Name: כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: חקור את השפעת החסינות הקיימת לנגיף דנגה על זיהום נגיף הזיקה בתאי חיסון אנושיים ראשוניים באמצעות PCR בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת הערכת שיפור תלוי נוגדנים ומספקת תובנות לפיתוח חיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בנדיבות על ידי 1R21AI129881-01 (ל T.M.C.), סטארט-אפ קרנות לאומיות המתעוררים זיהומיות מחלות המעבדות, ואת הספר לרפואה של אוניברסיטת בוסטון.

הדוגמאות סרום השתמשו במחקר זה התקבלו ממשתתפים האנושי של עמית מאוניברסיטת קולומביה. אוסף דגימה אושרה על ידי ועדת הבדיקה הפנימית (IRB) למד דה פמפלונה (קולומביה, דרום אמריקה) ואת בית החולים לוס Potios8. הדגימות נמסרו באופן אנונימי והיה החוקרים אין גישה אל המידע למטופל. הדוגמאות סרום היו בדקו את serotype DENV. הדגימות אומתו נוספת כדי לנטרל. את זיהום DENV אין ויטרו. עבור פקד, שימשו הדוגמאות סרום אנשים בריאים (HC) מארה ב.
הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את שכפול אייד של ZIKV בכל סוג התא האנושי לבטא את הקולטן Fcγ. הפרוטוקול כוללת שלושה חלקים (איור 1).
1. תא זריעה ואת זיהום ההתקנה
הערה: עבור מחקר מסוים, מקרופאגים העיקרי אנושי או שורת התאים myelomonocytic U937 (בקרת האוויר-CRL-1593.2) היו בשימוש. התאים היו מתוחזקים מדיום הגידול RPMI בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS)-חממה 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2). כל הפעולות בוצעו עם אבטחה ברמה 2 הקבינט אבטחה (BSL-2) בתנאים סטריליים.
<ol><li>4 תאי הזרע 3 x 10 טוב בצלחת 96-ובכן שטוח התחתונה סטרילי יחד עם 100 µL בינוני ולמקם אותם בחממה 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>לאחר זריעה התאים, להפשיר הדוגמאות סרום בטמפרטורת החדר ולהפוך דילולים טורי 10-fold (קרי, 1/10, 1/100, 1/1, 000, 1/10,000) על ידי ערבוב את הדוגמאות סרום ללא בינוני. Aliquot דילולים לתוך צלחת 96-ובכן סטרילי. להשתמש את הווירוס מבלי סרום פקד נוספים.</li>
	<li>להפשיר את המניה ZIKV ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים למשך 1-2 דקות, במהירות העברתם לקרח לשימוש עתידי.</li>
	<li>להוסיף ריבוי 0.1 של זיהום (MOI) כמות שוות ערך של זן ZIKV MR766 aliquots בסרום. הערה: ודא כי הגורם דילול נשאר קבוע ואמצעי האחסון הכולל ~ 200 µL; זה מספיק בשביל triplicates של כל טיפול. שמור משלוש בארות uninfected שתשמש שליטה שלילי לניתוח במורד הזרם.</li>
	<li>דגירה של דילולים סרום עם וירוס נוסף בחממה 37 ° C עם 5% CO2 עבור 1 h כדי לאפשר את הנוגדנים DENV כדי מתחמי טופס עם virions Zika (לנוחיותכם, ןלהל "מכלולי המערכת החיסונית").</li>
	<li>האחות התקשורת את התאים היו נזרע בצלחת 96-ובכן שטוח התחתונה. לשטוף את התאים עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (1 x PBS).</li>
	<li>להוסיף 50 µL של מכלולי המערכת החיסונית כל טוב, דגירה אותם בחממה 37 ° C עם 5% CO2 כבר שעתיים.</li>
	<li>לאחר שעתיים של דגירה, תשאף שהמדיה המכילה את מתחמי המערכת החיסונית מתאי, באמצעות רב-ערוצי פיפטה, ולשטוף את התאים 2 x עם PBS 1 x כדי להסיר לחלוטין את מתחמי המערכת החיסונית ואת כל virions כעיגולים בצבע.</li>
	<li>להוסיף 100 µL טריים התקשורת מלאה בתוספת 10% FBS לכל טוב ואני דגירה התאים בחממה 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות.</li>
</ol>2. RNA החילוץ
<ol><li>הסר את לוחית 96-ובכן של החממה, להעביר אותו אבטחה בארון.</li>
