Name: וזמינותו תחבורה אופסין רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: למדו שיטת הדמיה בעלת תוכן גבוה לכימות תחבורת מוטציות רודופסין הקשורות לרטיניטיס פיגמנטוזה. השיטה מאפשרת סקרינג בקיבולת גבוהה והערכה מהירה של תרופות פוטנציאליות לטיפול במחלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר מארק אי Schurdak, גילוי תרופות אוניברסיטת פיטסבורג מכון למתן imager גבוהה-תוכן והדרכה ראשונית. ד ר קז'ישטוף Palczewski (Case Western Reserve University) משותף בנדיבות את 4 1D ונוגדנים אנטי אופסין # רודופסין B630. פלסמיד המכיל את cDNA של העכבר אופסין # רודופסין-ונוס לבנות היה משותף על ידי ד ר נבין למברט (אוניברסיטת Augusta). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של בריאות גרנט EY024992 שיקו לוי, P30EY008098 של אוניברסיטת פיטסבורג החזון לחקר הליבה גרנט.

הערה: אופסין # רודופסין תחבורה וזמינותו.
1. הכנה של התרבות תאים
<ol><li>להחיות את השמורה הקפאה U2OS יציב תאים המבטאים את סוג בר (WT) או בעכבר מוטנט אופסין # רודופסין-ונוס פיוז'ן חלבונים. להפשיר את התאים ב 37 ° C עד רק גבישי קרח קטנים הם עזבו בבקבוקון. הערה: התאים U2OS נמצאים בשימוש פרוטוקול זה כי שם אין תור תא קולט אור זמין עבור מחקרים במבחנה , ביוסינטזה ciliary מראש של אופסין # רודופסין מוסדר על ידי המנגנונים המולקולריים דומה בתאי יונקים. בנוסף, התאים U2OS לצרף בחוזקה בתחתית הלוח, ויש גופים תא גדול, אז הם אידיאליים עבור וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין. שבע U2OS יציב תאים המבטאים את WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N ו- P267L מוטציות אופסין # רודופסין משמשים כאן כדוגמה להראות את האיכות והאמינות של וזמינותו. תאים יציב מוטאנטים אחרים אופסין # רודופסין או חלבונים אחרים קרום יכול לשמש, בהתאם למטרה של וזמינותו. יציב התאים לבטא אופסין # רודופסין האנושי יכול לשמש assay הזה אם הוא זמין. אופסין # רודופסין העכבר שימש כאן כי העכבר וחלבונים אופסין # רודופסין האנושי לחלוק הומולוגיה 95%, וכן תרכובות המזוהה על-ידי assay הזה יהיה שנבדקו אין ויוו באמצעות מודל adRP של העכבר נושא את המוטציה P23H8אופסין # רודופסין. התאים יציבה נוצרו כפי שתואר לעיל19. WT של מוטציה אופסין # רודופסין התמלילים היו לכמת על ידי q-PCR, השיבוטים של תאים יציב לבטא רמות דומות של WT וגיליון הציונים מוטציה אופסין # רודופסין נבחרו עבור זה וזמינותו. הביטוי של חלבונים אופסין # רודופסין אושר ע י immunoblot ו- immunostaining. המעבר של תאים המשמשים assay הזה צריך להיות נמוך מ- 20.</li>
	<li>העברת כל שורה של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום הגידול (של גלוקוז גבוהות Dulbecco שונה של הנשר בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 5 µg/mL Plasmocin).</li>
	<li>Centrifuge הצינור ב 200 x גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא עם 5 מ של התא מדיום הגידול עבור כל קו תא. העברת כל שורה של השעיה תא לתוך תבשיל תרביות רקמה 60 מ מ, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>תת-תרבות התאים כאשר המנה תרביות רקמה מגיע למפגש 90% כפי שמתואר הפניה12.</li>
</ol>2. זריעת תאים-תאים 5,000 לכל טוב
הערה: בצע את ההליכים הבאים בשכונה תרביות רקמה.
<ol><li>פנקו את הצלחת עם פולי-ליזין.<ol>
<li>יום אחד לפני זריעת תאי, מתייחסים שחור-קיר ונקה את הצלחת התחתונה 384-טוב עם µL 20/טוב של פולי-ליזין פתרון במשך 30 דקות.</li>
		<li>וארוקן את הנוזל, לאפשר כל בארות להתייבש במשך ה 1 להחזיר את המכסה צלחת ולאחסן את הצלחת ב 4 ° C בלילה עבור תא זריעה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את התליה תא.<ol>
<li>תרבות כל שורה תא במדיום הגידול בצלחת תרביות רקמה 100 מ מ עד 90% הנהרות.</li>
		<li>לשטוף כל מנה עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ולנתק את התאים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין ב 37 º C.</li>
		<li>Resuspend כל שורה של תאים ב- 10 מ"ל assay בינוני (DMEM high-גלוקוז 10% FBS, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/מ ל).</li>
		<li>לספור את התאים, לדלל כל שורת התאים עד 1.25 x 105 תאים למ"ל עם המדיום וזמינותו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הזרע התאים.<ol>
<li>להשתמש על פיפטה רב-ערוצי אלקטרונית או מתקן מגיב אוטומטית כדי לוותר על µL 40/טוב של התליה תא כדי שלוש עמודות לכל תא קו ומילוי עמודות 1-21 של צלחת 384-טוב (איור 2).</li>
		<li>להוסיף µL 40/טוב של U2OS (P23H-אופסין # רודופסין-ונוס) עמודים 22-23, µL 40/טוב של U2OS (אופסין # רודופסין-ונוס) לעמודה 24, כפי שולטת.</li>
		<li>Centrifuge את הצלחת ב x 300 גרם ל 30 s כדי להפיל את כל התאים לחלק התחתון של הלוח 384-. טוב. הערה: למנוע זעזועים פיזיים לצלחת לאחר תא זריעה. אחרת, התאים תימחץ בפינה אחת של כל טוב, הצלחת לא יהיה מתאים עבור הדמיה גבוהה-תוכן.</li>
		<li>דגירה לצלחת 384-ובכן ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור h 3 עבור התאים לצרף תחתית הצלחת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. טיפול תאי עם תרכובות
<ol><li>צור מפת צלחת עם תנאי הטיפול כפי שמוצג באיור2.</li>
	<li>להכין µL 300 של 5 x פתרונות עבודה של עד 15 תרכובות בצלחת 96-ובכן.<ol>
<li>לדלל cps 1 עד 15 עם המדיום assay כדי חמש פעמים של ריכוזים הסופי שלהם בבארות A1 ל G2 של 96-ובכן צלחת (איור 2 א). להוסיף 300 µL assay בינוני באזור H2 היטב. הערה: הריכוז הסופי של כל המתחם משמש-הריכוז היעיל ביותר שהצלת הובלת אופסין # רודופסין P23H12,HTS13.</li>
		<li>להוסיף µL 100 לכל טוב של 2% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ו- 25 מיקרומטר 9 -cis-רשתית כי הם מעורבבת עם המדיום assay לעמודות 11 ו- 12, בהתאמה. להוסיף 9 -cis-רשתית באור עמום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוספת µL 10 לכל טוב של 5 x עובד פתרונות לצלחת 384-ובכן תרבותי עם תאי (איור 2B).<ol>
<li>להשתמש על פיפטה רב ערוצית אלקטרונית כדי להוסיף תרכובות 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ו- 15 שורות A, C, E, G, אני, K, M ו- O מעמודות 1 עד 21 (איור 2). להוסיף תרכובות 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ו- M שורות B, D, F, H, J, L, N ו- P מעמודות 1 עד 21.</li>
		<li>להוסיף 10 µL לכל טוב של 2% דימתיל סולפוקסיד עמודות 22 ו-24. להוסיף 10 µL לכל טוב של מיקרומטר 25 9 -cis-רשתית לעמודה 23. הערה: דימתיל סולפוקסיד משמש כפקד הרכב כי כל תרכובות הם בתחילה מומס דימתיל סולפוקסיד מניות. טור 22 המכיל תאים דימתיל סולפוקסיד מטופלים לבטא את P23H אופסין # רודופסין משמש את הפקד 0%. 9 -Cis-תאים ברשתית שטופלו לבטא את אופסין # רודופסין P23H משמש את הפקד 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מכסה את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
