הפרדת חיידקים על ידי כמות הקפסולה באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע
7 בינואר 2019
נדגים את השימוש צפיפות מקוטע הדרגתיים כדי להפריד בין אוכלוסיות חיידקים המבוססת על ייצור כמוסה. שיטה זו משמשת כדי להשוות בין כמות קפסולה בין תרבויות, לבודד מוטנטים עם פנוטיפ קפסולה ספציפית, או כדי לזהות הרגולטורים כמוסה. המתוארים כאן הוא אופטימיזציה ריצה של וזמינותו.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום Klebsiella, כגון אילו גנים משמשים לווסת כמוסה ארסיים הקשורים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מספקת אמצעי להפריד פיזית זנים מתהפך ולא התהפך, וזה יכול לשמש גם להשוואות מהירות בין זנים של ייצור כמוסה. למרות שיטה זו פותחה כדי ללמוד ויסות כמוסה Klebsiella, זה יכול להיות מיושם גם על מינים שונים של חיידקים.
בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי לשפוך את המילויים ההדרגתיים ולהוסיף את התאים מעברי צבע יכול להיות די קשה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כפי שאנו מראים את הטכניקות שקשה לשלוט, מתן הצעות וטיפים כדי לעזור למשתמש. כדי להתחיל, בחר מושבה אחת מצלחת מלאי עם לולאה סטרילית, וחסן 10 מיליליטר של מרק מתאים.
להתהגר בתרבות בן לילה. ואז להעביר את התרבות לצינור 15 מיליליטר, וצנטריפוגה. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי, והשהה מחדש את גלולת הכדור בשני מיליליטר של PBS.
חזור על הצנטריפוגה, והשליך את העל-טבעי שנוצר. ואז להשעות מחדש את גלולה בשני מיליליטר של PBS. ליצירת דילול הדרגתי של צפיפות, שלב מדיום הדרגתי של צפיפות עם PBS.
ואז aliquot 600 microliters של כל דילול הדרגתי לתוך צינורות בודדים שני מיליליטר. קח 100 microliters של תאים עם פיפטה 200 microliter, ולה מניחים את קצה פיפטה בצד של הצינור ממש מתחת למניסקוס של אחד מעברי צבע רבים. שאף את תאי החיידקים אל המילוי ההדרגתי לאט מאוד, ודאג לא לערבב את הממשק.
צנטריפוגה הצינורות המוכנים במשך 10 דקות ב 8, 000 גרם של. לאחר מכן, להעביר את הצינורות לאר מתלה כדי לדמיין את דילול הדרגתי מינימלי הנדרש כדי לשמור על התאים ממש מעל השכבה הדרגתית. ראשית, להעביר מיליליטר אחד של דילול שיפוע צפיפות מדולל ביותר לתוך צינור 5 מיליליטר עגול תחתון.
באמצעות מזרק עם מחט 1.5 אינץ', לקחת מיליליטר אחד של שיפוע הצפיפות המרוכז הבא. מניחים את המחט בתחתית הצינור ומזריקים את תכולת המזרק לאט מאוד. חייב להיות ממשק ברור בכל שלב של מעבר הצבע של הצפיפות.
אם השכבות מתערבבים, לא תשיג הפרדה נקייה של החיידקים שלך. הסר את המחט מן המילוי ההדרגתי בעדינות כדי לא להפריע את הממשק בין דילול הדרגתי. ואז למקם את הצינור במדף.
בזהירות להוסיף 600 microliters של התאים מוכנים לראש שיפוע בצינור. לאחר מכן מניחים את הצינור במתאם צינור, ולשקול את הצינור עם המתאם כדי להבטיח איזון. לאחר מכן, מניחים את מתאם הצינור ברוטור זווית קבוע בתוך צנטריפוגה ספסל העליון, צנטריפוגה הצינור במשך 30 דקות ב 3, 000 גרם של.
לבסוף, לאחר צנטריפוגה, להסיר את הצינור בזהירות, למקם אותו במדף, ולצלם את התוצאות. בפרוטוקול זה, צנטריפוגה שיפוע צפיפות שימש להפריד זנים חיידקיים מבוסס על כמה כמוסה הם מייצרים. למרות שהתוצאות המדויקות תלויות במין החיידקי, רוב הזנים ינודדו למקום אחד בתוך השיפוע.
יישום שיטה זו לספריית מוטנטים חיידקיים אמור לייצר רצועה מרכזית מעל השיפוע, רצועה צפופה פחות דרך השכבה העליונה של השיפוע, ושבר שרירי קטן בתחתית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי אין לערבב את ממשקי ההדרגה, והמילוי ההדרגתי אינו יכול להכיל בועות אוויר. בעקבות ההליך, יש לבצע שיטות אימות כגון בדיקת חומצה אורונית או מיקרוסקופיה כדי לבחון את כמויות הקפסולה.
זה חשוב במיוחד בעת שימוש בטכניקה זו עבור זנים חדשים. אל תשכח כי עבודה עם קבוצת הזארד 2 פתוגנים יכול להיות מסוכן. אמצעי זהירות כגון ציוד מגן מתקנת, דבקות בהערכות סיכונים והשלכה נכונה של תרבויות יש לנקוט תמיד בעת ביצוע הליך זה.
