זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן על ידי מתן אפשרות בדיקה של קידוד, אי קידוד, ביטוי RNA ויראלי מעורב בתגובת האמינו המארח, כמו גם איך פתוגן יכול להשפיע על הפונקציות הביולוגיות של המארח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציגה פרוטוקול אופטימיזציה לעיבוד של mRNA ו- RNA ללא קידוד מספריות RNAseq מופחת גלובין מדגם דם שלם יחיד. הפגנת הטכניקה תהיה שרה אנדרסון, טכנאית מהמעבדה שלי.

התחל על ידי צנטריפוגה צינורות הדם ב 50 20 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. עבודה בארון בטיחות ביולוגי, לאחר הסרת supernatant, להוסיף שמונה מיליליטר של מים ללא RNase לכדור. סגור את הצינורות ואת המערבולת את גלולה עד שהוא מומס בעליל, ואז צנטריפוגה הצינורות ב 50 20 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחזר את גלולה.

עובד בארון בטיחות ביולוגי, להשליך את העל טבעי ולשמור את גלולה. כדי לבודד את ה- RNA הכולל, התחל על-ידי צינורות 300 מיקרוליטרים של מאגר איגוד תזה לכדור. לאחר המערבולת, מעבירים את התערובת מכל צינור לצינור צנטריפוגה חדש שכותרתו 1.5 מיליליטר.

הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תוסף הומוגנטי בערכת הבידוד miRNA. מערבולת הצינורות ומ מניחים על הקרח במשך 10 דקות. עובדים במכסה המנוע של אדים, מסירים את הצינורות מקרח ומוסיפים 300 מיקרוליטרים של ריאגנט החומצה פנול כלורופורם מהערכות והמערבולת שוב כדי לערבב.

לאחר צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, להסיר בזהירות שלב מיוודי לצינור חדש. בהתבסס על כמות ההחלמה המעונה מהשלט הקודם, להוסיף 1.25 פעמים את הנפח של 100%אתנול פאג' מים בכל צינור פיפטה לערבב. הכן צינורות איסוף טריים המכילים מחסנית סינון עבור כל דגימה.

פיפטה כ 675 microliters של תערובת ליסט-אתנול על מחסנית המסנן. צנטריפוגה לזמן קצר ב 10, 000 פעמים G להעביר נוזל דרך המסנן. השלך את הזרימה דרך.

חזור על תערובת lysate-אתנול הוספת המסנן צנטריפוגה עד שהוא שימש לחלוטין. הוסף 700 מיקרוליטרים של פתרון שטיפה אחד מההערכה למחסנית המסנן. צנטריפוגה בקצרה כדי למשוך את הפתרון דרך המסננים.

השלך את הזרימה דרך ולשמור את אותן מחסניות מסנן וצינורות איסוף. הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון שטיפה 2-3 לכל מחסנית סינון. לאחר צנטריפוגה שוב, להשליך את הזרימה דרך ולחזור על צעד לשטוף.

כדי להסיר כל נוזל שיורית ממחסניות הסינון, סובב אותן 60 שניות נוספות. מעבירים את המחסניות לצינורות איסוף טריים. הוסיפו למרכז כל מחסנית מסנן 100 מיקרוליטרים של 95 מעלות צלזיוס שחומם מראש.

צנטריפוגה את המחסניות במשך כ 20 עד 30 שניות על צנטריפוגה השולחן במהירות המרבית. כדי ליצור מראש הכלאה עם אוליגוס הפחתת גלובין, תחילה denature RNA על ידי הוספת כל מדגם שחולצו לתוך צינור תגובה דק קירות דקים 0.2 מיליליטר ללא גרעין. מניחים את הצינורות במחזור תרמי ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.

לאחר מכן, מיד למקם את הצינורות על קרח כדי לקבל איכות RNA אופטימלית. בעוד הצינורות מתקררים, הכינו 400 מיקרוליטרים של תערובת אוליגו להפחתת גלובין פי 10 וחוצץ הכלאה אוליגו פי 10 בצינור שני מיליליטר. כדי להפוך את תערובת ההכלאה, להוסיף שישה מיקרוגרם של מדגם RNA, שני microliters של תערובת אוליגו הפחתת 10X גלובין, מיקרוליטר אחד של חיץ הכלאה אוליגו 10X, ומים ללא גרעין לנפח סופי של 10 microliters לכל 0.2 מיליליטר דק קירות, צינור תגובה ללא גרעין.

מניחים את הצינורות במחזור התרמי ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר מכן, מיד מניחים את הצינורות על קרח. כדי לבצע עיכול RNase H, תחילה לדלל 10X RNase H אחד X RNase H עם אחד X RNase H מאגר.