</ol>4. Immunostaining ללא קרום Permeabilization כתם אופסין # רודופסין החלבון על פני התא.
הערה: להימנע חומרי ניקוי בתהליך כולו immunostaining לשמור על קרום התא ללא פגע.
<ol><li>להכין 4% paraformaldehyde (PFA) על ידי דילול של 16% מחברים עם PBS על יחס נפח של 1:4 בשכונה fume כימי. העברה של % 4 מחברים מאגר מגיב.</li>
	<li>להוציא לצלחת 384-ובכן בחדר חשוך עם האור האדום העמום. שימוש ערוץ 8 ליניקת מחובר בקבוק ואקום אוסף לרוקן בעדינות את המדיום. להשתמש על פיפטה רב-ערוצי אלקטרונית כדי להוסיף µL 20 לכל טוב של טריות 4% PFA לצלחת 384-ובכן כולו דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי למנוע ניתוק התא, תמיד הצבע קצות העצמות באותו הצד של כל טוב במהלך שאיפות. אל תגעו האזור התחתון האמצעי של כל טוב. בעת לקיחת תמונות, בחר את השדות כדי למנוע את האזור נגע העצמות. עבור incubations יותר מ- 10 דקות, לכסות את הצלחת 384-ובכן עם המכסה שלה כדי למנוע התאיידות. הערה: תאים קבועים בחדר חשוך כדי להימנע photobleaching של isorhodopsin regenerated ישפיעו על התוצאה של פקד ה-100%. לאחר קיבוע, ניתן לקחת את הצלחת. ובכן 384 תאורה רגילה.</li>
	<li>השתמש העצמות של ערוץ 8 וארוקן את כדורגלן היטב כל ולהשתמש על פיפטה רב ערוצית אלקטרונית כדי להוסיף μL 50 לכל טוב של PBS. חזור עוד פעמיים כדי לבצע שלושה שוטף עם PBS. התראה: הפסולת PFA המכיל נוזל נאספים בבקבוק רצ'ט, היא להיות מסולק כפסולת כימיים מסוכנים לאחר הניסוי.</li>
	<li>לחסום את התאים על-ידי הוספת µL 20 לכל טוב של סרום עיזים 5% הצלחת 384-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	<li>וארוקן את הנסיוב עיזים 5% ולהוסיף µL 15 לכל טוב של 20 µg מ ל-1 B6-30 נוגדן אנטי אופסין # רודופסין בנסיוב עז 1% שורות A או להוסיף 15 µL לכל טוב של 1% נסיוב עז שורה P עבור קבוצת הביקורת נוגדן בלבד משני.</li>
	<li>דגירה את הצלחת 384-ובכן בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מכסים את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של fluorophores.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 50 µL לכל טוב של PBS.</li>
	<li>האחות PBS ולהוסיף µL 15 לכל טוב של 5 µg מ ל-1 עז Cy3 מצומדת אנטי-העכבר IgG נוגדן. מכסה את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 h או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 50 µL לכל טוב של PBS. הוסף µL 50 לכל טוב של PBS המכיל 1 µg מ ל-1 Hoechst 33342 כתם גרעינים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
	<li>חותם את הצלחת 384-ובכן עם סרט שקוף לפני הדמיה. לכסות את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע, אם תמונות נלקחים באופן מיידי.</li>
</ol>5. הדמיה.
הערה: הליך הדמיה גבוהה-תוכן זה מותאם למערכת הדמיה המופיעים בטבלה של חומר. הליכים יכול להיות שונה אם באמצעות מערכות הדמיה אחרות גבוהה-תוכן.
<ol><li>הסר את המכסה, מכניסים את הצלחת 384-ובכן םלצה גבוהה-תוכן עם A1 ממוקם בפינה השמאלית העליונה של הצלחת.</li>
	<li>פתח את התוכנה רכישת התמונה כדי להגדיר את הפרמטרים עבור ייבוא תמונות.<ol>
<li>פתח חלון הגדרת רכישת צלחת, ליצור הגדרה חדשה או לטעון את קובץ ההתקנה קיים.</li>
		<li>בחר את המטרה 20 x והגדר להגדיר פיקסל binning כ- 2 כך גודל פיקסל מכוילת הוא 0.80 x 0.80 מיקרומטר. הקווים סריקה 2,000, את גודל התמונה (W x H) 1,000 x 1000 פיקסלים (800.00 x 800.00 מיקרומטר) לכל אתר.</li>
		<li>בחר את סוג הצלחת לדימות. השתמש במידע המסופקים על ידי היצרן של צלחת 384-טוב כדי למלא את הממדים צלחת.</li>
		<li>בחר הבארות לדימות עבור לוח 384-. טוב.</li>
		<li>בחר ארבעה אתרים לדימות לכל טוב. למנוע את הצד של נגע היטב על ידי העצות השאיפה.</li>
		<li>בחר עירור לייזרים 405, 488, 561 ננומטר. בחר פליטה מסננים עבור ערוצי דאפי, FITC ואדום טקסס. למטב את עוצמת הלייזר, רווחים של כל ערוץ כדי להבטיח את הבהירות של תמונות שנלקחו הבארות בקרה חיובית פחות לסף רוויה.</li>
		<li>בחר טוב-כדי-טוב מוקד פוקוס אוטומטי. בחר את הבאר הראשונה לרכוש כ הראשונית טוב למציאת דגימות. הגדר אתר פוקוס אוטומטי לכל האתרים.</li>
		<li>בחר 4 ממוצעים לכל שורה לכל ערוץ. למטב את ערך היסט ה-Z לכל ערוץ.</li>
		<li>מבחן 2-3 בארות בפינות אלכסוני של צלחת טוב 384 כדי לוודא שהתמונות הן על המוקד עבור כל בארות שנבדקו, תמונות מכל אתרי לכל טוב יש תאים עם יותר מ- 40% הנהרות, ועוצמות קרינה פלואורסצנטית של כל הערוצים כמחצית רוויים 100% לשלוט בארות.</li>
		<li>שמור את שיטת רכישת התמונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את הצלחת כולה. Watch םלצה עד שהוא מסיים לכידת תמונות מהעמודה הראשונה של צלחת לבדוק את איכות התמונה לפני שעזב םלצה. להוציא לצלחת 384-ובכן ולאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי. הערה: בהתאם למספר אתרים שנבחרו לפי טוב, הערוצים נלקח, אורכת 40 דקות 3 h לסיים הדמיה לוח 384-טוב אחד.</li>
</ol>6. תמונות ניתוח.
<ol><li>משוך החוצה את נתוני התמונה באמצעות תוכנת ניתוח גבוהה-תוכן התמונה. בחר באחת הבארות 100% שליטה (עמודה 23) כדי להגדיר את הפרמטרים.</li>
	<li>בחר את אורך הגל רב תא הבקיע כמו שיטת הניתוח ולהתחיל קביעת התצורה של הגדרות.<ol>
<li>הגדר את הגרעינים באמצעות תמונות מערוץ דאפי. הצג בתצוגה מקדימה כדי לוודא גרעין מוגדר הצורות בפריט הנבחר טוב משתלב היטב התמונות גרעינים.</li>
		<li>להגדיר את הצורה של התא בערוץ FITC איפה אופסין # רודופסין-ונוס עם תמונה.</li>
		<li>הגדרת האזורים הכתם פני שטח התא אופסין # רודופסין בערוץ טקסס אדום.</li>
		<li>בדיקת האלגוריתם הנוכחי בבארות 5 כדי לקבוע אם ההגדרות מיטביות. לשמור את ההגדרות ולסגור את החלון תצורה .</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את כל הבארות עם שיטת הניתוח ממוטבת.</li>
	<li>לייצא אובייקט מספר הנייד ללא פגע. לייצא את העוצמה הממוצעת של הערוץ FITC עוצמת אופסין # רודופסין-נוגה (ונוס אופסין # רודופסין-INT). לייצא בעוצמה ממוצעת של הערוץ האדום טקסס אופסין # רודופסין בעוצמה על פני התא (INT אופסין # רודופסין על פני התא).</li>
	<li>לפתוח את הנתונים המיוצאים תוכנת הגיליון האלקטרוני. מתחלק עוצמת אופסין # רודופסין על פני התא אופסין # רודופסין-ונוס INT כמו יחס MEM-כדי-סיכום. לחשב את Z'-גורמים לכל פרמטר להעריך את איכות וזמינותו. Z′ = 1−3X (STD100% שליטה+סטיית תקן0% שליטה) / | זאת אומרת100% שליטה−Mean0% שליטה|. הערה: Z'-מקדם גבוה יותר מאשר 0 מציין assay מתון מספיק עבור מסך גבוהה-תוכן, ו- Z' פקטור בטווח של 0.5 עד 1 מרמז על assay מצטיינים הדרושים עבור תפוקה גבוהה מסך20,21.</li>
	<li>להשתמש את תוכנת הגיליון האלקטרוני כדי ליצור מפת החום שני צבעים עבור כל פרמטר. לארגן את השם של שורות תאים בציר ה-x ואת תרכובות בציר ה-y.</li>
</ol>

