Name: כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: למד פרוטוקול ChIP-seq מותאם לרקמת שומן חום מעכברים לחקירת שינויי היסטון וחלבונים לא-היסטוניים. השיטה מאפשרת מיפוי אינטראקציות כרומטין-חלבון בגנום ובהבנת תהליכי מטבוליזם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

השלבים לטיפול בבעלי חיים של הפרוטוקול אושרו על-ידי של אוניברסיטת בוסטון אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC).
1. יום 1: ניתוח והכנה של בת Immunoprecipitation כרומטין (ChIP)
<ol><li>המתת חסד עכברים באמצעות תא פחמן דו-חמצני (CO2), ולבצע את הקרע מיד לאחר מכן. תרסיס עכבר פרווה עם 70% אתנול לפני החיתוך. הנח את העכבר עם גבו כלפי מעלה, ואז לחתוך את העור לאורך הצוואר. לאתר את המחבט ישירות מתחת לעור בין הכתפיים (interscapular; נראה כמו שתי אונות, בצורת פרפר, עם שכבה דקה של שמן לבן כי צריך להיות בזהירות להסיר7). הערה: עבור 3 בן חודש C57BL/6J לעכבר מוזן דיאטה רגילה צ'או (משקל העכבר בטווחים בגיל הזה בין 27 ו-30 g), האונה כל בת היא כ 1 ס"מ. המשקל הכולל של בתחנה בת הוא כ- 0.15 גרם בעכברים גם זכר וגם נקבה.</li>
	<li>השתמש בלוח בת 1 בשביל 3 צ ' יפס. רפידות בת מרובים בו זמנית ניתן לעבד עד sonication.</li>
	<li>Crosslink כל עטלף פד ב 10 מ"ל פורמלין באגירה פוספט מלוחים (PBS) המכיל 1% למשך 15 דקות מסתובב ב 150 סל ד בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>להרוות crosslinking על-ידי הוספת 2.5 מטר גליצין ריכוז סופי של 125 מ מ עבור 5 דקות, מסתובב ב 150 סל ד-RT.</li>
	<li>להעביר משטח בת 500 µL פירוק היפוטוניק מאגר (10 מ מ HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 מ מ. אשלגן כלורי, 0.5 מ מ DTT, 0.2 מ מ PMSF) ולהוסיף 2 פלדת אל-חלד חרוזים (גודל: 3.2 מ"מ קוטר, ראה טבלה של חומרים) עבור כל משטח בת. השתמש מהמגן רקמות מבוסס-חרוז (ראה טבלה של חומרים) לגרוס את הרקמה.</li>
	<li>התחל עם 5 דקות על מקסימום כוח. אם יש צורך, להאריך את הזמן עד הרקמה הוא הומוגני, תאים בודדים מופרדים. להעביר את הדגימות לתוך צינור חדש צנטריפוגה ב 4 ° C ב 16,000 x g למשך 10 דקות.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור ולשמור בגדר תא על קרח. Centrifuge את תגובת שיקוע ב 4 ° C ב g 16,000 x 10 דקות למנוע אובדן של ריחוף תאים. למחוק את תגובת שיקוע הסופי, resuspend שני כדורי תא ביחד ב- 300 µL מאגר פירוק מרחביות (מרחביות 1%; EDTA 10 מ"מ; Tris-HCl pH 8, 50 מ"מ) עם 1 x מעכב פרוטאז (ראה טבלה של חומרים). דגירה על קרח למשך 10 דקות.</li>
	<li>Sonicate את lysates כדי להפיק DNA שברי 200-500 בסיס זוגות ארוך. לאחר sonication, הסרת לכלוך על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב x 16,000 g ב 4 ° C, בדוק להצלחת sonication באמצעות DNA אלקטרופורזה על ג'ל agarose 1%. עבור ג'ל בגודל בינוני, לרוץ במהירות 120 וולט; הפרדה טובה מושגת לאחר 45 דקות. הערה: Sonication אופטימיזציה עשויים להידרש כדי להשיג גודל תקין של קטעים. עם sonicator שבחרת (ראה טבלה של חומרים), פעולה זו דורשת 2 פעמים ב W הספק 320 ותדירות-20 קילו-הרץ למשך 10 דקות, באמצעות מחזורים של 30 s ב- 30/s חופש.</li>
	<li>לדלל את השבר supernatant 10-fold (נפח סופי הוא 3 מ עבור כל משטח בת) במאגר דילול שבב (מרחביות 0.01%; טריטון 1.1%; EDTA 1.2 מ מ; טריס-HCl pH 8, 16.7 מ מ; NaCl 167 מ מ) עם 1 x מעכב פרוטאז. לשמור הצידה 1% פתרון זה כרומטין (שווה ל- 30 µL עבור 3 מ"ל) כקלט של השבב. להשאיר את הקלט ללילה ב 4 ° C (עד שלב 2.4). הערה: השבר הנ ל יספק את הפניית קלט על כימות היחסית של החומר immunoprecipitated לעומת כמות הדנ א נוכח בכל מדגם לפני immunoprecipitation.</li>