	<li>האחות התקשורת, לשטוף את התאים 2 x עם 1 x PBS, והמשך החילוץ-RNA. הערה: רנ א ניתן באמצעות אחת השיטות של בחירה (עיין טבלה של חומרים).</li>
	<li>להוסיף 250 µL תא מאגר פירוק עם 10% β-mercaptoethanol לכל טוב. Pipette המאגר למעלה ולמטה x לפחות 5 יחד עם גירוד התאים עם קצה פיפטה כדי להאיץ את הליך פירוק.</li>
	<li>להעביר את lysates תא חדש, שכותרתו, סטרילי mL 1.5 צינורות.</li>
	<li>מוסיפים כמות שווה של 70% אתנול (250 µL). פיפטה לאורך 4 x - 5 x עד שהתערובת תהיה ברורה.</li>
	<li>להעביר את התערובת (µL ~ 500) עם התווית מבוסס-סיליקה עמודות ב- 2 mL אוסף צינורות ו centrifuge ב 15,000 x g עבור ביטול ס' 30 את הזרימה ולשמור את העמודות בתוך הצינורות אוסף אותו.</li>
	<li>להוסיף 700 µL שטיפת מאגר 1 כל עמודה ו centrifuge ב 15,000 x g עבור ביטול ס' 30 את הזרימה ולשמור את העמודות בתוך הצינורות אוסף אותו.</li>
	<li>להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 2 כל עמודה, צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 30 ס' להשליך תגובת שיקוע. חזור על שלב זה, 2 x.</li>
	<li>העברת שהעמודות צינורות אוסף 2 mL החדש, צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 2 דק. ודא כי עמודות מבוסס-סיליקה להתייבש לחלוטין ואין שום אתנול עזב מהמאגר לשטוף 2.</li>
	<li>למחוק את הצינורות 2 מ"ל ולמקם הטורים חדש, סטרילי, שכותרתו, 1.5 mL שחזור צינורות.</li>
	<li>להוסיף prewarmed (42 ° C) 30 µL של מים נטולי RNase במרכזו של כל עמודה, צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 1 דקות.</li>
	<li>לשחזר את הרנ א eluted ולכמת את הדגימות, שימוש ספקטרופוטומטרים-260 ננומטר אורך גל. הערה: באופן אידיאלי, לקבוע את טוהר הרנ א על-ידי חישוב היחס בין הערכים ספיגת ב-260 nm ו 280 ננומטר. יחס 260/280 של RNA מזוכך הוא אידיאלי בין 1.8-2.0.</li>
</ol>3. תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת
הערה: כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) יכול להתבצע על-ידי שימוש בכל שילוב SYBR ירוק אשר בדרך כלל מורכב SYBR Green אני צובע, Taq DNA פולימראז, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), צבע פסיבי. כל מחשב qPCR מסוגל זיהוי SYBR ירוק ניתן לבצע את התגובה ולרכוש את הנתונים. עבור ניסוי זה, ערכת RT-PCR בשלב אחד שימש אשר היה קוקטייל. של SYBR Green אני רוקס לצבוע, Taq DNA פולימראז, dNTPs, תערובת נוספים של רוורס טרנסקריפטאז (עיין טבלה של חומרים). Primers נגד האזור המעטפה ותחתית השתמשו במחקר זה לכמת רמות גנומית ZIKV הם CCGCTGCCCAACACAAG על ZIKV-העל CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT עבור ZIKV-qR. כפקד, אנושי β-2-microglobulin (B2M) היה נמדד ומשמשת לנרמל את הביטוי של ZIKV (משק הגן). רצפי פריימר לכמת בביטוי הגן B2M השתמשו במחקר זה הן CTCCGTGGCCTTAGCTGTG עבור B2M-העל TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT עבור B2M-qR. ודא לשים שלושה משכפל טכני עבור כל דגימה גם את ZIKV וגם את הגנים B2M. ההתקנה של RT-PCR מתואר בקצרה להלן.
<ol><li>
RT-PCR ההתקנה
	<ol>
<li>שימוש 100 ננוגרם של RNA לדגימה.</li>
		<li>הוסף 1 µL מ- 10 מיקרומטר מניות של תחל ויוצאים של גן מסוים עבור כל תגובה.</li>
		<li>הוסף µL 0.25 של רוורס טרנסקריפטאז מיקס לדגימה.</li>
		<li>עבור כל תגובה אישית, להוסיף µL 12.5 של מיקס SYBR Green.</li>
		<li>להוסיף עד 25 µL של מים. להפוך תבנית בסיס שילוב של כל ריאגנטים הנ"ל חוץ RNA, aliquot אותו בצלחת PCR 96-ובכן, ולהוסיף RNA אחרונה.</li>
		<li>חותם לצלחת עם סרט דביק שקוף.</li>
		<li>Centrifuge את הצלחת ב x 1000 g עבור 1 דקות לערבב את ריאגנטים.</li>
