Name: הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים C1q וחומצה Hyaluronic בקידום הדבקה תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: חקור את האינטראקציה בין חלבון המשלים C1q לחומצה היאלורונית בקידום הידבקות תאים. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקודים ביולוגיים של חלבונים בסביבת המטריצה החוץ-תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים איוון Donati על מתן HA, לאונרדו Amadio, גבריאלה Zito (המחלקה של גינקולוגיה של IRCCS "Burlo Garofolo", טריאסטה, איטליה) ו אנדריאה רומנו (יחידת המחקר הקליני של האנטומיה והיסטולוגיה הפתולוגיים, קאטניארה בית החולים, טריאסטה, איטליה ) עבור אוסף דגימת הרקמה. אנו מודים גם ניקולא מורוזיני לעזרה בהכנת וידאו ואלכס קופולה, הקול. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מהמכון לבריאות הילד, IRCCS "Burlo Garofolo", טריאסטה, איטליה (RC20/16) ו Fondazione Cassa די ריספרמיו טריאסטה ל ר. בולה.

דגימות רקמות מחולים נאספו לאחר הסכמה מושכלת בעקבות אישור השיקולים האתיים על ידי הוועד המוסדי של בית החולים האוניברסיטאי של טריאסטה, איטליה.
1. בידוד תא גידול ותרבות (יום 1)
<ol><li>בודד תאים מזותליומה האנושית מ MPM דגימות מוצקות. דק את הרקמה עם חותך להשיג שברים של כ 2-3 מ"מ2 בגודל ו-דגירה של 5 מ ל פתרון העיכול מורכב הנקס ' מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) שיושלם עם 0.5 mm Ca2 +/Mg2 +, 0.5% טריפסין ו50 μg/mL DNase I, לילה ב -4 ° c.</li>
	<li>בידוד תא גידול ותרבות (יום 2)<ol>
<li>לאחר הדגירה של הלילה, מניחים את הרקמה המתעכלת במשך 30 דקות בחממה 37 ° c עם טלטול עדין.</li>
		<li>החלף את פתרון העיכול על צנטריפוגה (250 x g) עם 3 מ"ג/mL קולגן סוג 1 מומס 5 מ ל של בינונית 199 עם HBSS ו מודטה נוספת עבור 30 דקות ב 37 ° צ' עם רעד עדין.</li>
		<li>לחסום את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 10% חום העובר מופעל סרום פרה (FBS). השהה מחדש את התאים בזהירות עם 5 מ ל pipet כדי להבטיח כי רוב התאים שוחררו מן הרקמה. אז, לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסנן נקבובית 100 יקרומטר.</li>
		<li>זרע את התאים בבקבוקון 12.5 ס"מ2 בקבוקון ותרבות אותם ב 37 ° צ' עם התאים האנושיים סרום-בינונית חינם (hesf), עם 10% fbs ו שיושלם עם egf (10 Ng/ml), fbs בסיסי (20 Ng/ml), ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. הערה: החלף במדיום טרי כל 2-3 ימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. כיסוי HA (יום 1)
<ol><li>השהה מחדש משקל מולקולרי גבוה HA (1.5 kDa) במים מזוקקים כפולים בריכוז של 1 מ"ג/mL6.</li>
	<li>דלל פתרון מניות HA כדי 50 μg/mL ב קרבונט/ביקרבונט מאגר (0.1 M, pH 9.6) עם pipetting עדין.</li>
	<li>מעיל 96-ובכן צלחת עם 100 μL של לדלל פתרון מניות HA ללילה ב 4 ° c. הערה: חומצה Hyaluronic היתה מתנה מהסוג של פרופ ' איוואן דונטי, המחלקה למדעי החיים, אוניברסיטת טריאסטה7.</li>
</ol>3. C1q (יום 2)
<ol><li>לאחר הדגירה לילה, ואקום משאוב את הבארות התייחסו ולשטוף את 96-הצלחת לוחית עם 100 μL של ה-PBS של בדולקו (dPBS) לכל טוב.</li>
	<li>אפשר C1q (25 μg/mL או ריכוזים שונים עבור ניסויים התגובה מינון) או BSA (כפקד שלילי) כדי לאגד את הפלסטיק מאוגד-HA על-ידי דגירה חלבונים אלה בריכוז של 25 μg/mL ב 100 μL של dPBS + 0.5% BSA ו 0.7 mM Ca2 +/Mg2 + . לאחר מכן הדגירה הלילה ב 4 ° c.</li>
	<li>ואקום לשאוב את הבארות ולשטוף את הצלחת 96-טוב עם 100 μL/טוב של dPBS.</li>
</ol>4. תא תיוג עם מהירות DiI
<ol><li>השהה מחדש 1 x 105 תאים סרטניים ב 500 Μl של dpbs המכיל 10 μg/mL של צבע פלורסנט מהיר dii. מודטה עבור 15 דקות ב 37 ° c ב 5% v/v CO2 חממה עבור התוויות, ערבוב באופן ידני לאחר 5 דקות במרווחי זמן.<ol>
<li>כדי להסיר עודף מהיר DiI, להוסיף 10 מ ל של dPBS, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה, צנטריפוגה ב 250 x g עבור 7 דקות. השהה את הגלולה בתא 1 מ ל של סרום האנדותל אנושי בינונית ללא תשלום המכיל 0.1% bsa (hesf + 0.1% bsa).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. תא הדבקה על מטריצות HA/C1q (יום 1)
<ol><li>ואקום לשאוב את הבארות מצופה מטריצות שונות (בארות היו מצופות בשלב 3.2).</li>
	<li>הפץ 100 μL של השעיית התא המסומנת לבארות מצופה, מודקת את הצלחת עבור 35 דקות ב 37 ° צ' ב 5% v/v שיתוף חממה2 .</li>
	<li>הסר את התאים הלא מחסיד על-ידי הסרת supernatant. לשטוף פעם אחת עם dPBS המכיל 0.5% BSA, 0.7 mM Ca2 + ו 0.7 mM Mg2 +.
</li>
	<li>Lyse תאים חסיד על-ידי הוספת 200 μL/טוב של 10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 + 0.1% v/v SDS ולקרוא מיד את הצלחת 96-באר עם קורא הזריחה (544 nm, פליטה 590 nm) באמצעות עקומת כיול שנוצר באמצעות העלאת מספר גדל והולך של מתויג תאים.</li>
</ol>

