Name: זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למד פרוטוקול לבידוד RNA מקודד ולא מקודד מדגימות דם מלא עם הפחתת גלובין. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות מארח-פתוגן וניתוח ביטוי RNA בגנומיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו בעיקר נתמך על ידי על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2013-67015-21236, וכן על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2015-67015-23216. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי פעילות חקלאית מחקר שירות מחקר השתתפות בתוכנית מנוהל על ידי המכון אוק רידג על מדע, חינוך (ORISE) דרך הסוכנויות הסכם בין (משרד האנרגיה של ארה DOE), מחלקת החקלאות של ארצות הברית. ORISE מנוהלת על ידי אלון רכס Associated אוניברסיטאות תחת חוזה דו. לא. דה-AC05-06OR2310.
ברצוננו להודות ד ר קיי Faaberg HP-PRRSV זיהומיות שיבוטים, ד ר סוזן Brockmeier עזרה עם חיות מעורב בניסוי, סו Ohlendorf עבור שירותי מזכירות בהכנה של כתב היד.

<ol><li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq%3A+challenges+and+strategies+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li>
<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf">ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf</a> (2015).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf">http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf</a> (2007).</li>
<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
<li>New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.
איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה היא אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית. משרד החקלאות הוא הזדמנות שווה ספק המעסיק.

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול כי עשה את זה אופטימיזציה כלל הצעדים דלדול נוסף גלובין, שהפכו אותו ניתן לקבל איכות קריאות מדגימות דם מלא. אחת המגבלות הגדולות על השימוש דם במחקרים רצף המספרים גבוהה הקריאות במדגם זה יהיה למפות גלובין מולקולות להפחית את הקורא את יכולת למפות את מולקולות אחרות הריבית18. לכן, תוך אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור סוג המדגם שלנו, היינו צריכים לשלב צעד דלדול גלובין כדי להבטיח ש-mrna אפשרי הגבוהה ביותר, ללא קידוד RNA ללכוד דרך רצף. כל הדגימות היו גלובין דלה לחשבון עבור רמות גבוהות...