<ol><li>Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Stenson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Gene+Mutation+Database%3A+towards+a+comprehensive+repository+of+inherited+mutation+data+for+medical+research%2C+genetic+diagnosis+and+next-generation+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies.</a> Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).</li>
<li>Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mutant+rhodopsins+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).</li>
<li>Athanasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+reveals+potential+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).</li>
<li>Chiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Endoplasmic+Reticulum-Associated+Degradation+of+Rhodopsin+Precedes+Retinal+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration.</a> Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).</li>
<li>Sakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+of+photoreceptor+degeneration+in+a+new+mouse+model+of+the+common+form+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+due+to+P23H+opsin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).</li>
<li>Dryja, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+rhodopsin+gene+in+patients+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).</li>
<li>Sohocki, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+mutations+causing+retinitis+pigmentosa+and+other+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies.</a> Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+chaperone+of+rod+opsin+and+its+potential+therapy+for+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration.</a> Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assays+to+identify+small+molecules+preventing+photoreceptor+degeneration+caused+by+the+rhodopsin+P23H+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation.</a> Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Drug+Screening+Strategy+for+Detecting+Rhodopsin+P23H+Mutant+Rescue+and+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).</li>
<li>Noorwez, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone-mediated+in+vivo+folding+and+stabilization+of+the+P23H-opsin+mutant+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).</li>
<li>Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+fate+of+mutant+rhodopsin%3A+quality+control%2C+degradation+and+aggresome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation.</a> Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).</li>
<li>Kaushal, S., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin.+7.+Point+mutations+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).</li>
<li>Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+NIH3T3+cell+lines+expressing+opsin+and+the+P23H+opsin+mutant+identifies+candidate+drugs+for+the+treatment+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa.</a> Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).</li>
<li>Adamus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-rhodopsin+monoclonal+antibodies+of+defined+specificity%3A+characterization+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application.</a> Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).</li>
<li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+mutations+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.+Clustering+of+functional+classes+along+the+polypeptide+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).</li>
<li>Krebs, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+and+the+efficacy+of+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