<ol><li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation%3A+Chemistry%2C+processing+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li>
<li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Bulla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+acts+in+the+tumour+microenvironment+as+a+cancer-promoting+factor+independently+of+complement+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation.</a> Nature Communications. 7, 10346(2016).</li>
<li>Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+stromal+gene+signatures+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prognostic stromal gene signatures in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 17, 23(2015).</li>
<li>Collins, M. N., Birkinshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+solutions%3A+A+processing+method+for+efficient+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification.</a> Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).</li>
<li>Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+primary+structure%2C+complex+turnover+regulation+and+multiple+roles+of+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan.</a> Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+role+of+C1q+in+cell+migration+and+tissue+remodeling%3A+contribution+to+trophoblast+invasion+and+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development.</a> Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+Protein+C1q+Binds+to+Hyaluronic+Acid+in+the+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Microenvironment+and+Promotes+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).</li>
<li>Bossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+as+a+unique+player+in+angiogenesis+with+therapeutic+implication+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).</li>
<li>Hosszu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).</li>
<li>Laurent, T. C., Fraser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan.</a> Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).</li>
<li>Gaboriaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+globular+head+of+complement+protein+C1q+provides+a+basis+for+its+versatile+recognition+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).</li>
<li>Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

אנו מתארים שיטה קלה לחקור כיצד המשלים רכיב C1q, אינטראקציה עם חומצה יאלורונית, הוא מסוגל לווסת את ההתנהגות של תאים ראשוניים מבודדים מרקמות הגידול האנושי. שניהם HA ו C1q נמצאים בשפע בסביבה מיקרוברקמות הן בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים, המשתתפים בתהליכים ביולוגיים מספר תאים. למשל, C1q הוכח להיות נוכח המיקרו הסביבה של השליה שבו הוא מעדיף הפלישה trophoillהפיצוץ של הדציבלים האימהי במהלך placentation8. C1q מופקד גם בעור הפצע-ריפוי שבו הוא מטפח את התהליך אנגיוגנטי הנדרש התחדשות רקמות ותיקון<sup class="xre...