הכן RNase H תגובה לערבב על ידי שילוב של שני microliters של חיץ RNase 10X, מיקרוליטר אחד של מעכב RNase, ושני microliters של אחד X RNase H, וחמישה microliters של מים ללא גרעין לנפח כולל של 10 microliters. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תערובת התגובה RNase H לדגימות ההכלאה להפחתת גלובין ומערבבים היטב. לעכל תגובה זו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן להתקרר עד ארבע מעלות צלזיוס.

לעצור את העיכול על ידי הוספת microliter אחד של 0.5 EDTA טוחן לצינור, ולהעביר את כל התוכן של הצינור לצינור טרי 1.5 מיליליטר. מיד לאחר מכן, להוסיף 80 microliters של מים ללא RNase, 350 microliters של חיץ תיזה, אז 250 microliters של 100% אתנול לכל צינור ומערבבים היטב על ידי צינור. מעבירים כל דגימת 700 מיקרוליטר למחסנית נפרדת של מסנן אלוט שהונחה בצינור איסוף של שני מיליליטר כדי לאסוף את הזרימה.

צנטריפוגה במשך 15 שניות ב 8, 000 פעמים G או יותר ולאחר מכן להשליך את הזרימה דרך. מניחים את אותן מחסניות מסנן אלוטיון לתוך צינורות איסוף חדשים של שני מיליליטר. כדי לשטוף את קרום מחסנית המסנן, הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר הכביסה המתון למחסניות הסינון ולצנטריפוגה למשך 15 שניות במהירות של 8,000 גרם ומעלה.

השלך את הזרימה דרך. לאחר מכן, באמצעות אותם צינורות איסוף, להוסיף 500 microliters של 80% אתנול מחסניות המסנן. צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 8, 000 פעמים G וגדול יותר.

השלך הן את צינורות הזרימה והן את צינורות האיסוף, ושמור את עמודי הסיבוב של elution. מניחים כל עמוד ספין אלוטיון לתוך צינור איסוף חדש של שני מיליליטר. צנטריפוגה במהירות מלאה במשך חמש דקות עם המכסה הפתוח על מחסניות מסנן לייבש את קרום עמוד ספין ולמנוע נשיאת אתנול.

לאחר השלכת צינורות האיסוף, מניחים כל מחסנית מסנן מיובשת לתוך צינור איסוף טרי של 1.5 מיליליטר. הוסף 14 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase ישירות למרכז קרום מחסנית המסנן. כדי לחמק RNA, צנטריפוגה את הצינורות במשך 60 שניות במלוא המהירות ולאחר מכן להמשיך עם הערכת RNA נוספת והכנה.

כעת ניתן לפצל את המדגם המדולדל של גלובין ושמש להכנת ספריות ה- RNA הקטנות והלא-קידוד, כמו גם את ה- mRNA המדולדל בריבו וספריות RNA ארוכות ולא קידוד. לאחר הכנת ספריות ביטוי של דגימות דם שלם מדולדל גלובין ריבו באמצעות פרוטוקול זה, סיכום הפעלת קובץ אלקטרופורזה הראה מדגם ספרייה דלדול גלובין עם מספרי תקינות RNA שנע בין 6.3 ל 9.2. זה הוכיח להיות שיפור בהשוואה למחקרים אחרים שהשתמשו בשיטות דלדול גלובין היו מסוגלים להשיג רק מספרי RIN ב או קרוב לשישה.

הפחתת טרום גלובין וירידה שלאחר גלובין של דגימת דם שלמה פורצ'ין יחיד הראו כי 260 עד 280 יחסי ריכוז ננומטר הם מעל או מעל שניים. באמצעות פרוטוקול זה, אלקטרופרוגרמות מבוססות שבבים של דגימות ספריית mRNA של דם שלם מרוקן גלובין ואריבו לפני אסיפת ותיבה הושגו. עבור ספריות mRNA, האלקטרופרוגרמה הייצוגית יש שיא בערך 280 זוגות בסיס.

עבור אלקטרופרוגרמות מבוססות שבבים מייצגות ncRNAs קטנות מכילות מגוון פסגות מכ- 100 עד 400 זוגות בסיסים. פסגות בכ- 143 זוגות בסיסים תואמות ל- miRNAs, ופסגות בכ- 153 זוגות בסיסים תואמות ל- piRNAs. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור צינורות קרח מיד שם צוין.

בעקבות הליך זה, יש לבצע שיטות אחרות כגון רצף הדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כגון ביטוי דיפרנציאלי, שינויים אפיגנטיים והשפעתם על מסלולים ותהליכים ביולוגיים. אל תשכח כי עבודה עם ריאגנט פנול-כלורופורם הוא מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון עבודה ברדס אדים יש לנקוט. כמו כן, בעת טיפול בדם שלם או אורגניזמים זיהומיות, העבודה צריכה להתבצע בארון בטיחות ביולוגי לפני הפעלת האורגניזם הזיהומי.