. הראנו assay הדמיה של high-תוכן המשמש אפיון בנפילות שאותרו מן HTS. אוטומציה היחידה מעורב פרוטוקולים אלה הוא הצלם גבוה-תוכן. Immunostaining ואת פלורסצנטיות הדמיה של אופסין # רודופסין היו בשימוש נפוץ לאפיין הלוקליזציה של אופסין # רודופסין5,14,15,16. עם זאת, כימות של תמונות שצולמו על ידי שיטות הדמיה מוגבל על ידי חוסר של תמונות תא מספיקות לכל מצב, קיבולת נמוכה של תמונות לכל ניסוי, ואת חוסר פרמטר ב...

חלבון misfolding מעורב ב ניוון שרירים, degenerations עצבית, כמו גם מחלות מסנוור, כולל רטיניטיס פיגמנטוזה (RP)1. RP היא תורשתית ומתקדמת ניוון הרשתית המשויך מוטציות בגנים מעל 60 המשפיעים על תפקוד על הומאוסטזיס של רוד photoreceptors או2,epitheliums פיגמנט הרשתית (RPEs)3. אין טיפול יעיל זמין כעת עבור RP. אופסין # רודופסין מוטציות בחשבון כ 25-30% אוטוזומלית דומיננטית (ad) מקרים RP. בין יותר מ-150 אופסין # רודופסין מוטציות4 (האדם גנים מוטציה מסד נתונים, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), מוטציות Class II לגרום לחוסר יציבות מבנית את החלבון אופסין # רודופסין תורם למוות קולט אור רוד, חזון הפסד5,6,7,8. P23H הוא המוטציה אופסין # רודופסין בתדירות הגבוהה ביותר בצפון אמריקה, שהוא גם דוגמה טיפוסית של9,10מוטציות אופסין # רודופסין Class II. עקב יציבות מבנית, הטבועה שלה אופסין # רודופסין misfolded שנצבר ב רשתית תוך-פלזמית (ER) בתאי יונקים, ואילו אופסין # רודופסין פראי סוג ממוקם על קרום פלזמה5. אופסין # רודופסין P23H המוצגים מוטציה דומיננטית שלילי cytotoxicity ואינו haploinsufficiency, אך קשורה את ההפעלה של ER misfolded קשורה חלבון השפלה מסלול וארגון החיצוני קטע קטע מוט. כדי להקל על מוט מתח התא קולט אור, אסטרטגיה אחת היא לייצב קיפול מקורית של מוטציה אופסין # רודופסין באמצעות מלווה תרופתי.
כדי להשיג מטרה זו, ביצענו עם מסך מבוססי תאים תפוקה גבוהה (HTSs)11,12,13 שימוש assay קומפלמנטציה פרגמנט β-galactosidase לכמת אופסין # רודופסין P23H המוטציה מועבר על מסך הפלזמה ממברנה. פרוטוקול פשוט ועמיד assay HTS זו אפשרה לנו לבחון את הפעילות של מולקולות קטנות בערך 79,000 על כל מסך. עם זאת, מכיוון assay HTS הזה קורא אותות הפריה חוץ גופית, תוצאות חיוביות שגויות, כולל את מעכבי β-גל, תרכובות בצבע או ציטוטוקסיות כלולים ברשימת החיסול מחכה להיות מזוהה על ידי assay המשני.
Immunostaining המסורתי של שיטות הדמיה פלורסצנטיות שימשו במשך שנים ללמוד התעבורה אופסין # רודופסין תאים בתרבית של5,14,15,16. עם זאת, השיטות המקובלת לא ניתן להשתמש כדי לכמת תרופתי אפקטים של יותר מ- 10 תרכובות לכיוון אופסין # רודופסין התחבורה כי ניתוח ההדמיה אמין דורש מספר רב של תמונות לפי תנאי מאוד עקבית, אשר לא amendable על ידי שיטות הדמיה קונבנציונלי. . הנה, פיתחנו פרוטוקול הדמיה של high-תוכן immunostaining מבוסס כמו assay המשני לכמת התעבורה פני שטח התא של אופסין # רודופסין misfolded מוטציות11,13,17. להוספת תווית אופסין # רודופסין על קרום פלזמה, דילגנו השלב של קרום התא permeabilization ו- immunostained המוטנטים אופסין # רודופסין מאת monoclonal (B6-30) נגד אופסין # רודופסין לזהות את epitope N-מסוף של אופסין # רודופסין לצד חוץ-תאי של התא 18. כדי להמחיש את המוטציות אופסין # רודופסין התא כולו, אנחנו התמזגו אופסין # רודופסין עם החלבון זריחה נוגה. מאת כימות של עוצמות קרינה פלואורסצנטית בערוצים שונים פלורסצנטיות, אנו מסוגלים לקבל פרמטרים מרובים מהניסוי בודד אחד, כולל עוצמת אופסין # רודופסין הכולל כל התא, על פני השטח של התא, ואת היחס של אופסין # רודופסין זריחה על פני התא לזה התא כולו. יישום שיטה זו יציב התאים לבטא סכום כולל של 6 misfolded אופסין # רודופסין מוטציות, אנחנו ניתן להפיק פרופיל תרופתי של משגיחים מרובים מולקולה קטנה לכיוון המוטנטים האלה. ב פרוטוקול זה, כל התאים immunostained בצלחת 384-. ובכן, עם תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית בתנאי הדמיה מאוד עקבי. ניתוח התמונה מתבצע כדי כל טוב, המכיל תמונות של יותר מ-600 תאים כדי להפחית וריאציה בשל הטרוגניות התאים עם משתנה צורת התא ורמת ביטוי חלבון. זרימת העבודה של פרוטוקול זה מסוכם באיור1. היתרון של שיטה זו הוא כי אנו משיגים תמונות ברזולוציה גבוהה, כמו גם פרמטר מרובה quantifications מניתוח המבוססת על תמונה. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות שונה ומוחלים לכמת את התעבורה של כל חלבון ממברנלי misfolded של עניין.

