשוני
<ol><li>האחות הפתרון חסימה בעזרת דסקית צלחת על-ידי הצבת מכונת כביסה צלחת ובחירה פרוטוקול השאיפה. עיין בהערות 2.1 ו- 4.2 אם דסקית צלחת אינה זמינה.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של נוגדן ראשוני מדולל בהתאם 1% (w/v) BSA ב- PBS כדי הבארות באמצעות של pipet רב-ערוצי. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה, או ללון ב 4 ° C בחותם צלחת רדיד אלומיניום.</li>
</ol>8. משני נוגדן
<ol><li>האחות הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף הבארות לפי ההליך כמתואר לעיל (שלב 4.2).</li>
	<li>להוסיף 10 µL של אלקסה 488 נוגדנים משניים מדולל בהתאם 1% (w/v) BSA ב- PBS. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאטום את הצלחת החותם רדיד אלומיניום דבק כדי להגן מפני אור. הערה: להגן על צלחת מאור במהלך זה והשלבים הבאים.</li>
</ol>9. גרעיני מכתים ומסיכת תא
<ol><li>להוסיף 10 µL של גרעיני צבע מדולל עד 0.05 מ"ג/מ"ל ב- PBS כדי הבארות באמצעות של pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות.</li>
	<li>האחות של נוגדנים משניים והפתרון Hoechst ולשטוף הבארות באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).</li>
	<li>להוסיף 10 µL של מסיכת תא מדולל כדי 200 ng/mL ב- PBS כדי הבארות באמצעות pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
	<li>האחות הפתרון מסכת תא ולשטוף הבארות באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).</li>
	<li>לוותר על µL 60 ל- PBS כדי כל הבארות באמצעות צלחת למכונת הכביסה, מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי, לאטום הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק.</li>
</ol>10. תמונה רכישה וניתוח
<ol><li>ללכוד תמונות ב- imager תוכן גבוהה באמצעות ערוצי פלורסנט 3: דאפי (387/447), ה-GFP (472/520) ו TexasRed (562 624). רוכשים 4 תמונות לכל טוב באמצעות המטרה X 10. שימוש אוטומטי לייזר פוקוס אוטומטי ולהחיל binning 2 במהלך הרכישה. לאחסן תמונות כקובצי tiff בקנה מידה 16 סיביות, אפור יחד עם מטה-נתונים.</li>
	<li>ניתוח תמונות בעזרת תוכנה הזמינים. זיהוי גבולות התא באמצעות אלגוריתם תא מניה עם דאפי (גרעין) TexasRed (ציטופלזמה).</li>
	<li>לחלץ את העוצמה הממוצעת עבור כל אורכי הגל רכשה עבור ניתוח נתונים נוסף.</li>
	<li>לחשב את הגורם-Z כדי להבטיח את היציבות של וזמינותו.</li>
	<li>לחשב מייצב % באמצעות הנוסחה הבאה: 100 * (1-(עוצמת טוב – שליטה שלילי ממוצע עוצמת טוב) / (ממוצע עוצמת אינטנסיביות שליטה-ממוצע חיובי שליטה שלילי)). הנה שליטה שלילי דימתיל סולפוקסיד והוא בקרה חיובית החומר הפניה. מאז ייצוב המרבי בין תרכובות יכול להשתנות, למעשה להיות גדול מ הפקד חיובי עבור עיקולים ITDRF, עוצמות המזערי והמרבי מייצב עבור כל המתחם משמשים לפעמים במקום ערכי העוצמה של הבארות שליטה .</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R%26D+productivity+at+AstraZeneca%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li>
<li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165(2015).</li>
<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+flow+of+medicines+be+improved%3F+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li>
<li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+validation+using+chemical+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li>
<li>Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li>
<li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091(2015).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Thermal+Shift+Assay%3A+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li>
<li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li>
<li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040(2016).</li>
<li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li>
<li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+%28CETSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li>
<li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAxelsson%2C+H+%22Assay+Guidance+Manual+%5BInternet%5D%22">Assay Guidance Manual [Internet]</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).</li>
<li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים לדווח.