		<li>לשים את הצלחת המכונה qPCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RT-PCR פרופיל הערה: משתמשים בפרופיל RT-PCR שמוצג טבלה 1.
	<ol>
<li>דגירה בדגימות ב 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על מנת להבטיח הסינתזה של דנ א משלים (cDNA).</li>
		<li>לאחר הסינתזה cDNA, להפעיל את Taq DNA פולימראז ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
		<li>לבצע 40 מחזורי דנטורציה ב 95 ° C עבור 10 s ו פריימר חישול והסיומת ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 s.</li>
		<li>שם השלב עקומת להמיס נוספים (65° C) בסופו של דבר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח נתונים
	<ol>
<li>לנטר את עקומת להמיס על-ידי לחיצה על הכרטיסיה עקומת להמיס במסגרת התוכנית המשמשת להפעלת המכונה qPCR, אשר, באופן אידיאלי, מראה לשיא יחיד כל הדגימות עבור גן מסוים לאשר הנוכחות של אחד בלבד אמפליקון וערך הגברה יותר מ 1.6 אם את algori thm מחשיב 2 כערך הגברה 100% (הערך הגברה משתנה על פי האלגוריתם המשמש את המכונה qPCR). הקפד להשתמש 0.5 ° C דרגות טמפרטורה בין השלבים למינימום החזקת זמן של 10 s בפרוטוקול עקומת להמיס, לקבלת תוצאות אופטימליות.</li>
		<li>לאחר שווידאתי ישנם אמפליקון יחיד וערך הגברה טובה, תחילה לחץ על הכרטיסיה נתונים כימות בכדי לקבל מחזור כמותית (Ct/סי ערך) של כל דגימה, ייצוא ל- Microsoft Excel.</li>
		<li>בעזרת גיליון אלקטרוני, לחשב את הממוצע של כל דגימה באמצעות הערך Ct. לאחר מכן, לחץ על בנוסחאות ובחר את הממוצע. הערכים CT הממוצע של כל דגימה (שכפול) משמשים לצורך ניתוח נוסף.</li>
		<li>בשלב הבא, לחשב את ΔCt באמצעות ΔCt את הנוסחה = average Ct של הגן היעד - ממוצע של Ct של הגן בקרה (במקרה זה, ΔCt = average Ct של הגן ZIKV - ממוצע של Ct של הגן B2M).</li>
		<li>לחשב את ΔΔCt כדי לנרמל את הנתונים (במקרה זה, ΔΔCt = ΔCt ZIKV דגימות - B2M דגימות).</li>
		<li>לחשב את שהקיפול להגדיל את ביטוי גנים על-ידי הקלדת את 2^-(ΔΔCt) נוסחה עבור כל ערך יחיד ΔΔCt מנורמל. ניתן לקבל את התוצאות של העלייה קיפול כדי לבצע בדיקות סטטיסטיות כפי שמתואר מחקרים קודמת9,10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hayes, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outside+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus outside Africa.</a> Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).</li>
<li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+Gabon+%28Central+Africa%29+-+2007%3A+a+new+threat+from+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus in Gabon (Central Africa) - 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).</li>
<li>Fauci, A. S., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+in+the+Americas--Yet+Another+Arbovirus+Threat%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat.</a> New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).</li>
<li>Hawkes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+Infectivity+of+Arboviruses+by+Specific+Antisera+Produced+in+Domestic+Fowls%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Experimental+Biology+and+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls.</a> Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).</li>
<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).</li>