	<li>הוספת נוגדן שבב (ראה טבלה של חומרים עבור נוגדנים משמש כאן כדוגמה) עד 1 מ"ל של כרומטין פתרון דגירה בין לילה ב 4 ° C עם סיבוב. לבצע immunoprecipitation מקבילים עם החיסון מראש המתאימה IgG, אם הם זמינים, או נורמלי IgG מאותו המין (למשל. רגילה ארנב IgG אם הנוגדן מיוצר ארנב). לחלופין, שמור 1 מ"ל של כרומטין פתרון עבור פקד לא-נוגדן. הערה: הכמות האופטימלית של נוגדן צריך להיקבע השפעול עבור כל נוגדן חדש, אם ריכוז נוגדן לא ידוע. אחרת, 2 – 5 µg של נוגדן הוא ההתחלה סבירה לשימוש. השתמש נוגדנים שבב-כיתה במידת האפשר, או נוגדנים יש מאומתים immunoprecipitation.</li>
</ol>2. יום 2: אוסף מתחמי המערכת החיסונית
<ol><li>להוסיף 50 µL של חלבון A Agarose 50% slurry מתחמי המערכת החיסונית, תקופת דגירה של h 1 ב 4 ° C עם סיבוב ב 150 סל ד.</li>
	<li>
גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה עבור 1 דקות x 100 g ב- 4 מעלות צלזיוס. ביצוע שוטף רציף של החרוזים עם מאגרים של הגדלת לכתחילה.
	<ol>
<li>ראשית, לשטוף עם מאגר שטיפת מלח נמוכה (150 מ מ NaCl; טריס-HCl pH 8, 20 מ מ; EDTA 2 מ"מ; טריטון-X 1%; מרחביות 0.1%), ולאחר מכן באמצעות מאגר מלח גבוהה לשטוף (500 מ מ NaCl; טריס-HCl pH 8, 20 מ מ; EDTA 2 מ מ, טריטון-X1%; מרחביות 0.1%), ולאחר מכן עם שטיפת LiCl (0.25 M LiCl; טריס-HCl pH 8, 10 מ מ; EDTA 1 מ"מ; Igepal 1%; deoxicholate 1%), ולבסוף עם טה 1 x (טריס-HCl pH 8, 10 מ מ; EDTA).</li>
		<li>לבצע כל שוטף 0.45 מיקרומטר PVDF צנטריפוגלי מסנן בעמודות (טבלה של חומרים) על ידי הראשון מעביר את החרוזים העמודות באמצעות µL 500 שטיפת מלח נמוכה המאגר. גלולה החרוזים העמודות עבור 3 דקות ב x 2500 גרם. למחוק את הזרימה דרך וחזור פעם אחת עבור כל המאגרים שטיפת ברשימה בשלב 2.2.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר השלמת את מנקי, elute את מתחמי המערכת החיסונית על-ידי הוספת µL 300 של • תנאי מאגר 1% מרחביות, M NaHCO 0.13) החרוזים pelleted בעמודות. דגירה-RT במשך 30 דקות על מטרף-400 סל ד. לאסוף את eluate על ידי ספינינג עמודות עבור 3 דקות ב x 2,500 g בשפופרת טריים.</li>
	<li>הפוך את crosslinks על ידי המקננת את eluate ואת תשומות שנאספו בשלב 1.9-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
</ol>3. יום 3: שחזור של DNA עם פנול/כלורופורם החילוץ
<ol><li>הוסף µL 300 של פנול: כלורופורם: רשות העתיקות, 1:1 eluate, תשומות. מערבולת 10 s.</li>
	<li>ספין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 21,000 x g. להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים. להוסיף 3 µL של גליקוגן, 30 µL של 3 מ' סודיום אצטט µL 750 של אתנול 100% קר. מערבולת לחנות ס' 10 ב-80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
	<li>ספין למטה ב g 21,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, לשמור את צניפה, ולמחוק את תגובת שיקוע. צניפה לשטוף עם 1 מ"ל קר 70% EtOH, ולאחר מכן ספין למטה ב 21,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 70 µL של מים נטולי DNAse.</li>
	<li>המשך לשלב 4 עבור בדיקות כרומטין התפוסה על אזורים ספציפיים גנומית על ידי תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) או לשלב 5 כדי להתכונן דגימות רצף.</li>
</ol>4. ניתוח של שבב באמצעות qPCR (Single/Multiple גנים Readout)
<ol><li>לדלל את הקלט DNA מ שלב 3.4 ליצירת עיקול רגיל הפניה. טורי דילולים של 1/10 1/100, ו- 1/1000 הן בדרך כלל מספקות ללכוד את הטווח. ליניארית, אבל בהמשך דילולים. העשויים להידרש לדוגמאות מרוכז יותר.</li>
	<li>עבור כל זוג פריימר (כאן, השתמשנו תחל מיקוד היזמים NDUFV1 ו- TOMM20), להכין שתי ערכות של תגובות qPCR: אחד באמצעות דגימות קלט מדולל מן שלב 4.1, ואת השני עם דגימות ה-DNA מבודדת על ידי immunoprecipitation מהשלב 3.4. לבצע את התגובה לכל דולר. הערה: ניתן להגדיר תגובות במקביל גנים מרובים באמצעות לוחות 96 - או 384-ובכן.</li>
	<li>1 μL של פריימר להגדיר נפח התגובה של μL 10 לכל טוב עם 5 μL של x PCR 2 מיקס (טבלה של חומרים), לערבב (1 μM פריימר לפנים ו פריימר הפוכה 1 μM), וμl 4 של ה-DNA שבב (או הפקד קלט).</li>
	<li>בקצרה ספין למטה הצלחת.</li>