כפי שפורט בסעיף התוצאות, ישנם מספר שלבים מרכזיים להליך. ראשית, חשוב לזהות ריאגנט זיקה באיכות גבוהה. אנו ממליצים על הקרנת ספרייה קטנה של נוגדנים עבור כל מטרה רצויה. לאחר שנבחר נוגדן ראשוני, חשוב גם לאמת את המערכת עבור מספר אתרי קישור שונים של חלבון היעד במידת הצורך. הקרנה הנגד של תרכובות מפריע לאות assay, כפי שמוצג באיור 2C על-ידי השמטת האתגר חום הוא מעודדים. כאשר אות מופחת בנוכחות של ליגנד נצפית, פרוטוקול אחזור אנטיגן כפי שמתואר בשלב 5.2 יכול להיבדק. חימום לא אחיד של הלוחות יכול לגרום לתנודו...

בעת פיתוח תרופות חדשות או כימי הגששים חיוני כמה את התצפיות מהדם או פונקציונלי readout למדידות של תפוסת היעד או אירוסין תאים חיים1,2,3. נתונים אלה נחוצים כדי לוודא מולקולה קטנה יגיע למעשה המטרה הרצויה שלו והן כדי לאמת את ההשערה ביולוגי מאחורי חלבון המטרה בחירת4,5. יתר על כן, במהלך פיתוח תרופות, דגם מערכות המורכבות הגוברת משמשים כדי לבחור לאמת חוט המורכב לפני ניסויים קליניים. כדי לאשר תרגום של הביולוגיה על פני המערכות פרה, שיטות איתור סמים-יעד האירוסין וליווי ביולוגיה לאורך כל תהליך הפיתוח זה הם קריטיים.
סמים-יעד האירוסין באופן מסורתי מאתגר כדי לפקח על תאים חיים עם מולקולות קטנות unfunctionalized, חלבונים, במיוחד ברמה תא יחיד עם רזולוציה מרחבית6,7. אחת השיטות האחרונות כדי לבחון האינטראקציה בין יבוצעו בהם שינויים-תרופות, חלבונים בתאים חיים וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) שבו הנוצרות על-ידי ליגנד ייצוב של חלבון יליד בתגובה אתגר חום הוא כימות8, 9,10. זו מושגת על ידי לכימות חלבון מסיס שנותרו לאחר חשיפה אתגר חום. חשיפה ראשונית של CETSA, תספיג שימשה למטרות איתור. כדי לאפשר הקרנה קמפיינים ופגע triaging של אוספים מתחם גדול יותר, המאמצים כדי להגדיל את התפוקה של ניסויים CETSA יש להוביל להתפתחות של מבחני הומוגנית, המבוססים על microplate מספר10,11. עם זאת, מגבלה אחת באמצעות שיטות אלה היא כי הם הם המתאימים ביותר כיום לטיפול המורכב ב השעיות תא האיתור דורש פירוק התא, מוביל לאובדן מידע מרחבי. CETSA יכול להיות מיושם ניסיוניים כמו משמרת הנוצרות על-ידי ליגנד בטמפרטורה צבירת תרמי (Tagg) גם ריכוז אחד של המולקולה קטנה או ריכוז ליגנד לייצב את החלבון בטמפרטורה יחיד. האחרון נקרא במינון איזותרמי התגובה טביעות אצבעות (ITDRF) שמסמלת את התלות של מדידות אלה על תנאי ניסויי ספציפי.
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי למדוד את ההתחייבות היעד באמצעות CETSA ב תאים חסיד על ידי זיהוי נוגדנים (אם) immunofluorescent עם מיקרוסקופ גבוהה-תוכן12. הליך זה מרחיב את הפלטפורמה CETSA המקורי כדי לאפשר את החד-תאיים כימות של היעד האירוסין עם שימור לוקליזציה subcellular. ראוי לציין, בניגוד לדיווחים קודמים רבים, בהליך זה מתחם הטיפול מתבצע בתאים חסיד חי ללא ניתוק משטח או כביסה לפני האתגר חום, וכך לשמר את האיזון מחייב הוקמה שאנו שואפים למדוד13. כיום, השיטה מאומתת עבור מטרה אחת חלבון p38α (MAPK14), תא מספר שורות, אנו מקווים כי על-ידי שיתוף הליך זה הטכניקה שניתן להחילה בהרחבה פרוטאום נמס. אנו צופים כי פרוטוקול זה ניתן להתאים לכל אורך הצינור פיתוח התרופה של ההקרנה, פגע triaging דרך כדי ניטור של היעד האירוסין ויוו.