<li>Vaughn, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+viremia+titer%2C+antibody+response+pattern%2C+and+virus+serotype+correlate+with+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity.</a> The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).</li>
<li>Khandia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Dengue%2FZika+Virus+Pathogenicity+by+Antibody-Dependent+Enhancement+and+Strategies+to+Protect+Against+Enhancement+in+Zika+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection.</a> Frontiers of Immunology. 9, 597(2018).</li>
<li>Londono-Renteria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relevant+in+vitro+human+model+for+the+study+of+Zika+virus+antibody-dependent+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement.</a> Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).</li>
<li>Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+base+method+for+analysis+of+qPCR+data+and+the+application+of+simple+blocking+in+qPCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 534(2017).</li>
<li>Renn, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+real-time+RT-PCR+assay+for+determining+expression+profiles+of+types+I+and+III+interferon+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52650(2015).</li>
<li>McArthur, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+vaccines%3A+recent+developments%2C+ongoing+challenges+and+current+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates.</a> Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+cross-reactivity+between+Zika+and+dengue+viruses%3A+implications+for+protection+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology.</a> Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33(2017).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+antibody-mediated+neutralization+and+protection+against+flavivirus%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus.</a> IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+Zika+Virus+Envelope+Protein+and+Its+Complex+with+a+Flavivirus+Broadly+Protective+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody.</a> Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).</li>
<li>Sirohi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3.8+A+resolution+cryo-EM+structure+of+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus.</a> Science. 352 (6284), 467-470 (2016).</li>
<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+Exposure+to+Zika+Virus+Significantly+Enhances+Peak+Dengue-2+Viremia+in+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> Journal of General Virology. 71, Pt 12 2909-2914 (1990).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
<li>Charles, A. S., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+a+Dengue-Derived+Monoclonal+Antibody+to+Enhance+Zika+Infection+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Currents%22%5BJournal%5D)">Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro.</a> PLoS Currents. 8, (2016).</li>
<li>Swanstrom, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Virus+Envelope+Dimer+Epitope+Monoclonal+Antibodies+Isolated+from+Dengue+Patients+Are+Protective+against+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
</ol>

