הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים C1q וחומצה Hyaluronic בקידום הדבקה תא
15 ביוני 2019
המרכיב המשלים C1q היא מולקולה pro-דלקתיות מתבטאת במידה רבה בסביבה מיקרוסביבתית שיכולה לקיים אינטראקציה עם מטריצה החילוץ. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q הקשורים חומצה יאלורונית השפעות התא הדבקה.
הליך מקיף להערכת יחסי הגומלין בין החלבון המשלים C1q לחומצה היאלורונית בקידום הידבקות בתאים. לאחרונהגדרנו כי המרכיב המשלים C1q מולקולה של המערכת החיסונית המולדת באה לידי ביטוי מאוד במיקרו-וירוס הגידול והשליה ומצליחה לקיים אינטראקציה עם רכיב המטריצה החוץ-תאית. במקרה זה, חומצה היאלורונית.
אנו מציעים שיטה לחקר הפונקציות הביולוגיות של חלבונים ברחבי הסביבה האקרונומית. על מנת לחקור את היכולת של מולקולות אלה לעצב את תכונות חלוקת התאים של גורמי מטריצה חוץ תאית. על מנת ללמוד כיצד אינטראקציה זו יכולה להיות מושגת על ידי התאים הקיימים ברקמת הסביבה, הגדרנו שיטה קלה זו שבה תאים בינאריים הנגזרים מרקמות אנושיות הורשו לדבוק C1q מאוגד מטריצה חוץ תאית, במקרה זה חומצה היאלורונית.
עבור הליך ציפוי הצעד הראשון הוא מחייב של חומצה היאלורונית במשקל מולקולרי גבוה ל 96 מיקרופלסטיק מצופה רקמות היטב. עבור ציפוי, חומצה היאלורונית מדוללת 0.1 חופרת פחמן חיץ PH 9.6 בריכוז של 15 מיקרוגרם למיליליטר. ובעדינות צינורות הוא requited כדי להשיג פתרון הומוגני.
100 מיקרוליטרים של הפתרון משמשים לציפוי בארות. לאחר מכן הצלחת מועברת בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת ואקום שאף את הבאר המטופלת.
לשטוף פעם אחת עם dPBS. הוסף C1q או BSA בארות המתאימות. C1q זמין כיום מסחרית בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר והוא מדולל בריכוז של 25 מיקרוגרם למיליליטר.
ו-dPBS המכיל 0.5%BSA ו-0.7 מילימול סידן ומגנזיום ו- cations חלוקה. BSA LPS חינם משמש בריכוז של 0.5% ותאריך PBF. צלחת מועברת לאחר מכן בארבע מעלות צלזיוס לילה.
אינטראקציות תלויות מינון C1q עם חומצה היאלורונית משותקת נקבעת על ידי אנזים מקושר אימונו SA. תאים המתייגים באמצעות DiI מהיר. מעקב lipophilic מהיר DiI משמש כדי לתייג את התאים של עניין. תאים המתווסכלים ב- dPBS משמשים בריכוז של מיליון תאים למיליליטר.
ה-DiI המהיר מדולל בין 1 ל-100 ישירות לתוך ההשעיה של התא. ההשעיה התא מעורבב באופן ידני ומועבר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר חמש דקות דגירה, מערבבים את ההשעיה התא ולחזור על פעולה זו פעמיים נוספות.
כדי להסיר את עודף של DiI מהיר, להוסיף 10 מיליליטר של dPBS. יש לסובב בעדינות למעלה ולמטה ולהפוך לצנטריפוגה במהירות של 250 גרם למשך שבע דקות. תן מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום אנדופילי אנושי ללא סרום בנוכחות 0.1%BSA.
הידבקות בתאים על חומצה היאלורונית C1q מטריסות. ואקום שאף את ה- dPBS מה בארות מצופות. להפיץ 100 microliters של השעיית תא שכותרתו ל בארות מצופה.