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td>לניתוק תאים ותת-תרבות</td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד (PFA)ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>28908</td><td>קיבוע</td></tr><tr><td>עז אנטי-ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 488 נוגדן מצומד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>HCS CellMask כתם אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H32712</td><td>כתם ציטופלזמה</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56741</td><td>לחדירות</td></tr><tr><td>כתם Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>כתם גרעיני</td></tr><tr><td>Dulbecco' s שונה Eagle' s medium (DMEM) - גלוקוז גבוה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6429</td><td>רכיב מדיה של תרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>רכיב מדיה של תרבית תאים</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>רכיב מדיה של תרבית תאים</td></tr><tr><td>Corning, חותם צלחת נושם</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3345</td><td>לשלב הדגירה של קופוונד</td></tr><tr><td>נוגדן ארנב נגד p38 [E229]</td> <td>Abcam</td><td>ab170099</td><td>נוגדן ראשוני, LOT: GR305364-16</td></tr><tr><td>Falcon, לוחות הדמיה תחתונים שקופים שחורים 384 בארות</td><td>VWR</td><td>736-2044</td><td>לוחות הדמיה</td></tr><tr><td>Greiner, לוחות פוליפרופילן בנפח נמוך 384 בארות</td><td>VWR</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום דביק</td><td>VWR</td><td>30127790</td><td></td></tr><tr><td>אטם אלומיניום מתקלף</td><td>Agilent</td><td>24210-001</td><td>עבור PlateLoc</td></tr><tr><td>LY2228820</td><td>Selleckchem</td><td>S1494</td><td>p38&alpha; מעכב</td></tr><tr><td>PH797804</td><td>Selleckchem</td><td>PH797804</td><td>p38&alpha; מעכב</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>Selleckchem</td><td>S1574</td><td>p38&alpha; מעכב</td></tr><tr><td>SB203580</td><td>Tocris</td><td>1202</td><td>p38&alpha; מעכב</td></tr><tr><td>AMG 548</td><td>Tocris</td><td>3920</td><td>p38&alpha; מעכב</td></tr><tr><td>RWJ 67657</td><td>Tocris</td><td>2999</td><td>p38&alpha; מעכב</td></tr><tr><td>L-Skepinone</td><td>CBCS אוסף</td><td></td> תרכובות <td>p38&alpha; מעכב</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>חומר חוסם</td></tr><tr><td>SDS (נתרן דודציל סולפט)</td><td>BDH</td><td>44244</td><td>המשמש לאחזור אנטיגן</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8898</td><td>בשימוש בתאי אחזור אנטיגן</td></tr><tr><td>A-431 ATCC</td><td></td><td>ATC-CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550</td><td>Labcyte</td><td></td><td>להכנת צלחות מורכבות</td></tr><tr><td>אוטם צלחות</td><td>Agilent</td><td></td><td>PlateLoc</td></tr><tr><td>מתקן ריאגנטים בתפזורת</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td>Multidrop Combi</td></tr><tr><td>נוזל אוטומטי טיפול</td><td>בפלטפורמת טיפול בנוזלים Agilent Bravo; משמש להכנת צלחות מורכבות</td><td></td> מכונת כביסה צלחות Tecan אמבט מים הידרוסיד Julabo TW12 צמד תרמי VWR מדחום מעבדה הניתן למעקב מצלמת תוכן גבוה מכשירים מולקולריים ImageXpress Micro XLS Widefield תוכן גבוה <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מערכת אנליזה</td></tr></tbody></table>