מיקרוסביבה הגידול (TME) משפיע על התפתחות הסרטן והתקדמות מאז הוא יכול לספק נישה מתירני עבור הישרדות התא, צמיחה ופלישה. הזיהוי של נגני מפתח חדשים ב-TME עשוי להיות שימושי לגילוי כלים מולקולריים חדשים עבור טיפול היעד. TME כולל רשת מורכבת ודינמית של תאים שאינם ממאירים, כגון תאים אנדותל, פיברותקיעות ותאים של המערכת החיסונית, מוטבע בתוך מטריקס המקיפים (ECM) רכיבים כולל collagens, למינציה, fibronectins, . בסדר. הן הגידול והן תאים שאינם סרטניים לסנתז ולהפריש רכיבי ECM יחד עם ציטוקינים, נוגדנים, גורמי גדילה ושיפוץ מטריצה דלקתיות אנזימים הכולל לשנות את המאפיינים הפיזיים, כימיים, איתות של TME. בין המרכיבים האלה, חומצה יאלורונית (HA) התפתחה להפעיל תפקיד מכריע בביולוגיה הגידול. למרות ההרכב הכימי הפשוט שלה, HA, יחד עם המולקולות שלה הכריכה (היאלודונים), יכול לווסת אנגיוגנזה, תגובתיות המערכת החיסונית ו ECM שיפוץ בגודל וריכוז תלוי באופן1.
מערכת המשלים (C) היא גם חלק של TME המקומי, אשר קיבל לאחרונה את תשומת הלב הגוברת. מערכת C מקיפה סט של חלבונים מסיסים מאוגד קרום מעורב בשורה הראשונה של הגנה מפני תאים לא-עצמאיים, אלמנטים מארחים לא רצויים ופתוגנים. מבחינה פונקציונלית, C מקשרת את הזרועות שני-אפקטור של מערכות מולדת ואדפטיבית כדי לקדם או להרוג את התא הישיר או הרכבה של תגובה דלקתית2. C הפעלה יכול לדכא את צמיחת הגידול, על ידי השמדת תאים סרטניים או עיכוב outgrowth שלהם, אבל זה הפך יותר ויותר ברור כי זה יכול להחזיק הגידול קידום פעילות על ידי קיום דלקת כרונית, קידום הקמתה של מדכאים, הגורם לאנגיוגנזה, והפעלת מסלולים של אותות סרטניים הקשורים לסרטן3. בהקשר זה, C1q, את המולקולה הזיהוי הראשון של המסלול הקלאסי של מערכת C התפתחה להפעיל פונקציות חשובות מיקרוסביבה הגידול באופן עצמאי של הפעלת C4. C1q הוכח להיות מבוטא באופן מקומי על ידי מגוון של גידולים ממאירים האדם, שם הוא יכול לטובת הדבקה תא סרטן, הגירה והתפשטות בנוסף אנגיוגנזה גרורות5. מעניין C1q אינטראקציה עם המרכיבים העיקריים של ECM כגון HA.
פיתחנו טכניקה כדי לבודד את תאי הסרטן העיקריים ממסת הגידול. יתר על כן, יצרנו את המטריצה, אשר יכול לעורר מיקרוסביבה הגידול, במיוחד את האינטראקציה בין C1q ומשקל מולקולרי גבוה חומצה יאלורונית. C1q מאוגד HA היה מסוגל לגרום הדבקה של תאים סרטניים.