	<li>הפעל את התגובות qPCR על מערכת ה-PCR בזמן אמת באמצעות הפרוטוקול המומלץ על ידי היצרן, ריאגנט לזיהוי (טבלה של חומרים). כאן השתמשנו בתנאים הבאים: 1) 1s ב 95 ° C עבור מחזור 1; 2) 1 s ב 95 ° C ואחריו 20 s ב 60 מעלות צלזיוס במשך 45 מחזורים; 3) 15 s ב 95 ° C ולאחריו 60 s-60 ° C ואחריו 15 s ב 95 ° C עבור מחזור 1. הערה: בדוק את עקומת דיסוציאציה: הנוכחות של פסגה אחת בחלקה דיסוציאציה תרמי מרמז אמפליקון בודד נוצר מתוך התגובה ה-PCR. אם שיא אחד או יותר הוא מדמיין, זה מעיד על פוטנציאל amplicons מרובות, שאינם ספציפיים; בכל מקרה, אנו ממליצים על העיצוב של פריימר חלופי זוגות.</li>
	<li>לקבוע את שלב ליניארי של מעריכי הגברה של התגובה PCR עבור כל פריימר מוגדר על-ידי חישוב העקומה רגיל באמצעות הסדרה של דנ א גנומי מדולל בשלב 4.1. לפי הערך Ct (מחזור מפתן).</li>
	<li>אם הערך Ct של הדנ א שבב ושליטה קלט בתוך הערך ליניארי טווח של Ct, לחשב את העשרת של הדנ א שבב יחסי הקלט, על-פי הגורם דילול של DNA שבב ושליטה קלט בשלב 4.1.</li>
</ol>5. הגברה של הדנ א שבב על רצף (הגנום כולו Readout) תפוקה גבוהה
הערה: שלב זה יכול להיות במיקור חוץ מתקן הליבה אקדמי או רצף מסחר החברה כאשר רצף יכולות אינם זמינים בארגון.
<ol><li>להכין ספריית דנ א של ה-DNA שחולץ עם הכנה הספריה המתאימה שבב קיט (ראה טבלה של חומרים) ההוראות של היצרן.</li>
	<li>רצף הספרייה במערכת רצף תפוקה גבוהה, באמצעות 50 bp יחיד-קצה כמו readout (ראה טבלה של חומרים). הערה: בהתאם להנחיות שבב-seq שהוצעה על ידי קידוד6, מינימום של 10 מיליון קריאות מומלצת בתרבית של הגנום.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים גולמיים
<ol><li>ביצוע בקרת איכות על רצף raw קריאות באמצעות FastQC8. הערה: מדדי איכות רצף נפוצים כוללים לכל רצף הבסיס איכותיים, לכל תוכן הבסיס רצף, לכל תוכן רצף GC, אורך הרצף, ורמות שכפול רצף. באופן כללי, ציון איכות קריאה של Q > 30 מעבר לכל תפקיד הבסיס הוא מרמז על תוצאות באיכות גבוהה רצף. חלוקת תוכן GC על פני כל קריאות צריך בערך דומה בהתפלגות רגילה, לשיא כיעד המינים גנומית GC תוכן שאחוז בפועל.</li>
	<li>הסר את כל רצף מתאם זיהום וקורא באיכות נמוכה דרך קרא זמירה השירות Trimmomatic9. הערה: הפרמטרים של ברירת המחדל מיושם לציין ההסרה של מתאמי התלויים פלטפורמה, הסרה של בסיסים באיכות נמוכה המובילים, נגררים, שימוש של חלון הזזה רחב 4-בסיס כדי לחתוך קורא מתי איכות ממוצעת לכל בסיס טיפות מתחת לסף שצוין מסוים.</li>
	<li>יישר קריאות מעובד העכבר MM10 הגנום של הפניה10 עם ה aligner Bowtie211 באמצעות פרמטרים ברירת המחדל.</li>
	<li>לסנן מיושר קריאות על ידי הסרת אלה עם איכות מיפוי Bowtie2 ציון (MAPQ) של פחות מ 10 באמצעות Samtools12.</li>
	<li>לקבוע מדדי איכות יישור שלאחר שונים כגון אחוז קריאות ממופה, סטראנד קרוס-קורלציה, מצטבר לקרוא סיקור, ודגימת לשכפל הפארמצבטית. הערה: חבילות שונות כולל SPP13, ChIPqc14ו- Deeptools15 זמינות לחישוב מדדי איכות אלה.</li>
	<li>לבצע ניתוח שיחות שיא עם בקרת קלט או מדגם KO המתאים באמצעות אלגוריתם (MACS2) של מקינטוש16 עם פרמטרים ברירת המחדל.</li>
	<li>הסר את כל הפסגות שנקרא חופפים עם אזורים מקארתיזם ידוע17 מ הביאור mm10 באמצעות Bedtools18. הערה: מקארתיזם אזורים הם אזורים בגנום הוכחו יש אות גבוה או ספירת קריאה עצמאית של תאים בטור או רצף טכניקה. אזורים אלה להציג אותות החפץ מלאכותי גבוה באזורים מסוימים בגנום זה ניתן לסנן מתוך רצף גנטי פונקציונלי ניסויים. משכפל כל צריך להיות מעובד באופן עצמאי דרך הצינור, ואז ניתן להשתמש עבור קצב גילוי irreproducibility (ד ר רודי). ד ר רודי הוא מועסק כדי למדוד את הפארמצבטית ממצאים בין ושכפול באמצעות השיטה כפי שתואר על ידי19,Li, בראון, הואנג, ביקל20. שיטת ד ר רודי באופן כמותי מעריך עקביות בין משכפל, ומומלצת על ידי קידוד ו- modENCODE כחלק הנחיות שבב-seq שלהם.</li>
	<li>השתמש פסגות סטטיסטית עבור ניתוחים במורד הזרם שונים כגון גנים אונטולוגיה21,22, העשרה או מוטיב ניתוח23.</li>
</ol>