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Quantitating את האינטראקציה של מולקולות קטנות עם המטרה חלבון המיועד שלהם הוא קריטי עבור פיתוח תרופות, היעד אימות ובדיקת בדיקה כימית. שיטות למדוד תופעה זו ללא שינוי של חלבון המטרה או מולקולה קטנה הם יקר במיוחד אבל טכנית מאתגר. וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) היא טכניקה אחת לעקוב אחר היעד האירוסין בתאים חיים. כאן, אנו מתארים עיבוד של פרוטוקול CETSA המקורי, אשר מאפשר למדידות תפוקה גבוהה תוך שמירה על לוקליזציה subcellular ברמה תא בודד. אנו מאמינים שפרוטוקול זה מציע מקדמות חשוב ליישום של CETSA עבור אפיון מעמיק של המתחם-יעד אינטראקציה, במיוחד באוכלוסיות הטרוגניות של תאים.

פרוטוקול המתוארים באיור 1 מתאר את זרימת העבודה הבסיסי עבור הפעלת מבחני CETSA על תאים חסיד עם זיהוי של חלבון מסיס שנותרו על ידי הדמיה תוכן גבוהה. זרימת עבודה זו ניתן להתאים בקלות בכל שלבי ההתפתחות assay על-ידי שינוי הפריסה צלחת של תרכובות או ריאגנטים14. אנחנו פירוט התוצאות הצפויות כמה צפוי להשתמש במקרים שלהלן.
זיהוי נוגדנים ופיתוח וזמינותו. תנאי הכרחי לקבלת תוצאות מוצ...

מדידות של התרופה היעד אירוסין הן גורם מרכזי פיתוח תרופות יעיל ובדיקת בדיקה כימית. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת סמים-יעד האירוסין באמצעות הדמיה תוכן גבוהה לאגדת microplate תואמי וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA).