200 מיקרוליטרים של תאים מסומנים מתפרקים בצינור תליון שישמש ליצרן עקומה סטנדרטי. דגירה את הצלחת במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. תוציא את הצלחת מהחמה.
שאפו בעדינות את התאים הלא מאוזנים. יש לשטוף פעם אחת עם dPBS המכיל 0.5%BSA ו-0.7 מילימול סידן ומגנזיום. Lys התאים חסידים על ידי הוספת 200 microliters של מאגר תמיסת.
במקביל להכין את העקומה הסטנדרטית על אחד עד שניים דילול טורי של התאים המסווים במאגר תזה. בצע את הקריאה של אות florescence ב אינסוף F 200 T-can מכשיר באמצעות 544 ננומטרים כמו אורך גל העירור ו 590 ננומטר כמו אורך גל פליטה. תוצאות מייצגות.
כפי שמוצג על ידי התוצאות הייצוגיות, ניכר כי הידבקות התא על חומצה היאלורונית מצא C1q כמו משופרת מאוד בהשוואה HA לבד או HA קשור BSA. אחוז התאים החסידיים בכל מטריצה מחושב על בסיס העקומה הסטנדרטית. מסקנות. בניסויים שלנו קודם כל הערכנו את היכולת של הרכיב המשלים C12 לקשור את המטריצה החוץ תאית במקרה זה חומצה היאלורונית באמצעות מתכת אריסאלית.
שנית ניתחנו את היכולת של תאים ראשוניים אנושיים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי לרדוף אחר חומצה היאלורונית קשורה. המודל שהצענו במחקר זה הוא שיטה קלה יותר ומהירה יותר וחלופה למודל תלת מימדי של פיגומי מטריצה חוץ-תאיים להערכה על תגובה תאית זו לשילוב של גירויים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה בוחן את האינטראקציה בין רכיב המשלים C1q וחומצה היאלורונית, תוך התמקדות באופן שבו אינטראקציה זו משפיעה על הדבקת התאים. C1q, מולקולה דלקתית, מתבטאת באופן משמעותי במיקרו-סביבות הגידול והשליה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- אימונולוגיה
רקע
- C1q הוא חלק מהמערכת החיסונית המולדת.
- הוא מתבטא באופן משמעותי במיקרו-סביבות רקמות מסוימות.
- C1q מתקשר עם מרכיבים של המטריצה החוץ-תאית.
- חומצה היאלורונית היא מרכיב מרכזי של המטריצה החוץ-תאית.
מטרת המחקר
- להעריך את תפקיד ה-C1q בהדבקת התאים.
- לחקור כיצד C1q הקשור לחומצה היאלורונית משפיע על התנהגות התאים.
- לפתח שיטה לחקר אינטראקציות חלבון בסביבה החוץ-תאית.
שיטות ששימשו
- נעשה שימוש בתאים בינאריים שהושגו מרקמות אנושיות.
- התאים הורשו להידבק ל-C1q הקשור לחומצה היאלורונית.
- הוקמה נוהל מקיף להערכה.
- פונקציות ביולוגיות של חלבונים הוערכו בהקשר של המטריצה החוץ-תאית.
תוצאות עיקריות
- האינטראקציה בין C1q וחומצה היאלורונית מקדמת את הדבקת התאים.
- תאים מגיבים לנוכחות C1q במטריצה החוץ-תאית.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי מאפייני חלוקת תאים המושרה על ידי גורמים חוץ-תאיים.
- התוצאות עשויות להיות בעלות השלכות להבנת תגובות חיסוניות בסביבות רקמות.
מסקנות
- C1q ממלא תפקיד משמעותי בהדבקת תאים באמצעות האינטראקציה שלו עם חומצה היאלורונית.
- השיטה שפותחה יכולה לשמש לחקר נוסף של אינטראקציות חלבון.
- הבנת האינטראקציות הללו עשויה לשפר את הידע על תפקודי המערכת החיסונית ברקמות שונות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
