צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

שיטה זו צריכה לעניין חוקרים המנסים לבודד קומפלקסים של חלבוני RNA ולזהות את הרכבם על ידי ספקטרומטריית מסה. אנו מאמינים שהפרוטוקול שלנו יהיה שימושי במיוחד לטיהור קומפלקסים הקיימים בתאים בכמויות מוגבלות ונוטים להתנתק במהלך הליכי טיהור רב שלובים ארוכים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא כרוכה רק בשלב טיהור אחד ו ניתן להשתמש בה עם אתרי איגוד RNA בכל אורך ורצף.

הדגמת חלק מהצעדים תהיה שיאו-קוי יאנג, שהיא טכנאית מחקר בכירה בקבוצה שלנו. עבור אתרי איגוד ארוכים משמעותית מ- 65 נוקלאוטידים, השג את ה- RNA שנוצר T7 ואת אוליגונוקלאוטיד PCB מתאם כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מערבבים 20 picomoles של RNA עם 100 picomoles של אוליגונוקלאוטיד מתאם בצינור 1.5 מיליליטר המכיל 100 microliters של חיץ מחייב.

מניחים את הצינור במים רותחים ולתת לו דגירה במשך 5 דקות. ואז לאפשר למים להתקרר לטמפרטורת החדר. תוספת ראשונה 1 מיליליטר של תמצית גרעינית העכבר עם 80 מילימולר EDTA ב pH 8 לריכוז הסופי של 10 מילימולר.

לאחר מכן להוסיף בין 5 ל 10 picomoles של מצע RNA כי כבר מתויג עם מויטי PCB. דגירה על קרח במשך 5 דקות, הקפדה מדי פעם לערבב את המדגם. לאחר מכן השתמש microcentrifuge מקורר מראש ב 4 מעלות צלזיוס כדי צנטריפוגה את התערובת ב 10, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות כדי להסיר את כל המשקעים הפוטנציאליים.

בזהירות לאסוף את supernatant לתוך צינור חדש על הקרח, תוך הקפדה על הימנעות העברת גלולה. להעביר כ 100 microliters של השעיית חרוזים agarose סטרפטבידין לצינור 1.5 מיליליטר. הוסף כ 1 מיליליטר של חיץ מחייב כדי להתחיל לשטוף את חרוזים.

צנטריפוגה הצינור ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות ושואפים את supernatant. חזור על תהליך כביסה וצנטריפוגה זה 2 עד 3 פעמים כדי לצייד את חרוזים עם מאגר הכריכה. טען את העל-טבעי שנאסף בעבר, המכיל את המתחם המורכב מעל חרוזים שצוידים.

באמצעות מסובב צינור, לסובב את הצינור במשך 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס כדי לשתק את RNA ומתחמים כבולים על חרוזים. הבא לסובב את הצינור ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות כדי לאסוף את חרוזים בתחתית הצינור. שאף את העל-טבעי.

ולשטוף את חרוזים פעמיים עם חיץ מחייב, באמצעות תהליך הכביסה שתואר קודם לכן. לאחר הסרת supernatant של לשטוף השני, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ מחייב לסובב את המדגם במשך 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס. לסובב את המדגם ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות.

הבא להוסיף 1 מיליליטר של חיץ מחייב ולהעביר את ההשעיה לצינור חדש. סובבו את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס עד שעה. צנטריפוגה המתחמים משותקים ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות.

לאחר מכן שאפו על-טבעי, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר מחייב. מעבירים את חרוזים לצינור 500 microliter. הפעל מנורת UV בעוצמה גבוהה הפולגת אור UV ב-365 ננומטר ומאפשרת לו להגיע לגאונות מלאה.

ממלאים את החלק התחתון של צלחת פטרי עם קרח ארוז היטב לערום אותו על המכסה של המנה. בקצרה מערבולת הצינור המכיל את מתחמים משותקים. לאחר מכן מניחים אותו אופקית על הקרח ומכסים אותו עם המנורה מחוממת מראש, לוודא כי המדגם הוא 2 עד 3 ס"מ מפני השטח של הנורה.

הקרין את המדגם במשך 30 דקות בסך הכל תוך היפוך ומערבולת לעתים קרובות של הצינור כדי להבטיח חשיפה אחידה ולמנוע התחממות יתר. לאחר מכן, לסובב את חרוזים ב 25 פעמים g במשך 2 עד 3 דקות ולאסוף את העל טבעי. צנטריפוגה זה על טבעי שוב באמצעות אותם תנאים.

לאסוף את supernatant וכתוצאה מכך הקפד להשאיר כמות קטנה בתחתית הצינור, כדי למנוע העברת כל חרוזים שיורית. באמצעות אלקטרופורזה SDS-PAGE, להפריד שבריר של על טבעי UV eluted ואת השבר המתאים מהחומר שנותר על חרוזים לאחר אלוטיון UV. לאחר מכן השתמש בערכת כתמי כסף זמינה מסחרית כדי להכתים את הג'ל.

להעריך את היעילות של אלוטיון UV על ידי השוואת התעצמות של החלבונים הקיימים UV אלנטנט ואלו שנותרו על חרוזים לאחר הקרנת UV. יש למלמל את רצועות החלבון המעוניינות ולקבוע את זהותן לפי ספקטרומטריית מסה. לאחר מכן, לנתח ישירות שבריר של UV מרומם על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לקבוע את הפרוטומה כולה של החומר המטוהר באופן משוחד.

במחקר זה, לולאת גזע RNA מתויג עם ביוטין photo-cleavable הוא דגירה עם 1 מיליליטר של תמצית S100 ציטופלסמי המתקבל תאים מיאלומה עכברים. ואת ההשפעה והיעילות של אלוטיון UV מנותח על ידי כתמי כסף. מספר חלבונים מזוהים על חרוזי סטרפטבידין לפני אלוטיון UV.

הקרנה עם UV גל ארוך משחרר רק חלק חלבונים אלה לתוך על טבעי משאיר רקע לא ספציפי על חרוזים. זה מדגיש את החשיבות של צעד אלוטיון UV. ספקטרומטריית מסה מזהה את החלבונים הגדולים UV eluted כמו 3'hExo ו SLBP עם SLBP להיות מיוצג על ידי חלבון באורך מלא ומספר מוצרים השפלה קצר יותר.

כמויות קטנות יותר של חלבונים אחרים שזוהו כחלבונים קשירה RNA שונים גם שוחרר באופן סלקטיבי לפתרון על ידי הקרנת UV. אלוטציה UV של דרוסופילה משותקת היסטון טרום mRNA מתויג עם ביוטין photo-cleavable דגירה עם תמצית גרעינית הביא לשחרור סלקטיבי של רק מספר קטן של חלבונים לתוך supernatant עם רקע אינטנסיבי של חלבונים לא ספציפיים שנותרו על החרוזים. ספקטרומטריית מסה מזהה חלבונים אלה להיות רכיבים של U7 snRNP.

הם אינם מזוהים בנוכחות מתחרים עיבוד לחסום איגוד של U7 snRNP כדי histone pre-mRNA. חשוב להשתמש במנורת UV בעוצמה גבוהה ולמקום אותה במרחק קרוב לדגימה מוקרנת וגם לוודא שהיא לא התחממות יתר. שיטת אלוטיון UV מניבה קומפלקסים מקוריים של חלבוני RNA חסרי מזהמים עיקריים ומתאימים ישירות לצעדי טיהור נוספים ולתהלומות תפקודיות.

יש להימנע מחשיפה לעיניים ולעור במהלך הקרנת UV.