<ol><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. , (2004).</li>
<li>Cardamone, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Retrograde+Signaling+in+Mammals+Is+Mediated+by+the+Transcriptional+Cofactor+GPS2+via+Direct+Mitochondria-to-Nucleus+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation.</a> Molecular Cell. 69, (2018).</li>
<li>Emmett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+3+prepares+brown+adipose+tissue+for+acute+thermogenic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+binds+MED1+and+controls+chromatin+architecture+to+determine+a+brown+fat+transcriptional+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program.</a> Genes & Development. , (2015).</li>
<li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes & Development. , (2017).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Differentiation+of+Stromal+Vascular+Cells+to+Beige%2FBrite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50191(2013).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).</li>
<li>Genome Browser Gateway. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 ">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 </a> (2018).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. , 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+alignment%2Fmap+%28SAM%29+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li>
<li>Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+artifact+removal+on+ChIP+quality+metrics+in+ChIP-seq+and+ChIP-exo+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data.</a> Frontiers in Genetics. 5, 75(2014).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+A+next+Generation+Web+Server+for+Deep-Sequencing+Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis.</a> Nucleic Acids Research. , (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, R137(2008).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reproducibility+of+high-throughput+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Statistics%22%5BJournal%5D)">Measuring reproducibility of high-throughput experiments.</a> Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).</li>
<li>Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://github.com/nboley/idr ">https://github.com/nboley/idr </a> (2018).</li>
<li>The Gene Ontology Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+Gene+Ontology+Knowledgebase+and+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources.</a> Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Ontology%3A+tool+for+the+unification+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).</li>
<li>Boeva, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genomic+Sequence+Motifs+for+Deciphering+Transcription+Factor+Binding+and+Transcriptional+Regulation+in+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells.</a> Frontiers in Genetics. 7, 24(2016).</li>
</ol>

