באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה כימית וגילוי סמים. כגון, האם המתחם שלך נקשר לחלבון היעד? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שאין דרישה של ניתוק של התאים חסידים.

ולוקליזציה מרחבית יכולה להיקבע על ידי הדמיה. למרות שהחלנו שיטה זו בשורות תאים, ניתן גם ליישם שיטה זו על מערכות תאים אחרות כגון תרבויות ראשיות ותרבויות אחרות. לפני זריעת התאים, מניחים לוחות דגימת הדמיה שחורים של 384 היטב במכסה המנוע של תרבות הרקמה, ומכסים את הלוחות בנייר אלומיניום לפני השימוש במקדחה סטנדרטית כדי ליצור שלושה חורים בקוטר 3.5 מ"מ בשני קצות כל צלחת.

כאשר הצלחות מוכנות, השתמש בטכניקה אספטית כדי לשטוף את תרבות התא A-431 עם 5 עד 10 מיליליטר של PBS. ו דגירה התאים עם שני מיליליטר של טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס עד התאים להתנתק. לאחר הספירה, לדלל את התאים ל 5 פעמים 10 לתאים 4 למיליליטר בינוני תרבות, וזרע 40 microliters של תאים לכל באר של כל צלחת בדיקה.

בעדינות לנער כל צלחת מצד לצד לאחר הזריעה כדי להבטיח הפצה הומוגנית של התאים על פני התחתון היטב. כדי למזער את השפעות קצה הלוח, אפשר לתאים להתיישב בתחתית לוחות ההתזה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחלק האחורי של מכסה המנוע של הזרימה למינארית לפני הצבת הצלחות בתא לח מותאם אישית במשך יומיים עד שלושה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ביום הניסוי, השתמש בכביסה כדי לשוות את המדיום מכל באר.

ותוסיפו 30 מיקרוליטרים של תרכובת הריבית בריכוז הניסוי המתאים לבירות הניסוי המתאימות. לאטום את לוחות ההתאספה המטופלים בתרכובת עם אטמי צלחת נושמים. ולהחזיר את הצלחות לאנקובטור תרבות התא במשך 30 דקות.

כדי לחשוף את התאים לאתגר חום, הגדר תחילה את אמבט המים לטמפרטורה הניסיונית המתאימה, והצב צלחת דמה לא חתוך המכילה את אותו נפח של מדיום לכל צלחת מים לאמבטיה, יחד עם מדחום תרמוקופול לניטור הטמפרטורה בתוך הבאר. כאשר הטמפרטורה הניסיונית המתאימה הושגה, להסיר את החותם נושם מכל צלחת מיסטי לחתום מחדש את הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק הדוק כדי להבטיח כי אין דליפות מים לתוך הבאר במהלך החימום הבא שלהם באמבט המים. שמירה על החורים שנקדחו בתוך מסגרת הלוחית נגישה.

מניחים את צלחות ההצבה וצלחת דמה חדשה לאמבט המים, כאשר תחתיות הצלחות זוויתיות לכיוון פני המים כדי לכפות את כל האוויר שנותר מתחת לצלחות, ולהתחיל לעקוב אחר הטמפרטורה של צלחת הבובה החדשה. חימום שווה של הצלחת הוא קריטי לביצועי ההסקה. יש לדאוג למקם את הצלחת באמבט המים כך שאין בועות אוויר לכודים מתחת.

לאחר שלוש דקות, מיד לקרר את הצלחות באמבט מים שני של מים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפני הניתוח שלהם. כדי לדמיין את התאים, הוסיפו תחילה 10 מיקרוליטרים של 16% paraformaldehyde ישירות לצלחות ההסקה לצורך דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף תקופת התקבעון, לשטוף את התאים עם 300 microliters של PBS על מכונת הכביסה צלחת, ולהוסיף 20 microliters של 0.1% NP40 עבור דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים כפי שהוכח. ולחסום את התאים עם 15 microliters של אלבומין סרום 1%, או BSA, במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמשו בכביסה כדי לשאוף את סרום החסימה, והוסיפו 10 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי המעניין את הבארות המתאימות עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם 300 microliters של PBS, ולתייג את התאים עם 10 microliters של הנוגדן המשני המתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. עבור כתמים גרעיניים של התאים, להוסיף 10 microliters של צבע גרעיני מתאים לכל באר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ולשטוף את התאים PBS כפי שהודגם.

סמן את התאים עם 10 microliters של מסכת תא ל הבאר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ואחריו שטיפה אחרונה עם PBS. לאחר מכן מחלקים 60 מיקרוליטרים של PBS טרי לכל באר, ואוטמים את הצלחות בנייר אלומיניום עד להדמיה.

כדי לדמיין את התאים, לכוד ארבע תמונות לאורך באר בתמונה עם תוכן גבוה באמצעות ערוצי הפלואורסצנט המתאימים תחת המטרה 10 פעמים באמצעות פוקוס אוטומטי אוטומטי בלייזר והחל binning על במהלך הרכישה. לאחר מכן אחסן את התמונות כקובצי dot-tiff בגווני אפור של 16 סיביות יחד עם המטה-נתונים. אין לשבש את זיהוי הנוגדנים על ידי שינויים קונפורמיים בחלבון היעד שעשויים להיגרם על ידי קשירה ליגנד.

לדוגמה, ל- BIRB796 יש שיעור חופש ארוך, וכמות מעורבות היעד אפשרית רק על-ידי החלת שלב אחזור אנטי-גני. ניסוי עקומת צבירה תרמית ייצוגית זו עבור תאים שטופלו בתרכובות בקרה חיוביות ושליליות ממחיש טווחי ייצוב חלבון טיפוסיים לאחר טיפול בתאים עם התרכובות בטמפרטורות שונות. כאן ניסוי טיפוסי של טביעת אצבע תגובת מינון isothermal מוצג להפגין טווחים מייצגים של ייצוב חלבון בתגובה מינונים שונים של תרכובת ניסיונית.

היישום של אתגרי חום isothermal עבור הקרנה מורכבת לזהות קלסרים הרומן של חלבון היעד מאפשר ניתוח של מספר רב של תרכובות בריכוז אחד בבת אחת, לפני טביעת אצבע מינון-תגובה isothermal של הלהיטים כדי לאשר ייצוב חלבון היעד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי התנאים הניסיוניים המדויקים, כגון אורך וטמפרטורה של אתגר החום להשפיע על העוצמה שנצפו של התרכובות. אל תשכח כי עבודה עם paraformaldehyde יכול להיות מסוכן מאוד.

ואמצעי זהירות, כגון שמירה על הנחיות הבטיחות המוסדיות, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.