המחברים יש ריהצהל.

אשיג נוגדנים DENV שמוביל אייד של אחרים DENV אשר נגרמו מהזנים אליהם יש הפריע הפיתוח של חיסון יעיל11. ZIKV שייך למשפחת אותו, Flaviviridae, ויש הומולוגיה ניכר עם flaviviruses אחרים, במיוחד DENV12. המטרה העיקרית של נטרול נוגדנים הן ZIKV והן DENV הוא חלבון מעטפת, אשר חולקת הומולוגיה של רצף רבעוני מבניים גבוהה מאוד בין שני וירוסים13,14,15. זה הוכח, כי חסינות מראש או DENV או ZIKV יכול לשפ...

בין בעקיצות יתושים מחלות ויראליות, Zika זיהום הוא אחד החשובים ביותר קלינית1. הזיהום נגרם על ידי flavivirus ZIKV אשר, ברוב המקרים, משתמש Aedes aegypti כמו וקטור העיקרי שלה,1,2. עם זאת, ישנם מחקרים דיווחו אדס כמו וקטור העיקרי כמה התפרצויות ZIKV3. למרות הזיהום אסימפטומטיים במקרים רבים, התסמינים השכיחים ביותר הם חום גבוה, כאב ראש, כאב שרירים2. יש שום תרופה או חיסון זמין עבור זיהום ZIKV, הטיפול זמין בעיקר הוא תומך. התפרצויות שאירעו של ZIKV בדרום אמריקה הובילה במקרים חמורים של המחלה ועלייה הפרעות התפתחותיות ההתעסקות בשם microcephaly2כ 20-fold. כמו בדרום אמריקה הוא אזור אנדמי ל arboviruses מספר כגון DENV וירוס הנילוס המערבי, זה הכרחי לחקור אם חסינות מוקדמת flavivirus(es) אחרים משחק תפקיד חומרת ZIKV זיהומים ומחלות.
לאורך כל הדורות, וירוסים התפתחו אסטרטגיות שונות כדי להגדיל את הסיכוי של infectivity על מנת להשתלט על המנגנון התא המארח, לדכא את התגובה אנטי-ויראלי. אחד המרתקים ביותר מכל הוא השימוש של המארח נוגדנים מראש המערכת החיסונית על ידי וירוסים כדי לשפר את שכפול שלהם עם התופעה אייד4. אייד על פני כל ארבעת אשר נגרמו מהזנים אליהם של DENV כבר למד היטב והפגינו להגדלת titers נגיפי המחלה התוצאה5,6,7. במחקר במבחנה הקודם, אנחנו הראו שיפור משמעותי של שכפול ZIKV עקב הקיימים מראש DENV חסינות ראשי תאים חיסוניים האנושי8. אנחנו גם הפגינו שיטה במבחנה הרלוונטיים כדי לכמת את היכולת של DENV קיימים נוגדנים כדי לשפר את שכפול ZIKV בתאים הראשי.
פרוטוקול זה פיתחנו משתמש בנסיוב אדם והמדגמים נבדקים על נטרול DENV TCID-50 או מבחני הבדיקה ניטרול הפחתת פלאק (PRNT), יחד עם ZIKV תאים רלוונטי מבחינה ביולוגית או תאים שמקורם ברקמות ZIKV שיכולים להדביק.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>תאומים</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>מחזורים&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>785BR02188</td><td>מספר דגם מודול אופטיקה CFX96</td></tr><tr><td>מיקרופוגה 18 צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר&nbsp;</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop-1000</td><td>Thermoscientific&nbsp;</td><td>1072</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Quantifast SYBR-צעד אחד RT-PCR&nbsp;</td><td>קיאגן&nbsp;</td><td>204154</td><td>משמש לערכת בידוד RNA RNeasy RT-qPCR שלב אחד</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>קיאגן&nbsp;</td><td>74106</td><td>משמש למיצוי RNA</td></tr><tr><td>RPMI-בינוני&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף zika בתאי אדם ראשי

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

הופעתה האחרונה של flavivirus Zika וסיבוכים נוירולוגיות, כגון תסמונת גיליאן, microcephaly אצל תינוקות, הביא חששות בטיחות הציבור רציני. בין גורמי הסיכון, נוגדנים תלויי שיפור (איד) מהווה את האיום המשמעותי ביותר, כמו הופעתה האחרונה של הנגיף Zika (ZIKV) הוא בעיקר באזורים נחשף ואיפה נמצא במצב של טרום חסינות אחרים הקשורים קשר הדוק האוכלוסייה flaviviruses, וירוס דנגה במיוחד (DENV). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לכימות תנועת השפעת הנוגדנים בנסיוב אדם נגד DENV על זיהום ZIKV ראשי תאים אנושיים או שורות תאים.