<table><tbody><tr><td>תאי U2OS (רודופסין-ונוס)</td><td>NA</td><td></td><td>NA תאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS</td></tr><tr><td>(T4R-rhodopsin-Venus) NA</td><td></td><td></td><td>תאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS</td></tr><tr><td>(P23H-rhodopsin-Venus) NA תאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS (P53R-rhodopsin-Venus)</td><td></td><td></td><td>תאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS</td></tr><tr><td>(P53R-rhodopsin-Venus) NA</td><td></td><td></td><td>תאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS</td></tr><tr><td>תאי U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) NA</td><td></td><td></td><td>NA תאים יציבים הנוצרים מתאי U2OS</td></tr><tr><td>(D190N-rhodopsin-Venus) NA</td><td></td><td></td><td>תאים יציבים הנוצרים מתאי U2OS</td></tr><tr><td>(P267L-rhodopsin-Venus) תאים</td><td></td><td></td><td>NA תאים יציבים הנוצרים מתאי U2OS</td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>עם L-גלוטמין, נתרן </td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי פירובט (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>פלסמוצין מומת בחום</td></tr><tr><td></td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>מגיב חיסול מיקופלזמה</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X תמיסות אנטיביוטיות מרוכזות למניעת זיהום חיידקים של תרביות תאים</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>0.25%, 1mM EDTA ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום</td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, מסונן סטרילי, BioReagent, מתאים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Microplates</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>384 בארות מיקרו-פלטות שטופלו בתרבית רקמות עם דפנות באר שחורות ותחתית אולפין מחזורית שקופה אופטית להדמיית תאים בניתוח</td></tr> <tr><td>תכולה גבוההצלחת סטרילית של 96 בארות</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>תרבית רקמות שטופלה בתחתית שטוחה של מכסה, סטרילית, ללא פירוגנים הניתנים לזיהוי, Rnase, DNase ו-DNA. לא ציטוטוקסי</td></tr><tr><td>פוספט בופר סאילין (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x PBS Buffer, pH 7.4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99.5%, נבדק תרבית תאים</td></tr><tr><td>9-cis-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>תרכובות נבדקו</td><td>Selleckchem/Life Chemicals/תרכובות NA מסונתזות בהתאמה אישית</td><td></td><td>נרכשו מ ספקים שונים או</td></tr><tr><td>נוגדן B6-30 אנטי-רודופסין</td> מסונתז בהתאמה אישית <td>Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>מתנה מד"ר קז'ישטוף פלצ'בסקי</td></tr><tr><td>Cy3-מצומד עז אנטי-עכבר נוגדן משני</td> Jackson <td>ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>28908</td><td>ללא מתנול</td></tr><tr><td>10% תרמו סרום עיזים רגיל</td><td> Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>מאגר חוסם</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>תמיסת צביעה גרעינית</td></tr><tr><td>הדמיה בעלת תוכן גבוה</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg; מערכת הדמיה מיקרו קונפוקלית בעלת תוכן גבוה</td></tr><tr><td>MetaXpress תוכנה לרכישה וניתוח של תמונות בתוכן גבוה</td><td></td><td>MetaXpress</td><td>תוכנה לרכישה וניתוח של תמונות בתוכן גבוה</td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית (0.5-10 ומיקרו; L)</td> <td>Rainin</td><td>17013802</td><td>פיפטה ידנית 8 ערוצים, 0.5-10 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>פיפטה רב ערוצית (0.5-10c</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>פיפטה ידנית 8 ערוצים, 20-200 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית אלקטרונית (10-200 &mu; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>פיפטה מולטי-צ'אננל אלקטרונית למשימות פיפטינג מיקרופלייט 96 ו-384 בארות</td></tr><tr><td>50 מ"ל מאגר ריאגנטים</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-125</td><td>ריאגנט ריאגנט לחלוקת פיפטה רב-ערוצית</td></tr><tr>8<td>ערוצים שואב ABC</td><td>Scientific</td><td>EV503</td><td>מתאם נירוסטה 8 ערוצים לשאיבת נוזלים מ-96 או 384 בארות צלחות</td></tr><tr><td>Excel תוכנת גיליון אלקטרוני</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>תוכנת הגיליון האלקטרוני לניתוח נתונים ויצירת מפות חום</td></tr><tr><td>Origin2018 תוכנת ניתוח נתונים מדעיים וגרפים</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>תוכנת ניתוח הנתונים ליצירת עקומות תגובת המינון</td></tr></tbody></table>

וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

אופסין # רודופסין מוטציות misfolding להוביל למוות קולט אור רוד, הבא לידי ביטוי כמו אוטוזומלית דומיננטית רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מתקדמים מסנוור מחלות חסר טיפול יעיל. אנו משערים כי ניתן להקל את cytotoxicity של המוטציה misfolded אופסין # רודופסין על-ידי פרמקולוגית ייצוב החלבון המוטנטי אופסין # רודופסין המוטציה P23H, בין שאר Class II אופסין # רודופסין מוטציות, מקודד חלבון מוטנט יציב מבחינה מבנית אופסין # רודופסין המצטבר בתוך-פלזמית (ER), ואילו אופסין # רודופסין פראי סוג מועבר קרום פלזמה ב מידע יונקים תאים. אנו בעבר ביצע מסך תפוקה גבוהה המבוססת על הפריה חוץ גופית (HTS), זיהה קבוצת מלווים תרופתי הציל הובלת P23H אופסין # רודופסין מ אר אל קרום פלזמה. כאן, אנחנו באמצעות שיטת immunostaining ואחריו ניתוח ההדמיה גבוהה-תוכן, לכמת את כמות חלבון מוטציה אופסין # רודופסין את כל התא ועל קרום פלזמה. בשיטה זו הוא אינפורמטיבי ויעיל לזהות פגיעות נכון מכל תוצאות חיוביות שגויות בעקבות HTS. בנוסף, הניתוח גבוהה-תוכן התמונה אפשרה לנו לכמת פרמטרים מרובים מניסוי יחיד כדי להעריך את תכונות פרמקולוגיות של כל המתחם. שימוש assay הזה, ניתחנו את ההשפעה של תרכובות שונות 11 לכיוון שש המוטציות אופסין # רודופסין RP הקשורים, קבלת פרופיל תרופתי דו-ממדי עבור הבנה כמותיים ואיכותיים ביציבות הקונסטרוקטיבית של המוטנטים האלה אופסין # רודופסין והיעילות של תרכובות שונות כלפי המוטנטים האלה.

אנחנו מאופיין התעבורה אופסין # רודופסין עם שלושה פרמטרים: עוצמת אופסין # רודופסין-ונוס התא כולו (INT אופסין # רודופסין-ונוס), את עוצמת immunostaining של אופסין # רודופסין על קרום פלזמה (INT אופסין # רודופסין על פני התא), ואת היחס של אופסין # רודופסין כתם על פני התא כדי אופסין # רודופסין-ונוס בעוצמה התא כולו (MEM-סיכום יחס). תוצאה נציג של אופסין # רודופסין תחבורה וזמינותו מוצג איור 3 ו- 4 איור. באמצעות דימתיל סולפוקסיד ו- 9 -c...

כאן, אנחנו תיאר שיטה הדמיה גבוהה-תוכן לכמת התעבורה של מוטציות אופסין # רודופסין הקשורים עם רטיניטיס פיגמנטוזה. ניתוח התוצאות מרובות באורך הגל שימש לכמת אופסין # רודופסין החלבון על פני התא או את כל התא.