רצף הדור הבא (הגדרות) התפתחה כלי רב עוצמה עבור החקירה של השינויים המתרחשים ברמת גנומית של אורגניזם ביולוגי. הכנת הדוגמא לשיטות המיתרים יכולים להיות מגוונים בהתאם האורגניזם, סוג הרקמה, והם וחשוב השאלות החוקרים להוטים כתובת. מחקרים רבים פנו המיתרים כאמצעי של הלומדים את ההבדלים בביטוי הגנים בין מדינות כגון אנשים בריאים וחולים1,2,3,4. קח רצף במקום על בסיס כל הגנום ומאפשר חוקר ללכוד את רוב, אם לא כל, של המידע גנומית סמן גנטי מסוים בכל פעם הצבע.
הסימנים הנפוצים ביותר הביטוי נצפו הן RNAs שליח (mRNAs). ההליכים הנפוצה ביותר עבור ספריות מכין עבור ה-RNA-seq ממוטבים עבור ההתאוששות של מולקולות ה-mRNA באמצעות סדרה של purifications, fragmentations ו-5,ligations6. עם זאת, ההחלטה על איך פרוטוקול נמצא שיבוצע מסתמכת במידה רבה על סוג הדגימה ואת השאלות להיות דיגמנה על הדגימה האמורה. ברוב המקרים מופק RNA הכולל; ובכל זאת, לא כל מולקולות RNA עניין, במקרים כמו ה-mRNA ביטוי מחקרים מופרזת שופע מינים RNA, כמו ribosomal RNAs (rRNA) צורך להסיר כדי להגדיל את מספר תעתיקים לזיהוי המשויך את mRNAs. שיטת ביותר פופולריים והשימוש בהם נפוץ עבור הסרת מולקולות rRNA שופע היא הפחתת polyadenylated RNA תעתיקים המכונה תיקים עשויים דלדול7. גישה זו עובד היטב עבור הניתוח של mRNA ביטוי זה אינו משפיע על התרשימים mRNA. עם זאת, מחקרים הם מעוניינים RNAs ללא קידוד או ויראלי, תיקים עשויים דלדול מסיר גם מולקולות אלה.
מחקרים רבים בחרו להתמקד ההכנה ספריית רצף הרנ א לבחון אחד מהביטויים mRNA (קידוד) או שיעור מסוים ללא קידוד RNA קטנות או גדולות. למרות שיש אחרים הליכים8 כמו שלנו המאפשרים הכנת הדוגמא כפול, מחקרים רבים להכין ספריות מדגימות נפרדת ללימודים נפרדים כאשר היא זמינה. עבור מחקר כמו שלנו, זה בדרך כלל דורש מספר דגימות דם הגדלת זמן, מתכלים, מתח בעלי חיים. מטרת המחקר שלנו היה להיות מסוגל להשתמש דם מבעלי כדי לזהות ולכמת את מחלקות שונות של שני mRNA והביע ללא קידוד RNA בין הרבייה חזירי פתוגני ובריאה תסמונת נשימתית וירוס (HP-PRRSV) תגר חזירים9,,10 , למרות שיש רק דגימת דם כל יחיד (2.5 מ ל) של חזיר אחד. כדי לעשות זאת, היינו צריכים למטב את החילוץ אופייני והפרוטוקולים ספריית יצירה כדי ליצור את הנתונים המתאימים כדי לאפשר ניתוח של mRNA והן ללא קידוד RNA (ncRNA) ביטוי11 מתוך מדגם בודד.
הנחיה זו צורך פרוטוקול המותר עבור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ניתוח כי ערכות סטנדרטיים זמינים ושיטות ליצירת RNA-חילוץ וספריה היו מיועדות בעיקר mRNA ולהשתמש עם דלדול poly-A בשלב12. שלב זה הייתה בלתי אפשרי לשחזר ללא קידוד RNA או ויראלי תעתיקים מדגם. לכן, שיטת אופטימיזציה היה צורך זה מותר לחילוץ RNA הכולל ללא מדגם תיקים עשויים דלדול. השיטה המובאת כתב יד זה מוטבה כדי לאפשר לשימוש של דם מלא כסוג לדוגמה, להקים ספריות רצפי mRNA והן ncRNAs בגדלים קטנים וגדולים. השיטה מוטבה כדי לאפשר הניתוח של כל לזיהוי אי קידוד RNAs, כמו גם לשמר RNAs נגיפי עבור חקירה מאוחר יותר13. בסך הכל, פרוטוקול הכנה שלנו ספריית ממוטבת מאפשר החקירה של מספר מולקולות RNA מתוך דגימת דם כל יחיד.
המטרה הכוללת מאחורי השימוש בשיטה זו הייתה לפתח תהליך איפשרה לאוסף ללא קידוד RNA וגם mRNA דוגמא אחת של דם מלא. זה מאפשר לנו יש mRNA, ncRNA ו- RNA נגיפי עבור כל בעל חיים במחקר שלנו הטרייה דוגמה יחידה9. זה, בסופו של דבר, מאפשר גילוי מדעי יותר ללא עלויות נוספות חיות ונותן תמונה שלמה יותר של הביטוי של כל דגימה בודדת. השיטה המתוארת מאפשרת הבחינה של הרגולטורים של ביטוי גנים, כמו גם לאפשר את השלמת correlative מחקרים שהשוו את שניהם mRNA וביטוי ללא קידוד RNA באמצעות דגימת דם כל יחיד. המחקר שלנו להשתמש בפרוטוקול זה לבחון השינויים בביטוי הגנים, הרגולטורים epigenetic ניתן ב נגוע לשווק 9 - בן שבועיים חזירים מסחרי זכרים.