<table><tbody><tr><td>100&דק; ומיקרו; m מסנן נקבוביות</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמפוטריצין B (אזור פטריות)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>מדעים אימונולוגיים</td><td>בסיסיים של FGF</td><td>GRF-15595</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג I</td><td>Worthington Biochemical Corporation, DBA</td><td>MX1D12644</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>רוש</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>מדעים אימונולוגיים</td><td>GRF-10544</td><td></td></tr><tr><td>FAST DiI</td><td>בדיקות מולקולריות, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>D7756</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco,&nbsp; Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>Roche</td><td>11051407001</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק לתרבית תאים</td><td>Corning</td><td>430639</td> תמיסת Gentamicin <td>סטרילית ומאווררת</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (HBBS)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>H6648</td><td>בתוספת EDTA, גלוקוז, פניצילין-סטרפטמיצין, גנטמיצין ואזור פטריות</td></tr><tr><td>חומצה היאלורונית במשקל מולקולרי גבוה</td><td>מתנה אדיבה מאת פרופ' איוון דונאטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום ללא סרום אנדותל אנושי&nbsp;</td><td>גיבקו,&nbsp; תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11111-044</td><td>בתוספת EGF (5&thinsp; ng/mL), FGF בסיסי (10&ampthinsp; ng/mL), ו-&nbsp; 1% פניצילין&ndash; סטרפטומיצין (סיגמא-אולדריץ')</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>קרלו ארבה</td><td>13446-18-9</td><td></td></tr><tr><td>בינוני 199 עם האנק' מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה דולג זמן&nbsp;</td><td>ניקון&nbsp;</td><td>מערכת הדמיה: BioStation, IM-Q</td><td></td></tr>, <tr><td>Titertek, Multiskan, ELISA Reader</td><td>Flow Labs,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T4674</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים c1q וחומצה hyaluronic בקידום הדבקה תא

Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

זה הוכח יותר ויותר כי מיקרוסביבה הגידול משחק תפקיד פעיל neoplasia צמיחה גרורות. באמצעות מסלולים שונים, תאים סרטניים יכול ביעילות לגייס סטרומה, תאים חיסוניים ואנדותל על ידי הפרשת גורמים מגירוי, נוגדנים ו ציטוקינים. בתורו, תאים אלה יכולים לשנות את מאפייני האיתות של הסביבה מיקרוידי שחרור הצמיחה-קידום אותות, מטבוליטים מטריקס רכיבים מטריצות כדי לקיים התפשטות גבוהה ויכולת גרורתית. בהקשר זה, אנו מזהים את המרכיב המשלים C1q, ביטוי מאוד באופן מקומי על ידי מגוון של גידולים ממאירים אנושיים, על האינטראקציה עם חומצה יאלורונית מטריצה המומנת, משפיע מאוד על ההתנהגות של תאים ראשוניים מבודדים מהגידול האנושי דגימות. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q כרוך חומצה יאלורונית (HA) משפיע על הדבקה תא הגידול, בבסיס העובדה המאפיינים הביולוגיים של רכיבי מפתח של מטריצה החילוץ (במקרה זה HA) יכול להיות מעוצב על ידי אותות אקטיביים לקראת הגידול תקדמות.

HA שלילית גבוה-מולקולרית משקל רב-שלילי, אשר מורכב של חוזר (β, 1-4)-D-חומצה גלוקורונית-(β, 1-3)-N-מרחריל-D-גלוקוסמיטין יחידות דיאכראמיד (איור 1B)7. המופע של הכריכה של HA על הצלחת 96-באר, כמו גם את היעילות של השתק שלה נבדקו לנצל את היתרונות של biotinylated HA (ביו-HA). ריכוזים שונים של ביו-HA, החל 10 μg/mL ל 1 מ"ג/mL, היו מחדש מושעה 100 mM קרבונט/ביקרבונט-מאגר pH 9.6 ו מודבטים לילה ב 4 ° c.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

המרכיב המשלים C1q היא מולקולה pro-דלקתיות מתבטאת במידה רבה בסביבה מיקרוסביבתית שיכולה לקיים אינטראקציה עם מטריצה החילוץ. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q הקשורים חומצה יאלורונית השפעות התא הדבקה.

הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים C1q וחומצה Hyaluronic בקידום הדבקה תא

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

הליך מקיף להערכת יחסי הגומלין בין החלבון המשלים C1q לחומצה היאלורונית בקידום הידבקות בתאים. לאחרונהגדרנו כי המרכיב המשלים C1q מולקולה של המערכת החיסונית המולדת באה לידי ביטוי מאוד במיקרו-וירוס הגידול והשליה ומצליחה לקיים אינטראקציה עם רכיב המטריצה החוץ-תאית. במקרה זה, חומצה היאלורונית.אנו מציעים שיטה לחקר הפונקציות הביולוגיות של חלבונים ברחבי הסביבה האקרונומית. על מנת לחקור את היכולת של מולקולות אלה לעצב את תכונות חלוקת התאים של גורמי מטריצה חוץ תאית. על מנת ללמוד כיצד אינטראקציה זו יכולה להיות מושגת על ידי התאים הקיימים ברקמת הסביבה, הגדרנו שיטה קלה זו שבה תאים בינאריים הנגזרים מרקמות אנושיות הורשו לדבוק C1q מאוגד מטריצה חוץ תאית, במקרה זה חומצה היאלורונית.עבור הליך ציפוי הצעד הראשון הוא מחייב של חומצה היאלורונית במשקל מולקולרי גבוה ל 96 מיקרופלסטיק מצופה רקמות היטב. עבור ציפוי, חומצה היאלורונית מדוללת 0.1 חופרת פחמן חיץ PH 9.6 בריכוז של 15 מיקרוגרם למיליליטר. ובעדינות צינורות הוא requited כדי להשיג פתרון הומוגני.100 מיקרוליטרים של הפתרון משמשים לציפוי בארות. לאחר מכן הצלחת מועברת בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת ואקום שאף את הבאר המטופלת.לשטוף פעם אחת עם dPBS. הוסף C1q או BSA בארות המתאימות. C1q זמין כיום מסחרית בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר והוא מדולל בריכוז של 25 מיקרוגרם למיליליטר.ו-dPBS המכיל 0.5%BSA ו-0.7 מילימול סידן ומגנזיום ו- cations חלוקה. BSA LPS חינם משמש בריכוז של 0.5% ותאריך PBF. צלחת מועברת לאחר מכן בארבע מעלות צלזיוס לילה.אינטראקציות תלויות מינון C1q עם חומצה היאלורונית משותקת נקבעת על ידי אנזים מקושר אימונו SA. תאים המתייגים באמצעות DiI מהיר. מעקב lipophilic מהיר DiI משמש כדי לתייג את התאים של עניין. תאים המתווסכלים ב- dPBS משמשים בריכוז של מיליון תאים למיליליטר.ה-DiI המהיר מדולל בין 1 ל-100 ישירות לתוך ההשעיה של התא. ההשעיה התא מעורבב באופן ידני ומועבר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר חמש דקות דגירה, מערבבים את ההשעיה התא ולחזור על פעולה זו פעמיים נוספות.כדי להסיר את עודף של DiI מהיר, להוסיף 10 מיליליטר של dPBS. יש לסובב בעדינות למעלה ולמטה ולהפוך לצנטריפוגה במהירות של 250 גרם למשך שבע דקות. תן מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום אנדופילי אנושי ללא סרום בנוכחות 0.1%BSA.הידבקות בתאים על חומצה היאלורונית C1q מטריסות. ואקום שאף את ה- dPBS מה בארות מצופות. להפיץ 100 microliters של השעיית תא שכותרתו ל בארות מצופה.200 מיקרוליטרים של תאים מסומנים מתפרקים בצינור תליון שישמש ליצרן עקומה סטנדרטי. דגירה את הצלחת במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. תוציא את הצלחת מהחמה.שאפו בעדינות את התאים הלא מאוזנים. יש לשטוף פעם אחת עם dPBS המכיל 0.5%BSA ו-0.7 מילימול סידן ומגנזיום. Lys התאים חסידים על ידי הוספת 200 microliters של מאגר תמיסת.במקביל להכין את העקומה הסטנדרטית על אחד עד שניים דילול טורי של התאים המסווים במאגר תזה. בצע את הקריאה של אות florescence ב אינסוף F 200 T-can מכשיר באמצעות 544 ננומטרים כמו אורך גל העירור ו 590 ננומטר כמו אורך גל פליטה. תוצאות מייצגות.כפי שמוצג על ידי התוצאות הייצוגיות, ניכר כי הידבקות התא על חומצה היאלורונית מצא C1q כמו משופרת מאוד בהשוואה HA לבד או HA קשור BSA. אחוז התאים החסידיים בכל מטריצה מחושב על בסיס העקומה הסטנדרטית. מסקנות. בניסויים שלנו קודם כל הערכנו את היכולת של הרכיב המשלים C12 לקשור את המטריצה החוץ תאית במקרה זה חומצה היאלורונית באמצעות מתכת אריסאלית.שנית ניתחנו את היכולת של תאים ראשוניים אנושיים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי לרדוף אחר חומצה היאלורונית קשורה. המודל שהצענו במחקר זה הוא שיטה קלה יותר ומהירה יותר וחלופה למודל תלת מימדי של פיגומי מטריצה חוץ-תאיים להערכה על תגובה תאית זו לשילוב של גירויים.