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

פילינג שגוי Rhodopsin גורם ניוון רשתית מתקדמת הנקראת רטיניטיס פיגמנטוזה. בעוד שיטת הדמיה מסורתית יש יכולת מוגבלת לכמת את התחבורה rhodopsin, זה חדש שפותחה תמונה מבוססת assay מאפשר סינון תפוקה גבוהה, ביטול תוצאות חיוביות שגויות. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של פרמקודינמיקה של תרופות.בעין הצלת קיפול של רודופסין גורם למחלות, ובכך להאיץ את הפוטנציאל לטיפול במחלה שקטה בלתי ניתנת לטיפול מסנוור, רטיניטיס פיגמנטוזה. לוקליזציה תאית של חלבון ממברנה חשובה מאוד לתפקודו. שיטה זו ניתן לשנות בקלות ולהחיל לכמת את ההובלה של כל חלבון קרום אחר של עניין.הקפד להכין מפת צלחת בעדינות להוסיף ולספירה נוזלית מכל באר של הצלחת, כדי לשמור על מספר התא ואת תנאי מצב האימון עקבי בין התאים. זה יניב גורם Z גבוה, ותוצאות אמינות. כדי להתחיל, זרע 5000 תאים לתוך שחור מוקף, תחתית ברורה, לי לסין פולי מטופלים 384-well-plate.הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז CO2 במשך שלוש שעות לתאים לצרף לתחתית הצלחת. לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 10 microliters ל הבאר של פתרונות עבודה 5X, על פי מפת לוח שנקבע מראש כמו זה המוצג כאן. כעת, הוסף 10 מיקרוליטרים ל באר של 2%DMSO לעמודות 22 ו- 24.כמו כן, להוסיף 10 microliters לכל באר של 25 micromolar 9-cis-רשתית לעמוד 23 בחדר חשוך תחת אור אדום עמום. לאחר סיום טעינת כל תרכובות הבדיקה השונות, מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מוציאים את צלחת 384 היטב בחדר חשוך עם אור אדום עמום.כאן, באמצעות 8 ערוצים שאפה, מחובר בקבוק איסוף ואקום, כדי לשואב בעדינות את המדיום מן בארות הצלחת. לאחר מכן, השתמשו בפימטה רב-ערוצית כדי להוסיף 20 מיקרוליטרים ל הבאר של 4% Paraformaldehyde המוכן טרי לכל צלחת 384 הבאר, ולתקן את התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר קיבעון, מניחים את הצלחת לאור רגיל.שם, השתמשו ב-8 ערוצים שאפו, כדי לזמן את הפרפורמלדהיד בכל באר, ולהשתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים ל-Well of PBS. שאפו והחליפו את ה-PBS בשלושה מחזורי שטיפה בסך הכל. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים ל-5% סרום עיזים לכל באר, והדקירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר הדגירה, שאפו את הבארות, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של 20 מיקרוגרם למיליליטר נוגדן נגד רודופסין B630, בסרום עיזים של 1% ל הבארות בשורות A עד O.Next, הוסיפו 15 מיקרוליטרים ל הבאר של 1% סרום עיזים לשורה P עבור קבוצת הבקרה המשנית של נוגדנים בלבד. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות, או בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה. לאחר מכן, לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של פלואורופורים.לאחר מכן, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 50 microliters ל הבאר של PBS. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את ה-PBS, והוסיפו 15 מיקרוליטרים ל הבאר של חמישה מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן IgG נגד עכברים של עזים תכלת. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום, ודגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters לכל באר של PBS, המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר של כתם Hoechst בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לבסוף, לאטום את צלחת הבאר עם סרט שקוף, לכסות אותו עם רדיד אלומיניום, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע.הסר את נייר הכסף והצב את לוח הדגימה בתמונה עם תוכן גבוה, כאשר A1 ממוקם בפינה השמאלית העליונה של הצלחת. לאחר מכן, פתח את התוכנה לרכישת תמונות כדי להגדיר פרמטרים לרכישת תמונות. פתח את חלון הגדרת רכישת הלוח וצור הגדרה חדשה או טען קובץ התקנה קיים.בחר את המטרה 20X והגדר את הצמדת הפיקסלים לשניים, כך שגודל הפיקסל המכויל יהיה 0.80 על 0.80 מיקרון. לאחר מכן, הגדר את קווי הסריקה כ- 2000 ואת גודל התמונה כ- 1000 על 1000 פיקסלים לכל אתר. לאחר מכן, בחרו בסוג הלוח להדמייתו.השתמש במידע שסופק על-ידי היצרן כדי למלא את ממדי הלוח. עכשיו, בחר את בארות להיות בתמונה יחד עם ארבעה אתרים להיות בתמונה לכל באר. הימנע מהצד של באר, אשר נגעו טיפים השאיפה.להדמיה, בחר לייזרים לזרז כמו 405, 488 ו 461 ננומטר. לאחר מכן, בחר את מסנני הפליטה עבור ערוצי DAPI, FITC ו- Texas Red. לייעל את כוח הלייזר ורווחים של כל ערוץ, כדי להבטיח, בארות שליטה חיובית אינם רוויים.בחר היטב כדי להתמקד היטב עבור מיקוד אוטומטי. לאחר מכן, בחר את הבאר הראשונית שיש לרכוש והגדר את המוקד האוטומטי של האתר עבור כל האתרים. כמו כן, בחרו ארבעה ממוצעים לכל ערוץ, ומטבו את ערך היסט Z לכל ערוץ.לאמת, כי הכל מוגדר כראוי, על ידי בדיקה ראשונה שתיים עד שלוש בארות בפינות הצלחת, כדי לוודא את התמונות הם על המוקד עבור כל בארות שנבדקו. לאחר מכן, בדוק, כי תמונות מכל האתרים לכל באר יש תאים עם יותר מ 40%confluence. לבסוף, בדוק, כי התעצמות הפלואורסצנטיות בכל הערוצים הם כל כמחצית רווי 100% שליטה בארות.לאחר מכן, שמרו את שיטת רכישת התמונה והפעילו את הלוח כולו. צפה בתמונה עד שתסיים ללכוד תמונות מהעמודה הראשונה של הלוח כדי לבדוק שוב את איכות התמונה לפני שתעזוב את התמונה. בסיום, מוציאים את הצלחת ומאחסנים אותה בארבע מעלות לשימוש עתידי.שלף נתוני תמונה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות תוכן גבוהה. בחר באחת מ- 100%control wells בעמודה 23 כדי להגדיר את הפרמטרים. תחילה, בחר את ניקוד התאים באורך גל מרובה כשיטה לניתוח והתחל לקבוע את התצורה של ההגדרות הנוספים.הגדר את הגרעינים באמצעות תמונות מערוץ DAPI. תצוגה מקדימה, כדי לוודא שצורות הגרעינים המוגדרות באר שנבחרה מתאימות היטב לתמונות הגרעינים. לאחר מכן, הגדר את צורת התא בערוץ FITC, שבו רודופסין ונוס הוא בתמונה.כדי לבצע זאת, הגדר קטרים מינימליים ומקסי מקסימום של כל תא, עוצמת פלואורסצנטיות מינימלית מעל הרקע, כמו גם שטח מינימלי של כל תא. עכשיו, להגדיר את אזורי כתם פני השטח של תא rhodopsin בערוץ האדום טקסס, על ידי הגדרת הקטרים המינימליים והמקסימליים של צורת התא, עוצמת פלואורסצנטיות minium מעל הרקע, כמו גם שטח מינימלי של כל תא מוכתם. בדוק את האלגוריתם הנוכחי בחמש בארות כדי לקבוע, אם ההגדרות ממוטבות.לאחר מכן, שמור את ההגדרות וסגור את חלון התצורה. הפעל את כל בארות עם שיטת ניתוח ממוטבת. לאחר שתסיים, יצא את מספר האובייקט כמספר התא שלם.לייצא את העוצמה הממוצעת של ערוץ FITC כמו עוצמת רודופסין ונוס, ולייצא את האינטנסיביות הממוצעת של התעלה האדומה טקסס כמו עוצמת רודופסין על פני השטח של התא. השתמש בתוכנת הגיליון האלקטרוני כדי ליצור מפת חום בשני צבעים עבור כל פרמטר. סדר את שם קווי התאים בציר ה- x ואת התרכובות בציר ה- y.כאן, התמונות שלנו של P23H rhodopsin ונוס טיפלו בתאי U2OS, המביעים פלואורסצנטיות של ונוס בירוק, וכתמים חיסוניים של פני השטח של התא באדום. התאים טופלו ב- DMSO או בחמישה מיקרומולרים 9-cis-רשתית. בדיקה הובלת rhodopsin, השוואת כמות rhodopsin בתא כולו בתנאים שונים, מראה התאוששות משמעותית בקו התא מוטנט P23H, כאשר מטופלים עם 9-cis-רשתית.בנוסף, עוצמת הרודופסין על פני התא, והיחס בין כתם הרודופסין על פני התא לעוצמת רודופסין ונוס בתא כולו, אינם נמוכים משמעותית עבור מוטציית P23H, בהשוואה לרודופסין הבר שטופל ב- DMSO. מפת חום היא דרך יעילה להשוות את כמות הרודופסין הממוצעת לוקליזציה לכל תא על פני מוטציות מרובות. כאן, פקדי wildtype ושישה מוטציות rhodopsin מפורטים אופקית, ואת ההשפעות של טיפולים מורכבים מושווים אנכית.בהסכמה עם מחקרים קודמים, עוצמת הרודופסין על פני התא והיחס של כתם רודופסין על פני התא לעוצמת רודופסין ונוס נמוכים יותר עבור ששת המוטנטים בהשוואה לטבע שטופלו ב- DMSO. תרכובות 1, 2, 6 ו-9 הגדילו באופן משמעותי את היחס בין כתם הרודופסין על פני התא לעוצמת רודופסין ונוס במוטנטים T4R, P23H, D190N ו- P267L rhodopsin, מה שמרמז על כך שתרכובות אלה מצילות את הובלת המוטנטים הרודופסינים האלה לממברנה הפלזמה. זכור שתאים אלה צריכים להיות בין 50% ל- 70%confluent לפני הקיבעון, מכיוון שזה קריטי לניתוח תמונה.כמו כן, הראינו תמונות של בארות על פני כל הצלחת. ודא, כי התמונות בפוקוס, כי הפלואורסצנטיות, כי לא לצאת, יש את כל ערך הסף עבור כל ערוץ. עד תרכובות בחירה, כי הצלה misfolded תחבורה rhodopsin, אנחנו יכולים לאמת את התהליך, ואז להעביר את היעילות של תרכובות אלה ב vivo, באמצעות מודל העכבר המבטאת מוטציה P23H rhodopsin.שיטה זו מאפשרת לנו לכמת את כמות חלבון הממברנה, ואת לוקליזציה שלה. לכן, זהו כלי נהדר עבור טעות מיקרו התחיל על חלבון קרום לכל לסייע לשמור השפלה. Paraformaldehyde, כפי שהוא בניסוי זה, יש נהלים מעורבים הטיפול של reagent זה.זה ייעשה מתחת למכסה המנוע. פסולת כולל זה reagent צריך להיות מסולק כראוי כמו כימיקל מסוכן.