סקירה
מאמר זה מדגים את השימוש בשיפועי צפיפות לא רציפים להפרדת אוכלוסיות חיידקים על סמך ייצור קפסולות. השיטה מאפשרת השוואה של כמויות קפסולות בין תרבויות, בידוד של מוטציות עם פנוטיפים ספציפיים של קפסולות וזיהוי של רגולטורים של קפסולות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מִיקרוֹבּיוֹלוֹגִיָה
- בִּיאוֹלוֹגִיָה סֵּלוּלָרִית
- מחקר פָּתוֹגֶנִים
רקע
- ייצור קפסולות בחיידקים קשור לווירולנטיות.
- הבנת רגולציה של קפסולות יכולה לסייע באסטרטגיות טיפול.
- שיפועי צפיפות לא רציפים מספקים שיטת הפרדה פיזית.
- טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מינים חיידקיים שונים.
מטרת המחקר
- לייעל שיטה להפרדת זנים חיידקיים ממוכסים ולא ממוכסים.
- לאפשר השוואת ייצור קפסולות מהירה בין זנים שונים.
- לספק הדגמה ויזואלית של הטכניקה להבנה טובה יותר.
שיטות ששימשו
- חדירה של תרבויות חיידקים ודגירה לילית.
- צנטריפוגה והשעיה מחדש של כדורי חיידקים ב-PBS.
- הכנת דילולים של שיפועי צפיפות ושכבת תאים זהירה.
- צנטריפוגה להשגת הפרדה על סמך ייצור קפסולות.
תוצאות עיקריות
- הפרדה מוצלחת של זנים חיידקיים על סמך רמות ייצור קפסולות.
- זיהוי של רצועות נפרדות המתאימות לחלקים ממוכסים ובלתי ממוכסים.
- שיטות אימות כגון בדיקות חומצה אורונית אישרו את כמויות הקפסולות.
- הוכחה חשיבות שמירת ממשקי שיפוע לצורך הפרדה נקייה.
מסקנות
- השיטה יעילה לחקר רגולציה של קפסולות ב-Klebsiella וחיידקים אחרים.
- הדגמות ויזואליות הן קריטיות לשליטה בטכניקה.
- אמצעי זהירות בטיחותיים הם חיוניים כאשר עובדים עם זנים פתוגניים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to physically isolate bacterial subpopulations based on capsule expression, a key virulence factor influencing immune evasion and therapeutic resistance. By providing a semi-quantitative separation tool, it supports target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial and vaccine development programs. The approach enhances predictive confidence when evaluating capsule-related phenotypes across strain libraries or mutant collections.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of capsule biosynthesis pathways by separating high- and low-producing strains for downstream genetic analysis.
- Operational Value: Facilitates rapid phenotypic screening of mutant libraries to identify regulators of capsule production.
- Translational Value: Supports isolation of acapsular or hypercapsular mutants for use in virulence modeling and antigen selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates fractionated populations suitable for quantitative capsule assays such as uronic acid measurement.
- Operational Value: Creates standardized, reproducible inputs for high-throughput screening of compounds or genetic perturbations affecting capsule expression.
- Assay Readiness: Produces purified capsulated fractions that improve signal-to-noise ratios in downstream functional or immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links genotype to phenotype by enabling correlation of transposon insertion sites with capsule levels in sequencing workflows.
- Operational Value: Provides a scalable method to generate isogenic strains with defined capsule amounts for pharmacokinetic or efficacy studies.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement by allowing teams to de-risk targets based on validated capsule modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling progression from phenotypic screening to target identification and preclinical validation, particularly in anti-infective programs where capsule is a determinant of pathogenicity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing physical separation of strains to clarify the role of capsule in immune evasion or stress resistance.
- Screening: Enables assay-ready fraction collection for quantitative comparison of capsule production across strain variants or treatment conditions.
- Analytics: Generates distinct, visual bands that serve as semi-quantitative readouts for sorting and further analytical validation.
- Translational Research: Connects discovery-phase capsule modulation to preclinical models by providing defined phenotypic strains for infection or challenge studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for capsule phenotyping applicable across multiple bacterial targets in a portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in capsule-linked virulence by enabling direct phenotype-genotype correlation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization in capsule analysis compared to bulk culture measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target selection by providing empirical data on capsule modulation efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial or vaccine targets based on validated capsule phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture handling and density gradient preparation.
- Depends on access to centrifugation equipment capable of precise speed and temperature control.
- Necessitates careful technique to avoid mixing gradient layers or introducing air bubbles during setup.
- Must be adapted for each bacterial species through optimization of gradient concentrations and centrifugation parameters.
- Relies on post-separation validation methods such as biochemical assays or microscopy to confirm capsule levels in fractions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Preparation of Bacterial Strains of Mutant Libraries
1:40
Preparation of Gradient Dilutions and Mini-gradient Test
2:39
Preparation of Discontinuous Density Gradients
3:39
Adding Prepared Cells to Gradients and Separation by Centrifuge
4:30
Results: Density Gradient Centrifugation Used to Separate Bacterial Strains Based on Capsule Production
5:10
Conclusion