<table><tbody><tr><td>צינורות PAXgene</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>מים ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA בידוד ערכת</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute ניקוי ערכת QIAGEN</td><td></td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינורות דקים דופן</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל RNase / DNase - צינורות חינם</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 באר Thermocycler</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>אוליגו הפחתת גלובין (&אלפא; 1)</td> <td>כל ספק</td><td></td><td>רצף GAT CTC CGA GGC TCC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>הפחתת גלובין אוליגו (&אלפא; 2)</td> <td>כל ספק</td><td></td><td>רצף TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC</td></tr><tr><td>AA הפחתת גלובין אוליגו (&בטא; 1)</td> <td>כל ספק</td><td></td><td>רצף AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td></tr><tr><td>הפחתת גלובין אוליגו (&בטא; 2)</td> <td>כל ספק</td><td></td><td>רצף GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CTC CT</td></tr><tr><td>10X Oligo Hybridization</td> Buffer-Tris-HCl<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pH 7.6</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1757-100-KCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNase H Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Tris-HCl, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-ביולוגיה מולקולרית דרגה מים</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>מעכב Rnase</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 2100 מכשיר אלקטרופורזה ביו-אנלייזר</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>Technologies 5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent רגישות גבוהה DNA&nbsp; ערכת</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הכנה לספריית RNA כוללת של TruSeq עם Ribo-Zero&nbsp;</td>ערכת <td>mRNA של Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>; סט אדם/עכבר/חולדה A&nbsp; (48 דגימות, 12 אינדקסים)</td></tr><tr><td>TruSeq תקוע כולל RNA מדריך הכנת מדגם</td><td>Illumina</td><td></td><td>זמין באינטרנט</td></tr><tr><td>RNAClean XP חרוזים</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP חרוזים</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp אופטי 8 צינורות רצועת</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>0.2 מ"ל צינורות דקים דופן</td></tr><tr><td>MicroAmp אופטי 8 צינורות רצועת</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase - מאגרי ריאגנטים בחינם</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96 לוחות באר</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>אלה שימשו במקום צלחות .3 מ"ל לפי הצורך</td></tr><tr><td>סרט דבק אופטי MicroAmp</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex סט הכנה לספריית RNA קטנה עבור Illumina&reg; (סט 1)&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E73005</td><td>ערכת RNA קטנה</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex סט הכנה לספריית RNA קטנה עבור Illumina&reg; (סט 2)&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E75805</td><td>ערכת RNA קטנה</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR ערכת טיהור</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S צלחת מגנט סופר</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של קידוד ללא קידוד rna מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

כניסתו של יותר ויותר חזקים וחדשניים הבא הדור רצף טכניקות פתחה דרכים חדשות היכולת לבחון בביטוי הגן הבסיסי הקשור תהליכים ביולוגיים של עניין. חידושים אלה מאפשרים לא רק חוקרים לבחון ביטוי מ רצפי mRNA זה הקוד של הגנים את תפקוד התאים השפעה, אך גם מולקולות RNA (ncRNA) ללא קידוד שנותרו לא מתורגם, אבל עדיין יש פונקציות רגולטוריות. למרות חוקרים יש את היכולת להתבונן ביטוי mRNA והן ncRNA, זה כבר מקובל מחקר להתמקד אחת או אחרת. עם זאת, כאשר מחקרים מעוניינים בביטוי mRNA והן ncRNA, פעמים רבות הם משתמשים דגימות נפרד לבחון קידוד או ללא קידוד RNAs לאור ההבדל בהכנות ספריה. זה יכול להוביל הצורך לקבלת דוגמאות נוספות, אשר יכול להגביר הזמן, מתכלים, והלחץ בעלי חיים. בנוסף, הוא עלול לגרום חוקרים להחליט להכין דגימות לבדיקה אחת בלבד, בדרך כלל mRNA, הגבלת מספר שאלות ביולוגי יכול ייחקרו. עם זאת, ncRNAs להקיף כמה מחלקות רגולטוריות תפקידים עם הביטוי הזה mRNA אפקט. כי ncRNA חשובים היסוד תהליכים ביולוגיים, הפרעה של תהליכים אלה ב במהלך זיהום, הם עשויים, לכן, לבצע יעדים אטרקטיביים עבור הרפוי. כתב יד זה מדגים פרוטוקול ששונה לדור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ביטוי ספריות, כולל RNA נגיפי, מתוך מדגם יחיד של דם מלא. אופטימיזציה של פרוטוקול זה, שיפור טוהר RNA, גדל מצדו להתאוששות של RNAs מפוגל, הושמט גודל הבחירה, כדי לאפשר לכידה של RNA יותר מינים.

