רצפי RNA בתא יחיד של נוירונים Fluorescently שכותרתו העכבר באמצעות מיון ידני וכפול במבחנה תמלול עם ספירות מוחלטת רצף (DIVA-Seq)

שיטה זו יכולה לעזור לפתור מכשול מרכזי בתחום הבידוד והתהוות של נוירון יחיד. כגון איסוף אוכלוסייה ספציפית או תת-אוכלוסייה של נוירון בעל תווית פלואורסצנטית מאזור המוח המוגדר על-ידי המשתמש. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מבטיחה את הנוירון היחיד של עניין נתפס ללא פסולת מזהמת.

זה גם עדין יחסית, וזה חשוב עבור סוגי נוירונים שבירים שמתים במהירות כאשר נתון ללחצים הנוזליים של מיון FACS קונבנציונלי. התחל על ידי הכנת microcapillaries זכוכית משך עם 10 עד 15 מיקרון קוטר יציאה באמצעות מושך נימי. השתמש מספריים עדין לחתוך את קצה נימי כדי לקבל את קוטר הלוח הרצוי.

לאחר מכן השתמשו במחברי צינורות כדי לחבר אורך של 120 עד 150 ס"מ של צינורות סיליקון גמישים בקוטר פנימי של 0.8 מילימטר למסנן מזרק ממברנה PVDF מיקרון 0.2 ושסתום צינור דו כיווני. הכינו 500 מיליליטר של נוזל שדרה מלאכותי מקורר או ACSF וחמצן על ידי מבעבע 5%פחמן דו חמצני מאוזן חמצן דרך Airstone במשך 15 דקות או עד הפתרון מתנקה לחלוטין. הכינו שלוש חבילות של 150 מיליליטר שכל אחת מהן מכילה 100 מיליליטר של ACSF.

לאחד, להוסיף קוקטייל של חוסמי פעילות. לאחר, להוסיף שבר סטרפטוקוקוס לפרוטאז לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. לסק הסופי, מוסיפים FBS לריכוז סופי של 1% ומחמצנים עם 5% חמצן מאוזן פחמן דו חמצני דרך איירסטון.

לבסוף, לעשות שלוש פיפטים פסטר לטווח ארוך עם קטי ירידה בקוטר היציאה על ידי גלגול אותם על להבה פתוחה. לנתח את המוח מעכבר המתת דם על ידי פתיחת הגולגולת עם מספריים קטנים וחילוץ המוח הטרי באמצעות מטלפים עדין מבלי לפגוע בקליפת המוח. הנח את המוח ב- ACSF מקורר וחמצן והשאיר אבן אוויר מחוברת לחמצן מאוזן פחמן דו-חמצני של 5% לאורך כל תקופת הניתוח.

מקם את המוח על צ'אק הרטט וגזור חלקים של קורונלי או קשת בעובי של 300 מיקרון. לאסוף מקטעים רבים ככל הנדרש כדי להשיג מינימום של 10 עד 50 תאים שכותרתו. שים פרוסות על מחזיק פרוסת רשת כותנה ממוקם בתוך מקור כך שהם ש רוחצים ACSF מחומצן.

מעבירים את הפרוסות לתוך המקורה המכילה ACSF עם חוסמי פעילות וחוסמים במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר תוך מבעבע חמצן באמצעות איירסטון. מעבירים את הפרוסות לתוך המקור המכיל ACSF עם פתרון פרוטאז לבצע עיכול קל בטמפרטורת החדר. לאחר העיכול, לשטוף את הפרוטאז על ידי הזזת פרוסות בחזרה לתוך המקור המכיל ACSF עם פתרון חוסם פעילות במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר.

תמשיך לבעבע חמצן. לאחר מכן, הכינו צלחת פטרי באורך 100 מ"מ המכילה ACSF עם 1%FBS בטמפרטורת החדר והזיזו חלקים בודדים לדיסק למיקרו-דיסק. תחת היקף ניתוחים פלואורסצנטיים, השתמש בזוג מדפים עדין כדי לנתח מיקרו אזורים ושכבות עניין שיש להם מינימום של 10 עד 50 תאים.

באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את חתיכות מיקרו ניתוח לצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מיליליטר המכיל כ 0.8 מיליליטר של 1%FBS בת פתרון ACSF. לטהר את הרקמה המנותקת בצינור מיקרו-פיוז' בטמפרטורת החדר. בצע כ 10 משיכות עם כל פיפטים פסטר להבה החל הגדול ביותר וכלה בקוטר היציאה הקטן ביותר.

מחלקים את התאים המנותקים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה ACSF מחומצן ומחכים חמש עד שבע דקות עד שהתאים יתיישבו בהדרגה. שים לב לאות GFP ו- RFP תחת מיקרוסקופ ניתוח. זהה פסולת על ידי בחינת המורפולוגיה תחת תאורת שדה בהיר.

לאחר אזור של תאים עם פסולת קטנה זוהה, להשתמש נימי לצרף צינורות כדי לבחור תאים על ידי חסימת קצה שסתום צינורות עם הלשון. לאחר מכן מקם את נימי קרוב לתאים. שחרר את הבלוק על נימי במהירות לחסום שוב כדי ללכוד את התא באמצעות פעולה נימי.

מעבירים את נימי לצלחת פטרי 100 מ"מ עם ACSF מחומצן טרי בעדינות מכה לתוך הצינור תוך התבוננות קצה נימי תחת אופטיקה פלואורסצנטית לחלק את התאים לתוך המנה. חזור על הליך האיסוף עד שנאספים 100 עד 150 תאים כדי לוודא שמזהמים, כגון פסולת, הם מינימליים באופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות של שדה בהיר. לבסוף, באמצעות פיפטה מיקרו נימי טרי בכל פעם, לבחור תא אחד לגרש אותו לא יותר מ 0.5 microliters לתוך צינור מיקרו-fuge מיקרוליטר 0.2 המכיל microliter אחד של מאגר איסוף מדגם עם פריימרים.

לשבור את קצה פיפטה בצינור מיקרו-fuge כדי להבטיח כי התא נשאר במאגר האיסוף. להקפיא את התאים על ידי לשים את הצינורות על קרח יבש. יש לאחסן במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד להגברת רנ"א.

תאי עצב GABAergic היו מבודדים מקליפת המוח cingulet של המוח העכבר. רנ"א מוגבר מהנוירונים המימוינים ידנית נע בין 200 ל-4,000 זוגות בסיסים בגודל עם התפלגות שיא מעט מעל 500 זוגות בסיסים. לאחר טיהור חרוזים, ספריית cDNA מוגבלת עוד יותר על ידי סיבוב שני של טיהור באמצעות חרוזים כדי לחסל שברים פחות מ -200 זוגות בסיסים ועל הפסגה בכ 350 זוגות בסיס.

רצף הראה 4.8 פעמים 10 כדי החציון החמישי או 6.9 פעמים 10 כדי 5 קריאות ממופות בממוצע לכל תא. לאחר הסרת RNA כפולה באמצעות UMIs, לכל תא בודד היו 1.0 כפול 10 עד החציון החמישי או פי 1.4 10 מהממוצע החמישי של קריאות ייחודיות לתא. בכל תא יחיד קונסורציום פקדי RNA חיצוניים, ספייק ב- RNA שימש כבקרה פנימית כדי לחשב מספר מוחלט של מולקולות שנוספו לדגימה.

היה קשר ליניארי של קלט לספירות שנצפו עם שיפוע של 0.92 ומרובע R מותאם של 0.94. בממוצע של כ -10,000 גנים לכל נוירון יחיד זוהו באמצעות הליך זה עם יותר מ 95% של תאים בודדים גילוי יותר מ 6, 000 גנים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לביולוגים מולקולריים לחקור את התמלול של אינטראורונים קליפת המוח של העכבר המאופיינים היטב, וזיהתה קטגוריות גנים נבחרות האחראיות על קידוד הזהות התאית.