הפרוטוקול המתואר כאן מייצג כלי רב ערך עבור ביצוע שבב של רקמות מאתר, הממוטב במיוחד רקמת שומן חום. אחד האתגרים גדול בביצוע שבב מרקמות מתאוששת מספר מספיק של תאים במהלך הכנת הדוגמא. הטיית את המחבט באמצעות בלנדר מהמגן רקמות בשילוב עם חרוזים פלדת אל-חלד במקום כבעלי זכוכית הקנוני משמעותית מפחית את מספר התאים איבדו בשל רקמת רצופה. יתר על כן, homogenizing את הרקמה ישירות במאגר היפוטוניק מסייע לשחרור שומנים כי אז ניתן בקלות מופרדים מן הגרעינים באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
Sonication נכונה ח...

בעוד שומן לבן (וואט) מתמחה לאחסון אנרגיה, רקמת שומן חום (בת) כלתה אנרגיה בצורת חום בשל יכולתה כדי להמיר אנרגיה תרמית ויה מיטוכונדריאלי uncoupling1פחמימות ושומנים. בגלל פונקציה מיוחדת זו, בתחנה בת נדרש עבור שמירה על טמפרטורת הגוף בתנאים פיזיולוגיים, בתגובה החשיפה הקרה. בזמן שינויים בביטוי גנים במהלך התמיינות בת ועל הלחץ תרמוגנית נחקרו בהרחבה ויוו, הפריה, המנגנונים המולקולריים שבבסיס שינויים אלה היו בעיקר גזור בקווים תא מונצחים ולא ראשי adipocytes מראש, למעט מספר מחקרים ויוו2,3,4,5.
התקנה של תוכניות ביטוי גנים ספציפיים באמצעות רגולציה תעתיק מושגת על ידי מתואמות לשינויים כרומטין מבנה דרך שעתוק שונים גורמים בשיתוף גורמים פעולות. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא גישה ביולוגיה מולקולרית יקר עבור חוקרים הגיוס של גורמים אלה ל- DNA, יצירת פרופיל השינויים הקשורים בנוף כרומטין. גורמי מפתח להצלחת הניסויים שבב כוללים אופטימיזציות של כרומטין ההטיה עקביות לאורך כל מדגמים שונים, זמינות של חומר המוצא נאותה ואיכות, בעיקר, של הנוגדנים ותנאים crosslinking. בעת ביצוע שבב של כל הרקמות, חשוב גם לשקול הטרוגניות של הדגימות ולמטב את פרוטוקול כדי לשפר את היעילות של גרעינים בידוד, עם האחרון להיות צעד רגישים במיוחד בעת עבודה עם רקמת שומן בשל התוכן שומנים בדם גבוהות. למעשה, טכניקות הבידוד המולקולרי של אדיפוז בכל מחסני הם מסובכים על ידי הנוכחות של רמות גבוהות של טריגליצרידים, פרוטוקולים חייב להיות ממוטב כדי להגדיל את כמות בידוד כרומטין. לבסוף, כאשר רצף תפוקה גבוהה מבוצע לאחר בידוד שבב-DNA, העומק רצף הוא קריטי לקביעת מספר פסגות שזוהו בביטחון.
כאן, אנו מתייחסים תקני עבודה והנחיות כלליות לניסויים שבב-seq המומלץ על ידי קידוד ו- modENCODE קונסורציומים6 מומלצות של, אנו מתמקדים תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול אופטימיזציה עבור שבב-seq (BAT). הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד יעיל של כרומטין של רקמת שומן לביצוע ברמת הגנום רצפי DNA מחייב גורמים עם פסגות מוגדרים היטב, כמו גם סימני היסטון עם אותות מתמשכת.