הדגימות נציג במחקר שלנו הם גלובין דגימות דם כל מדולדל ribo. התוצאה נציג של הפרוטוקול מורכב מדגם ספריית מדולדל גלובין עם מספר שלמות RNA (RIN) מעל 7 (איור 1) ו- 260/280 nm ריכוז יחסי או מעל 2 (איור 1ב' וג' 1). אימות של התוצאה מדגם בוצעה באמצעות ספקטרופוטומטרים כדי לתת את הריכוז הסופי של כל ספריה, מבוססי שבב אלקטרופורזה לתת מספר רין יחד עם תרשים של פסגות להראות אילו מולקולות (mRNA או ncRNA) נלכדו המ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור העיבוד של קידוד (mRNA) האופטימיזציות גלובין (ncRNA) ללא קידוד RNA-seq ספריות של דגימת דם כל יחיד.

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן על ידי מתן אפשרות בדיקה של קידוד, אי קידוד, ביטוי RNA ויראלי מעורב בתגובת האמינו המארח, כמו גם איך פתוגן יכול להשפיע על הפונקציות הביולוגיות של המארח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציגה פרוטוקול אופטימיזציה לעיבוד של mRNA ו- RNA ללא קידוד מספריות RNAseq מופחת גלובין מדגם דם שלם יחיד. הפגנת הטכניקה תהיה שרה אנדרסון, טכנאית מהמעבדה שלי.התחל על ידי צנטריפוגה צינורות הדם ב 50 20 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. עבודה בארון בטיחות ביולוגי, לאחר הסרת supernatant, להוסיף שמונה מיליליטר של מים ללא RNase לכדור. סגור את הצינורות ואת המערבולת את גלולה עד שהוא מומס בעליל, ואז צנטריפוגה הצינורות ב 50 20 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחזר את גלולה.עובד בארון בטיחות ביולוגי, להשליך את העל טבעי ולשמור את גלולה. כדי לבודד את ה- RNA הכולל, התחל על-ידי צינורות 300 מיקרוליטרים של מאגר איגוד תזה לכדור. לאחר המערבולת, מעבירים את התערובת מכל צינור לצינור צנטריפוגה חדש שכותרתו 1.5 מיליליטר.הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תוסף הומוגנטי בערכת הבידוד miRNA. מערבולת הצינורות ומ מניחים על הקרח במשך 10 דקות. עובדים במכסה המנוע של אדים, מסירים את הצינורות מקרח ומוסיפים 300 מיקרוליטרים של ריאגנט החומצה פנול כלורופורם מהערכות והמערבולת שוב כדי לערבב.לאחר צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, להסיר בזהירות שלב מיוודי לצינור חדש. בהתבסס על כמות ההחלמה המעונה מהשלט הקודם, להוסיף 1.25 פעמים את הנפח של 100%אתנול פאג' מים בכל צינור פיפטה לערבב. הכן צינורות איסוף טריים המכילים מחסנית סינון עבור כל דגימה.פיפטה כ 675 microliters של תערובת ליסט-אתנול על מחסנית המסנן. צנטריפוגה לזמן קצר ב 10, 000 פעמים G להעביר נוזל דרך המסנן. השלך את הזרימה דרך.חזור על תערובת lysate-אתנול הוספת המסנן צנטריפוגה עד שהוא שימש לחלוטין. הוסף 700 מיקרוליטרים של פתרון שטיפה אחד מההערכה למחסנית המסנן. צנטריפוגה בקצרה כדי למשוך את הפתרון דרך המסננים.השלך את הזרימה דרך ולשמור את אותן מחסניות מסנן וצינורות איסוף. הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון שטיפה 2-3 לכל מחסנית סינון. לאחר צנטריפוגה שוב, להשליך את הזרימה דרך ולחזור על צעד לשטוף.כדי להסיר כל נוזל שיורית ממחסניות הסינון, סובב אותן 60 שניות נוספות. מעבירים את המחסניות לצינורות איסוף טריים. הוסיפו למרכז כל מחסנית מסנן 100 מיקרוליטרים של 95 מעלות צלזיוס שחומם מראש.צנטריפוגה את המחסניות במשך כ 20 עד 30 שניות על צנטריפוגה השולחן במהירות המרבית. כדי ליצור מראש הכלאה עם אוליגוס הפחתת גלובין, תחילה denature RNA על ידי הוספת כל מדגם שחולצו לתוך צינור תגובה דק קירות דקים 0.2 מיליליטר ללא גרעין. מניחים את הצינורות במחזור תרמי ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.לאחר מכן, מיד למקם את הצינורות על קרח כדי לקבל איכות RNA אופטימלית. בעוד הצינורות מתקררים, הכינו 400 מיקרוליטרים של תערובת אוליגו להפחתת גלובין פי 10 וחוצץ הכלאה אוליגו פי 10 בצינור שני מיליליטר. כדי להפוך את תערובת ההכלאה, להוסיף שישה מיקרוגרם של מדגם RNA, שני microliters של תערובת אוליגו הפחתת 10X גלובין, מיקרוליטר אחד של חיץ הכלאה אוליגו 10X, ומים ללא גרעין לנפח סופי של 10 microliters לכל 0.2 מיליליטר דק קירות, צינור תגובה ללא גרעין.