a-rhodopsin-transport-assay-by-high-content-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת culturing תא אוטומטי עם דימות גבוהה תוכן כדי לחזות ולכמת תהליכים תאיים רבים ומבנים, באופן תפוקה גבוהה. שיטות כאלה יכולות לסייע ביאור תפקודית נוספת של הגנום, כמו גם לזהות את הגן למחלה רשתות מטרות סמים פוטנציאליים.

הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

TMEM184A קידוד לבנות עם תג ה- GFP על הסופית- carboxy המיועד ביטוי איקריוטיים, הועסק מבחנים שנועדו לאשר את זיהוי של TMEM184A כמו קולטן הפרין בתאי כלי דם.

באמצעות TMEM184A GFP-tagged לבנות לתעודה המעידה על הפרין קולטן זהות

אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה - המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה - בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו - 6) -כלורומיליל -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H 2 DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

יכול להיות מאופנן דעתנית עצביים באמצעות תהליך דינאמי של אנדו - אקסוציטוזה של רצפטורים גלוטמט ionotropic סינאפסות. המתוארים כאן הוא assay הנגיש, תיכון-תוכן לכימות תנועת משטח ופנימיים קולטן האוכלוסייה בריכות.

וזמינותו גבוהים-תוכן עבור ניטור אמפא קולטן סחר

דו ח זה מתאר הקרנה של דטרגנטים שונים להכנת GPCR החזותית, הרודופסין ומתחם המורכב שלו עם mini-Go. השיטות הביוכימי המאפיינים את איכות הקומפלקס בשלבים שונים במהלך הטיהור מומחש. פרוטוקול זה ניתן להכליל למערכות חלבון ממברנה אחרים עבור המחקרים העתידיים שלהם במבנה.

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.

מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

במאמר זה אנו מתארים שתי שיטות כמותיות לחקר יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנדים של קולטני קרום ויטמין A ואופסין פוטורצפטור עם הליגנדות הפיזיולוגיות שלהם.

מתודולוגיה לחקר אינטראקציות של קולטני קרום ויטמין A וחלבון אופסין עם הליגנדות שלהם ביצירת חלבון רטיניל

למדו שיטת הדמיה בעלת תוכן גבוה לכימות תחבורת מוטציות רודופסין הקשורות לרטיניטיס פיגמנטוזה. השיטה מאפשרת סקרינג בקיבולת גבוהה והערכה מהירה של תרופות פוטנציאליות לטיפול במחלה.

וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה

גלה סרטונים נוספים