<table><tbody><tr><td>הומוגנייזר רקמות בלנדר כדורים&nbsp;</td><td>הבא Advence&nbsp;</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי נירוסטה 3.2 מ"מ קוטר</td><td>הבא Advence&nbsp;</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Sonicator</td><td>Diagenode</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו צינור TPX פלסטיק&nbsp;</td><td>דיאגנוד</td><td>C30010010-5</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז מלא</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836145001</tr><tr><td>חלבון A תמיסת אגרוז&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>101041 נוגדן GPS2</td><td>בבית ארנב</td><td></td><td>פוליקלונלי, נוגדן Ct (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td></tr><tr><td>נוגדן Pol2&nbsp;</td><td>נוגדן דיאגנוד</td><td>C15100055</td><td></td></tr><tr><td>h3K9me3</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>05-1242</td><td></td></tr><tr><td>מהיר Syber Green Master Mix</td><td>Aplied Biosytem</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7</td><td>Aplied Biosytem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq ChIP ערכת הכנת ספריית</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>IP-202-1012</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000&nbsp;</td><td>אילומינה&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כרומטין immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

תהליכים תאיים ביותר מוסדרים על ידי אפנון תעתיק של תוכניות גנים ספציפיים. אפנון כזה מושגת באמצעות הפעולות בשילוב של מגוון רחב של גורמי שעתוק (שר), cofactors בתיווכן של תעתיק או דיכוי באמצעות שינויים במבנה כרומטין. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא גישה ביולוגיה מולקולרית שימושי עבור מיפוי היסטון שינויים של פרופיל גורמי שעתוק/קשירה ל- DNA cofactors, ובכך לספק תמונת מצב של השינויים הדינמיים גרעיניים המתרחשים במהלך שונים תהליכים ביולוגיים.
ללמוד תקנה תעתיק של רקמת שומן, מונצחים דגימות נגזר במבחנה תרביות תאים של או קווים התא הראשי הם לעיתים קרובות העדיף בתוך השבב מבחני בגלל שפע מתחיל חומר מופחתת השתנות ביולוגי. עם זאת, מודלים אלה לייצג תמונה מוגבלת של המדינה בפועל כרומטין היצורים החיים. לפיכך, יש צורך קריטי עבור פרוטוקולים ממוטבת לבצע שבב על רקמת שומן דגימות שמקורם בבעלי חיים.
כאן נתאר פרוטוקול עבור שבב-seq יעיל של שינויים היסטון והן הלא-היסטון חלבונים בתוך רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. הפרוטוקול ממוטב חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים של עניין epigenetic סמני המחבט, אשר הוא רקמה מורפולוגית, מבחינה פיזיולוגית ברורים בין המחסנים שומן.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> איור 1: שבב אימות על-ידי qPCR. שבב-qPCR ניתוח של נציג GPS2 יעד גנים NDUFV1 (משמאל) ו TOMM20 (מימין), העטלף של עכברים WT ו- GPS2-עכו, מציג את השינויים ברמת מתילציה H3K9 ואיגוד GPS2 ו- Pol2. מהגרפים מייצג את המדגם של משכפל 3 עם * 0.05 &lt; p ו * * p &lt; 0.01 כמשהו מחושב עם מבחן t של סטודנט. נתון זה משתנה מ- Cardamone et al.2. <a href="https...

כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

ככל שהוא משמש לביצוע רצף ChIP יעיל של חלבוני אסתר ולא אסתר ברקמת השומנים החומה מבודד מהעכבר. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא כי הפרוטוקול כבר אופטימיזציה עבור immunoprecipitation יעיל של קומפלקס הקשורים כרומטין מרמת השומנים. לפני החתך, לרסס את העכבר המתת דם עם 70% אתנול.מניחים את העכבר עם הגב פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן לבצע חתך לאורך הצוואר. לאחר מכן, ממוקם BAT ישירות מתחת לעור בין הכתפיים בזהירות להסיר את השכבה הדקה של שומן לבן. לחצות כל כרית BAT ב 10 מיליליטר של PBS המכיל 1% פורמלדהיד במשך 15 דקות ב 150 סל"ד בטמפרטורת החדר.לאחר 15 דקות, מרווה את ההצלבה על ידי הוספת 2.5 גליצין טוחן ל BAT, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 125 מילימולר. מניחים אותו על שייקר במשך חמש דקות, מסתובב ב 150 סל"ד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להעביר את כרית BAT ל 500 microliters של חיץ תזה היפוטונית ולהוסיף שני חרוזים נירוסטה עבור כל כרית BAT.לאחר מכן, השתמש הומוגניזר רקמות מבוסס חרוזים לגרוס את הרקמה. התחל עם חמש דקות בה הספק מרבי. במידת הצורך, להאריך את הזמן עד הרקמה הומוגנית תאים בודדים מופרדים.מעבירים את הדגימה לצינור חדש, וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב 16, 000 גרם במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, להעביר את supernatant לתוך צינור חדש ולשמור את גלולת התא על הקרח. צנטריפוגה supernatant בארבע מעלות צלזיוס ב 16, 000 G במשך 1

chromatin-immunoprecipitation-of-murine-brown-adipose-tissue

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

השיטה המוצגת כאן משתמשת 18 F-fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה / ממוחשבת (PET-CT) והדמיה שומן-מים מופרדים בתהודה מגנטית (MRI), כל שנסרקו הבא 2 חשיפה לשעת thermoneutral (24 ° C ) ותנאים קרים (17 מעלות צלזיוס) כדי למפות רקמת שומן חומה (BAT) בבני אדם בוגרים.

בסיס מיון רקמה האנושי בראון שומן בדיקה מחולק באופן אוטומטי על ידי פוזיטרון פליטת טומוגרפיה / טומוגרפיה ממוחשבת ורשום תמונות תהודה מגנטית

אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סינון לבודד גרעינים באיכות גבוהה מן הצלב המקושרים שריר השלד העכבר שבו הסרנו את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. אנו מראים כי הכרומטין מוכן מן הגרעינים מתאים immunoprecipitation הכרומטין וסביר הכרומטין immunoprecipitation רצף מחקרים.

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים

פרדיפוציטים מבודדים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן החום הבין-סקפולרי מעכברים שזה עתה נולדו ומתמיינים לתאים שצוברים טיפות שומנים, מבטאים סמנים מולקולריים ומראים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של אדיפוציטים חומים בוגרים. תאים אלה מנותחים עוד יותר על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה.

התמיינות והדמיה של אדיפוציטים חומים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן הבין-סקפולרית מעכברים שזה עתה נולדו

כאן, אנו מספקים הליך מעשי לניתוח וביצוע ניתוחים היסטולוגיים וביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית.

דיסקציה, עיבוד היסטולוגי וניתוח ביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית מורין

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

למד פרוטוקול ChIP-seq מותאם לרקמת שומן חום מעכברים לחקירת שינויי היסטון וחלבונים לא-היסטוניים. השיטה מאפשרת מיפוי אינטראקציות כרומטין-חלבון בגנום ובהבנת תהליכי מטבוליזם.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

גלה סרטונים נוספים