מניחים את הצינורות במחזור התרמי ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר מכן, מיד מניחים את הצינורות על קרח. כדי לבצע עיכול RNase H, תחילה לדלל 10X RNase H אחד X RNase H עם אחד X RNase H מאגר.הכן RNase H תגובה לערבב על ידי שילוב של שני microliters של חיץ RNase 10X, מיקרוליטר אחד של מעכב RNase, ושני microliters של אחד X RNase H, וחמישה microliters של מים ללא גרעין לנפח כולל של 10 microliters. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תערובת התגובה RNase H לדגימות ההכלאה להפחתת גלובין ומערבבים היטב. לעכל תגובה זו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן להתקרר עד ארבע מעלות צלזיוס.לעצור את העיכול על ידי הוספת microliter אחד של 0.5 EDTA טוחן לצינור, ולהעביר את כל התוכן של הצינור לצינור טרי 1.5 מיליליטר. מיד לאחר מכן, להוסיף 80 microliters של מים ללא RNase, 350 microliters של חיץ תיזה, אז 250 microliters של 100% אתנול לכל צינור ומערבבים היטב על ידי צינור. מעבירים כל דגימת 700 מיקרוליטר למחסנית נפרדת של מסנן אלוט שהונחה בצינור איסוף של שני מיליליטר כדי לאסוף את הזרימה.צנטריפוגה במשך 15 שניות ב 8, 000 פעמים G או יותר ולאחר מכן להשליך את הזרימה דרך. מניחים את אותן מחסניות מסנן אלוטיון לתוך צינורות איסוף חדשים של שני מיליליטר. כדי לשטוף את קרום מחסנית המסנן, הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר הכביסה המתון למחסניות הסינון ולצנטריפוגה למשך 15 שניות במהירות של 8,000 גרם ומעלה.השלך את הזרימה דרך. לאחר מכן, באמצעות אותם צינורות איסוף, להוסיף 500 microliters של 80% אתנול מחסניות המסנן. צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 8, 000 פעמים G וגדול יותר.השלך הן את צינורות הזרימה והן את צינורות האיסוף, ושמור את עמודי הסיבוב של elution. מניחים כל עמוד ספין אלוטיון לתוך צינור איסוף חדש של שני מיליליטר. צנטריפוגה במהירות מלאה במשך חמש דקות עם המכסה הפתוח על מחסניות מסנן לייבש את קרום עמוד ספין ולמנוע נשיאת אתנול.לאחר השלכת צינורות האיסוף, מניחים כל מחסנית מסנן מיובשת לתוך צינור איסוף טרי של 1.5 מיליליטר. הוסף 14 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase ישירות למרכז קרום מחסנית המסנן. כדי לחמק RNA, צנטריפוגה את הצינורות במשך 60 שניות במלוא המהירות ולאחר מכן להמשיך עם הערכת RNA נוספת והכנה.כעת ניתן לפצל את המדגם המדולדל של גלובין ושמש להכנת ספריות ה- RNA הקטנות והלא-קידוד, כמו גם את ה- mRNA המדולדל בריבו וספריות RNA ארוכות ולא קידוד. לאחר הכנת ספריות ביטוי של דגימות דם שלם מדולדל גלובין ריבו באמצעות פרוטוקול זה, סיכום הפעלת קובץ אלקטרופורזה הראה מדגם ספרייה דלדול גלובין עם מספרי תקינות RNA שנע בין 6.3 ל 9.2. זה הוכיח להיות שיפור בהשוואה למחקרים אחרים שהשתמשו בשיטות דלדול גלובין היו מסוגלים להשיג רק מספרי RIN ב או קרוב לשישה.הפחתת טרום גלובין וירידה שלאחר גלובין של דגימת דם שלמה פורצ'ין יחיד הראו כי 260 עד 280 יחסי ריכוז ננומטר הם מעל או מעל שניים. באמצעות פרוטוקול זה, אלקטרופרוגרמות מבוססות שבבים של דגימות ספריית mRNA של דם שלם מרוקן גלובין ואריבו לפני אסיפת ותיבה הושגו. עבור ספריות mRNA, האלקטרופרוגרמה הייצוגית יש שיא בערך 280 זוגות בסיס.עבור אלקטרופרוגרמות מבוססות שבבים מייצגות ncRNAs קטנות מכילות מגוון פסגות מכ- 100 עד 400 זוגות בסיסים. פסגות בכ- 143 זוגות בסיסים תואמות ל- miRNAs, ופסגות בכ- 153 זוגות בסיסים תואמות ל- piRNAs. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור צינורות קרח מיד שם צוין.בעקבות הליך זה, יש לבצע שיטות אחרות כגון רצף הדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כגון ביטוי דיפרנציאלי, שינויים אפיגנטיים והשפעתם על מסלולים ותהליכים ביולוגיים. אל תשכח כי עבודה עם ריאגנט פנול-כלורופורם הוא מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון עבודה ברדס אדים יש לנקוט. כמו כן, בעת טיפול בדם שלם או אורגניזמים זיהומיות, העבודה צריכה להתבצע בארון בטיחות ביולוגי לפני הפעלת האורגניזם הזיהומי.