evaluation-interplay-between-complement-protein-c1q-hyaluronic-acid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה חדשנית המאפשרת ברזולוציה גבוהה ניתוח של אינטראקציות תאים סרטניים עם חומצה היאלורונית אקסוגניים (HA) מתואר. משטחים בדוגמת מיוצרים על ידי שילוב של כימיה carbodiimide והדפסה microcontact.

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

assay הידבקות סטטית הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש מודל האינטראקציות בין לימפוציטים מסוג T וסוגי תאים אחרים. אינטראקציות מופקות על ידי הזרקת תאי T שכותרתו לתוך הבארות מצופים במולקולות הדבקות, ואילו קורא צלחת משמש לכמת את מספר התאים חסיד הבאים שוטף סדרתי.

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לאפיון תכונות ההדבקה הפנימיות של מולקולות הידבקות תאים משוערות.  האקטודומיין המופרש המתויג באפיטופ של מולקולת הידבקות תאים נלכד ממדיום התרבות על חרוזים קטנים ואחידים מתפקדים.  לאחר מכן ניתן להשתמש בחרוזים אלה באופן מיידי במבחני צבירת חרוזים פשוטים.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

כאן אנו מתארים שיטה חדשנית לקביעת פולימורפיזם אורך קולטן 1 (CR1) אורך לשימוש עבור מספר יישומים, במיוחד הערכה של רגישות למחלות כגון אלצהיימר (AD). שיטה זו יכולה להיות שימושית כדי להבין טוב יותר את התפקיד של isoforms CR1 ב פתוגנזה של AD.

ברזולוציה גבוהה ההיתוך PCR עבור המשלים קולטן 1 אורך פולימורפיזם גנוטיפינג: כלי חדשני למחלת אלצהיימר הערכת רגישות גנים

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

פרוטוקול זה מתאר ניסוי נדידה חוץ גופית המתאים לניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת in vivo של תאי פסגה עצבית לתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן.

במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

כדי ללמוד ביעילות את הפונקציה של אוכלוסיות תאים חיסוניים טיהור שלהם נדרש לעתים קרובות. דלדול משלים היא טכניקה מהירה וזולה עבור בידוד של אוכלוסיות תאים חיסוניים עם טוהר גבוהה.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

חקור את האינטראקציה בין חלבון המשלים C1q לחומצה היאלורונית בקידום הידבקות תאים. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקודים ביולוגיים של חלבונים בסביבת המטריצה החוץ-תאית.

הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים C1q וחומצה Hyaluronic בקידום הדבקה תא

גלה סרטונים נוספים