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה כימית וגילוי סמים. כגון, האם המתחם שלך נקשר לחלבון היעד? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שאין דרישה של ניתוק של התאים חסידים.ולוקליזציה מרחבית יכולה להיקבע על ידי הדמיה. למרות שהחלנו שיטה זו בשורות תאים, ניתן גם ליישם שיטה זו על מערכות תאים אחרות כגון תרבויות ראשיות ותרבויות אחרות. לפני זריעת התאים, מניחים לוחות דגימת הדמיה שחורים של 384 היטב במכסה המנוע של תרבות הרקמה, ומכסים את הלוחות בנייר אלומיניום לפני השימוש במקדחה סטנדרטית כדי ליצור שלושה חורים בקוטר 3.5 מ"מ בשני קצות כל צלחת.כאשר הצלחות מוכנות, השתמש בטכניקה אספטית כדי לשטוף את תרבות התא A-431 עם 5 עד 10 מיליליטר של PBS. ו דגירה התאים עם שני מיליליטר של טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס עד התאים להתנתק. לאחר הספירה, לדלל את התאים ל 5 פעמים 10 לתאים 4 למיליליטר בינוני תרבות, וזרע 40 microliters של תאים לכל באר של כל צלחת בדיקה.בעדינות לנער כל צלחת מצד לצד לאחר הזריעה כדי להבטיח הפצה הומוגנית של התאים על פני התחתון היטב. כדי למזער את השפעות קצה הלוח, אפשר לתאים להתיישב בתחתית לוחות ההתזה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחלק האחורי של מכסה המנוע של הזרימה למינארית לפני הצבת הצלחות בתא לח מותאם אישית במשך יומיים עד שלושה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ביום הניסוי, השתמש בכביסה כדי לשוות את המדיום מכל באר.ותוסיפו 30 מיקרוליטרים של תרכובת הריבית בריכוז הניסוי המתאים לבירות הניסוי המתאימות. לאטום את לוחות ההתאספה המטופלים בתרכובת עם אטמי צלחת נושמים. ולהחזיר את הצלחות לאנקובטור תרבות התא במשך 30 דקות.כדי לחשוף את התאים לאתגר חום, הגדר תחילה את אמבט המים לטמפרטורה הניסיונית המתאימה, והצב צלחת דמה לא חתוך המכילה את אותו נפח של מדיום לכל צלחת מים לאמבטיה, יחד עם מדחום תרמוקופול לניטור הטמפרטורה בתוך הבאר. כאשר הטמפרטורה הניסיונית המתאימה הושגה, להסיר את החותם נושם מכל צלחת מיסטי לחתום מחדש את הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק הדוק כדי להבטיח כי אין דליפות מים לתוך הבאר במהלך החימום הבא שלהם באמבט המים. שמירה על החורים שנקדחו בתוך מסגרת הלוחית נגישה.מניחים את צלחות ההצבה וצלחת דמה חדשה לאמבט המים, כאשר תחתיות הצלחות זוויתיות לכיוון פני המים כדי לכפות את כל האוויר שנותר מתחת לצלחות, ולהתחיל לעקוב אחר הטמפרטורה של צלחת הבובה החדשה. חימום שווה של הצלחת הוא קריטי לביצועי ההסקה. יש לדאוג למקם את הצלחת באמבט המים כך שאין בועות אוויר לכודים מתחת.לאחר שלוש דקות, מיד לקרר את הצלחות באמבט מים שני של מים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפני הניתוח שלהם. כדי לדמיין את התאים, הוסיפו תחילה 10 מיקרוליטרים של 16% paraformaldehyde ישירות לצלחות ההסקה לצורך דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף תקופת התקבעון, לשטוף את התאים עם 300 microliters של PBS על מכונת הכביסה צלחת, ולהוסיף 20 microliters של 0.1% NP40 עבור דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים כפי שהוכח. ולחסום את התאים עם 15 microliters של אלבומין סרום 1%, או BSA, במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמשו בכביסה כדי לשאוף את סרום החסימה, והוסיפו 10 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי המעניין את הבארות המתאימות עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם 300 microliters של PBS, ולתייג את התאים עם 10 microliters של הנוגדן המשני המתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. עבור כתמים גרעיניים של התאים, להוסיף 10 microliters של צבע גרעיני מתאים לכל באר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ולשטוף את התאים PBS כפי שהודגם.סמן את התאים עם 10 microliters של מסכת תא ל הבאר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ואחריו שטיפה אחרונה עם PBS. לאחר מכן מחלקים 60 מיקרוליטרים של PBS טרי לכל באר, ואוטמים את הצלחות בנייר אלומיניום עד להדמיה.כדי לדמיין את התאים, לכוד ארבע תמונות לאורך באר בתמונה עם תוכן גבוה באמצעות ערוצי הפלואורסצנט המתאימים תחת המטרה 10 פעמים באמצעות פוקוס אוטומטי אוטומטי בלייזר והחל binning על במהלך הרכישה. לאחר מכן אחסן את התמונות כקובצי dot-tiff בגווני אפור של 16 סיביות יחד עם המטה-נתונים. אין לשבש את זיהוי הנוגדנים על ידי שינויים קונפורמיים בחלבון היעד שעשויים להיגרם על ידי קשירה ליגנד.לדוגמה, ל- BIRB796 יש שיעור חופש ארוך, וכמות מעורבות היעד אפשרית רק על-ידי החלת שלב אחזור אנטי-גני. ניסוי עקומת צבירה תרמית ייצוגית זו עבור תאים שטופלו בתרכובות בקרה חיוביות ושליליות ממחיש טווחי ייצוב חלבון טיפוסיים לאחר טיפול בתאים עם התרכובות בטמפרטורות שונות. כאן ניסוי טיפוסי של טביעת אצבע תגובת מינון isothermal מוצג להפגין טווחים מייצגים של ייצוב חלבון בתגובה מינונים שונים של תרכובת ניסיונית.היישום של אתגרי חום isothermal עבור הקרנה מורכבת לזהות קלסרים הרומן של חלבון היעד מאפשר ניתוח של מספר רב של תרכובות בריכוז אחד בבת אחת, לפני טביעת אצבע מינון-תגובה isothermal של הלהיטים כדי לאשר ייצוב חלבון היעד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי התנאים הניסיוניים המדויקים, כגון אורך וטמפרטורה של אתגר החום להשפיע על העוצמה שנצפו של התרכובות. אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehyde יכול להיות מסוכן מאוד.ואמצעי זהירות, כגון שמירה על הנחיות הבטיחות המוסדיות, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