identification-coding-non-coding-rna-classes-expressed-swine-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ניתוחי RNA-רצף וביואינפורמטיקה שמשו לזהות גורמי שעתוק הביעו באופן משמעותי ואופן דיפרנציאלי בתת אוכלוסיות לין-CD34 + ולין-CD34- של EMLcells עכבר. גורמי שעתוק אלו עשויים לשחק תפקיד חשוב בקביעה לעבור בין תאי לין-CD34- לין-CD34 + ומובחן באופן חלקי עצמי חידוש.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

רצף Nanopore הוא טכנולוגיה חדשנית המאפשרת רצפי בעלות חסכונית במיקומים מרוחקים והגדרות משאב-עני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור רצף של mRNAs מתוך דם שלם התואם לתנאים כאלה.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

תרגום ריבוזומים מפענח שלושה נוקלאוטידים לכל קודון לפפטידים. תנועתם לאורך mRNA, שנתפסה על ידי פרופיל ריבוזום, מייצרת את העקבות המציגות תקופת שלישייה אופיינית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש RiboCode כדי לפענח תכונה בולטת זו מנתוני פרופיל ריבוזום כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל ברמת התמלול המלא.

De novo זיהוי של מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל עם נתוני יצירת פרופילים של ריבוזום

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

למד פרוטוקול לבידוד RNA מקודד ולא מקודד מדגימות דם מלא עם הפחתת גלובין. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות מארח-פתוגן וניתוח ביטוי RNA בגנומיקה.

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

גלה סרטונים נוספים