איור 1, יש דוגמה diagrammatic שלב אחר שלב של כל השלבים המעורבים לבצע את פרוטוקול אייד. . זה תרשים סכימטי. מראה כל הליך איד של ZIKV עקב החסינות קיימת מראש DENV. איור 2 מציג בנסיוב אדם כמה דוגמאות היו מקוטלגים לשלוש קבוצות שונות: DENV אישר זיהום דגימות מכונים הקבוצה נגועה DENV, DENV נוגדן-אישר הדגימות לייב הקבוצה חשופים DENV, וגם בריא סרה יחידים ללא נוגדנים DENV-נטרול או RNA נקראות קבוצת הביקורת בריא (HC). (איו...

אנו מתארים שיטה להעריך את ההשפעה של הקיימת מראש חסינות מפני וירוס דנגה על זיהום בנגיף Zika באמצעות בנסיוב אדם ראשי תאים אנושיים, כימות זיהום על ידי תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את ההשפעות של חסינות קיימת מראש נגד וירוס דנגי על זיהום וירוס זיקה, באמצעות סרום החולה האנושי בפועל ותאי החיסון האנושיים העיקריים. השימוש בדגימות סרום אנושיות בפועל ותאים ראשוניים אנושיים מספק תובנה עמוקה יותר לגבי השיפור תלוי הנוגדנים של נגיף זיקה על ידי סרה טרום חיסונית ונוגדנים. שיטה זו מספקת תובנה על היכולת של נוגדנים בתוך הדם של המטופל כדי לשפר את זיהום וירוס בתאים אנושיים אחרים.חשוב להבטיח כי רמות הזיהום הנגיפי גבוהות מספיק לגילוי אך נמוכות מספיק כדי לא להציף את התאים או להפריע לפרשנות הנתונים. התחל על ידי זריעת שלוש פעמים עשר לתאים הרביעיים ב 100 microliters של מדיום תאים ל הבאר בסטרילי, שטוח התחתון 96-well צלחת. כאשר כל התאים כבר מצופים, מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור ולעשות 10 דילול סדרתי פי 10 של דגימות סרום אנושי מופשר במדיום ללא סרום.הקפד לשמור על דילול הסרום וגורם הדילול קבוע עבור כל הסרומים הטרום חיסוניים לפני הוספת הדילול לפתרונות הנגיף ולתאים. לאחר מכן, להפשיר זיקה וירוס זני פתרון מלאי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 דקות לפני במהירות להעביר את המניה לקרח. הוסף 0.1 ריבוי של נפח זיהום שווה ערך של וירוס זיקה אל aliquots סרום ולמקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שעה אחת כדי לאפשר נוגדנים וירוס דנגי ליצור קומפלקסים עם נגיף זיקה.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם 100 microliters של PBS לגם ולהוסיף 50 microliters של קומפלקס המערכת החיסונית לכל באר. לאחר הדגירה של שעתיים, להסיר את המדיום ולשטוף את בארות פעמיים עם 100 microliters של PBS לגם כדי להסיר לחלוטין את העורקים החיסונית ואת כל virions מחובר. לאחר מכן להאכיל את התאים עם 100 microliters ל הבאר של תא תרבות בינוני בתוספת 10% נסיוב חזיר עוברי.ואז להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך 48 שעות. יומיים לאחר הזיהום, לשטוף את התאים פעמיים עם 100 microliters של PBS סטרילי ל הבאר לפני הוספת 250 microliters של מאגר תות תא עם 10%beta mercaptoethanol לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים עם גירוד כדי להאיץ את תהליך תיזה ולהעביר את lysates התא סטרילי שכותרתו 1.5 צינורות מיליליטר.