using-high-content-imaging-to-quantify-target-engagement-adherent

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מוצגים הוא עבודה אינפורמטיקה גמישה המאפשרת ניתוח מבוסס תמונת ריבוב של תאים שכותרתו fluorescently. העבודה מכמתת סמנים גרעיניים וcytoplasmic ומחשבה טרנסלוקציה סמן בין תאים אלה. נהלים מסופקים ההפרעות של תאים באמצעות siRNA ומתודולוגיה אמינה לגילוי סמן על ידי immunofluorescence העקיף בפורמטי 96-היטב.

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

אנו מדווחים על שיטה במבחנה המאפשרת לכמת את המספר האמיתי של תאי דבק בתוך חד-שכבת תא אנדותל.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

פיתחנו פרוטוקול חדש לחקר הדינמיקה האוכלוסייה הטרוקלולרית בתגובה הפרעות. כתב יד זה מתאר פלטפורמה מבוססת הדמיה המייצרת מערכי נתונים כמותיים לאפיון סימולטני של פנוטיפים סלולריים מרובים של אוכלוסיות הטרוסלריות בצורה חזקה.

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק תיאור מפורט של הגדרת הניסוי, ניתוח נתונים להערכה של תגובות דלקתיות ב hiPSC-ECs וניתוח של אדהזיה ליקוציט תחת זרימה פיזיולוגיים.

Microfluidic Assay עבור הערכה של ליקוציט הדבקה על נגזר אנושיים לתאי גזע Pluripotent המושרה בתאי אנדותל (hiPSC-ECs)

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת כימות של תאים סרטניים דבק לצומת לימפה (LN) קריודורים. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת-פלואורסצנטית, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה של תא הגידול מחייב לתוך הכריכה.

קוונפיקציה של הדבקה תא הגידול בצומת לימפה קריוסעיפים

המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.

קוונפיקציה של אזור הדבקה בתשתית התא והפצות צורות התא ב-MCF7 Cell Monolayers

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

משטח TGT הוא פלטפורמה חדשנית לחקר גורם גדילה-אינטגרין crosstalk. תכנון הבדיקה הגמיש, הספציפיות של ליגנד ההדבקה והמודולציה המדויקת של תנאי הגירוי מאפשרים הערכות כמותיות חזקות של יחסי הגומלין בין EGFR-integrin. התוצאות מדגישות את EGFR כ'מכנו-מארגן' המכוון את מכניקת האינטגרין, ומשפיע על מכלול הידבקות המוקד ועל התפשטות התאים.

מד מתח קשירה בדיקות לכימות גורם גדילה מתווך מכניקת אינטגרין והדבקה

פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.

בדיקת סינון תוכן גבוהה לזיהוי תרכובות ציטוטוקסיות תאיות תלויות נוגדנים

במאמר זה אנו מציגים שיטה לזיהוי תרכובות המווסתות את מנגנון ADCC, מנגנון חשוב להרג תאים סרטניים של נוגדנים אנטי-סרטניים. ההשפעה ציטוטוקסית של תאי NK נמדדת בספרואידים של תאי סרטן השד בנוכחות Trastuzumab. ניתוח תמונה מזהה רוצחים חיים ומתים ותאי מטרה בספרואידים.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

למדו לכמת התחייבות מול מטרות תרופתיות באמצעות הדמיה בעלת תוכן גבוה בשיטת CETSA תאית. שיטה זו מאפשרת לזהות אינטראקציות חלבון-תרופה ללא צורך בניתוק תאים מודבקים.

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

גלה סרטונים נוספים