הוסף נפח שווה של 70%אתנול לכל צינור ו pipette פתרון lysate למעלה ולמטה ארבע עד חמש פעמים. כאשר המתלים lysate ברורים, להעביר כל פתרון לטורים מבוססי סיליקה שכותרתו בשני צינורות איסוף מיליליטר עבור צנטריפוגה. השלך את הזרימה דרך שמירה על העמודים באותם צינורות איסוף ולהוסיף 700 microliters של שטיפת Buffer 1 לכל עמודה עבור צנטריפוגה שנייה.לאחר השלכת הזרימה דרך, לשטוף את העמודים פעמיים נוספות עם 500 microliters של שטיפת Buffer שתיים לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מעבירים את העמודים לצינורות איסוף חדשים של שני מיליליטר לצנטריפוגה נוספת. הוסף 30 microliters של 42 מעלות צלזיוס RNase ללא מים למרכז של כל עמודה עבור צנטריפוגה לשחזר את RNA אלוט.לתגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת או ניתוח QRTPCR להוסיף מיקרוליטר אחד של פריימרים גנים ספציפיים קדימה ואחורי מ 10 מניות micromolar יחד עם 0.25 microliters של תערובת תעתיק הפוך לכל תגובה. שים לב כי פריימרים המזהים חומר גנטי וירוס זיקה יזהו גנים ויראליים ולאפשר כימות זיהום. לאחר מכן, להוסיף 12.5 microliters של תערובת ירוקה SYBR ואחריו 25 microliters של מים לכל תגובה הוספת 15 microliters של מאסטר לערבב בכל באר של צלחת QPCR 96-well.בעת שימוש בתערובת מאסטר, להוסיף 100 ננוגרם של מדגם RNA לתערובת פיפטה לערבב מאסטר לתוך בארות בודדות של צלחת QRTPCR. שים לב שיש להפעיל דגימות ב- triplicate על אותו לוח QRTPCR. לאחר מכן הפעל את הדגימות במחשב PCR כמותי בהתאם לפרמטרים המתוארים בטבלה.לחיצה על לשונית עקומת ההמסה בתוכנת המערכת כדי לפקח על עקומת ההמסה. עקומת ההמסה תראה שיא אחד בכל הדגימות לגן מסוים כדי לאשר את נוכחותו של אמפיקון אחד בלבד. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש במרווחי טמפרטורה של 0.5 מעלות צלזיוס בין השלבים ותזמן החזקה מינימלי של 10 שניות בפרוטוקול עקומת ההמסה.לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה נתוני כימות כדי לקבל מחזור כמותי עבור כל דוגמה ולייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח כימות נוסף. ניתן לסווג את דגימות הסרום האנושי לשלוש קבוצות שונות: דגימות מאושרות של זיהום נגיף דנגי, דגימות מאושרות של נוגדנים לנגיף דנגי, וסרה בריאה ללא וירוס דנגי המנטרל נוגדנים או רנ"א. לאחר 48 שעות של זיהום, ניתוח QRTPCR מדגים כי רוב sera המכיל סרוטיפ וירוס דנגי אחד עד ארבעה נוגדנים מסוגלים לשפר את שכפול וירוס זיקה ברמות שונות.העלייה הגבוהה ביותר של ציטרים וירוס זיקה נמצא מקרופאגים שטופלו סרוטיפ וירוס דנגי המכיל סרה שניים וארבעה נוגדנים לעומת סרוטיפ אחד ושלוש אשר מראים אינדוקציה נמוכה יחסית של וירוס זיקה. חשוב לשמור על סביבה סטרילית, ללבוש את ציוד ההגנה האישי הנכון, ותמיד לשמור את דגימות סרום הנגיף המופשרות ואת רייגנטים QPCR על קרח. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות שונה כדי לחקור שיפור תלוי נוגדנים של flavivirus אחרים כגון וירוס קדחת צהובה, וירוס דנגי, או וירוס הנילוס המערבי באמצעות פאנל של סרום החולה.טכניקה זו תהיה שימושית מאוד לביצוע מחקרי שיפור תלויי נוגדנים עתידיים בתחומי ארבווירוס או וירולוגיה. יש להשתמש בכל עת בציוד הגנה אישי ברמה ביו-בטיחותית נכונה, ויש לפענח את כל הפסולת הנגיפית ב-10% אקונומיקה למשך 30 דקות לפני ההשלכה.

quantification-antibody-dependent-enhancement-zika-virus-primary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת שיפור תלוי נוגדנים (ADE) של זיהום בנגיף דנגי באמצעות סרום החלמה של נגיף זיקה. הבדיקה משתמשת בחלקיקים נגיפיים של כתב דנגי (RVPs) המקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק. נוגדנים בסרום נגד נגיף הזיקה מגיבים בהצלבה עם RVPs ליצירת קומפלקס. הנוגדנים הקשורים מגבירים את ספיגת RVP על ידי תאים המבטאים את קולטן Fc, אשר מזוהה באמצעות ציטומטריית זרימה.

בדיקה חוץ גופית לבחינת שיפור תלוי נוגדנים של זיהום ויראלי

הסרטון מדגים בדיקת מבחנה לבדיקת אינטרפרונים בעלי פעילות אנטי-ויראלית נגד נגיף הזיקה, פתוגן אנושי. בתוך התא המארח, נגיף הזיקה עובר הכפלה עם הפנמתו, מדביק תאים שכנים ויוצר אזורים מובחנים או רבדים נגיפיים. אינטרפרון מסוג I, הפועל כסוכן אנטי-ויראלי, מעכב את הכפלת הנגיף, ובכך מונע היווצרות של פלאקים נגיפיים בתא המארח monolayer.

בדיקת מבחנה לבדיקת אינטרפרונים כמעכבים חזקים של צמיחת נגיף זיקה

סרטון זה מדגים הליך להדבקת תאי גזע עצביים עובריים אנושיים בנגיף זיקה. התאים הנגועים יכולים לשמש למחקרים נוספים.

זיהום בנגיף הזיקה של תאי גזע עצביים עובריים

Zika Virus (ZIKV), פתוגן מתפתח, קשור להפרעות התפתחותיות בעובר ולמיקרוצפליה. הקמת מערכת תרבית תאים זיהומית יעילה היא חיונית למחקרים על שכפול ZIKV כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות. במחקר זה מומחשות ונדונות בדיקות וירולוגיות שונות הנוגעות לזיק"ו.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

פרוטוקול זה מתאר את ההתאוששות של וירוס זיהום זיהומיות משני שיבוט cDNA שני פלסמיד זיהומיות.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקל למדידת שיפור התלויים נוגדנים לזיהום על ידי Zika וירוס הבראה בנסיוב באמצעות וירוס דנגה כתב נגיפים.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

פרוטוקול להעריך תגובות תא T אנטיגן ספציפי באיברים immunoprivileged של Ifnar1- / - מאתר מודל עבור זיהום בנגיף (ZIKV) Zika מתואר. בשיטה זו הוא מרכזי בשביל לחקור את המנגנונים התאיים של ההגנה, השיגה חיסונים ZIKV, והוא גם יקר להערכת היעילות שלהם.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

המטרה של הפרוטוקול היא להדגים את הטכניקות המשמשות לחקירת מחלה נגיפית על ידי בידוד וכימות וירוס Zika, מאיברים מרובים בעכבר לאחר ההדבקה.

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התפשטות נגיף הזיקה (ZIKV) בתאי כליות של קוף ירוק אפריקאי ורו ואת הכימות של ZIKV באמצעות שיטות זיהוי חיסוני קולורימטרי מבוססות תאים בפורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה).

התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

כאן, אנו מדגימים את השימוש בעכבה חשמלית מבוססת תאים (CEI) כשיטה קלה ופשוטה מאוד לחקר זיהום ושכפול נגיף זיקה בתאים אנושיים בזמן אמת. יתר על כן, בדיקת CEI שימושית להערכת תרכובות אנטי-ויראליות.

פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

חקור את השפעת החסינות הקיימת לנגיף דנגה על זיהום נגיף הזיקה בתאי חיסון אנושיים ראשוניים באמצעות PCR בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת הערכת שיפור תלוי נוגדנים ומספקת תובנות לפיתוח חיסונים.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

גלה סרטונים נוספים