הקמת שורות תאים Overexpressing DR3 כדי להעריך את התגובה אפופטוטיים להיפגע הרפוי אנטי-mitotic

הקמת קו יציב תא overexpressing הגן עניין ללמוד פונקציה ג'ין יכול להיעשות על ידי שיבוטים יחיד יציב של חיטוט תרביות תאים לאחר transfecting אותם באמצעות retroviral זיהום. הנה אנחנו מראים כי HT29-DR3 שורות תאים שנוצרו בדרך זו להבהיר את מנגנוני מוות איזה קולטן 3 (DR3) תורמת antimitotics-induced אפופטוזיס.

דיכוי יתר של גנים בתאים הוא דרך חשובה לחקר תפקוד הגנים. Transfection יציב עם רטרווירוס מאפשר גנים אנדוגניים להיות משולבים בגנום המארח לידי ביטוי ברציפות. אספנו מושבות בודדות של הזיהום הרטרו-ויראלי ויצרנו קווי תאים יציבים המדחקים יתר על כן את DR3 המתויג בדגל.

קווי התאים פיצו על אי זמינות של נוגדן DR3 טוב וסיפקו כלים מצוינים עבור DR3 פונקציה מחקר פוסט במבחנה ו vivo. אנחנו ייצרנו את קווי תאים לחץ יתר DR3 על ידי להרים מושבה אחת של זיהום רטרו-ויראלי. קווי תאים מושבה אחת יכולים לשמור על ההומוגניות והטוהר.

בנוסף, הפרוטוקול קל ופשוט לטיפול. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל תאים plat-A לילה ב 60 מילימטר מנות עם ארבעה מיליליטר של DMEM. כאשר התאים מגיעים ל-80%-90%, השתמש ברגנט טרנספקט כדי לשנות אותם בשני מיקרוגרם של הפלסמיד הבנוי כמתואר במדריך היצרן.

לאחר 72 שעות, לאסוף את העל טבעי. באמצעות מסנן סטרילי 0.45 מיקרומטר, לסנן את המדיה, ולשמור על ההשעיה הנגיפית בחושך בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לגדל תאים HT29 לילה בצלחת 60 מילימטר עם DMEM, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

כאשר התאים מגיעים 30 עד 50%confluence, להדביק אותם עם שני מיליליטר של השעיה ויראלית בנוכחות שמונה מיקרוגרם של פוליברן למיליליטר של השעיה ויראלית. דגירה התאים הנגועים ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד שש שעות. לאחר מכן, שאף את ההשעיה הוויראלית.

מוסיפים ארבעה מיליליטר של DMEM טרי ומחזירים את המנה לחממה. ב 24 שעות לאחר זיהום, להסיר את התקשורת מן הכלים בזהירות לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS מחומם מראש. מוסיפים מיליליטר אחד של טריפסין EDTA, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.

באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה פי 10, התבונן בתאים כדי לוודא שרובם התנתקו. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של DMEM המכיל 10%FBS כדי לעצור את טריפסיניזציה, ולאסוף את ההשעיה התא בצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant.

להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מיליליטר של DMEM בעדינות פיפטה למעלה ולמטה לערבב. לאחר מכן, לדלל את התאים על ידי גורמים של 30, 100, ו 300. זרע התאים הוא 150 מילימטר מנות כי כל מכילים 20 מיליליטר של DMEM המכיל blasticidin בריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך כשני שבוע עד שבועיים. במהלך תקופה זו, השתמש במיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10 כדי להתבונן במושבות מדי יום. סמן את המושבות המבודדות היטב בתחתית המנה כאשר קוטר המושבות הוא בערך 1-2 מילימטרים.

כאשר תקופת הדגירה הושלמה, שאפו את המדיום ושטפו את התאים בשלושה מיליליטר של PBS מחומם מראש. מוסיפים שני מיליליטר של טריפסין EDTA בצלחת 60 מ"מ. השתמש מלקחים סטריליים להרים צילינדרים שיבוט סטרילי autoclaved ולמקם אותם בצלחת.

לאחר מכן, להרים את הצילינדרים אשר כעת כל אחד מכיל כ 30 microliters של טריפסין EDTA, בעדינות למקם אותם מעל המושבות המסומנות. מחזירים את המנה לאנקובטור לשלוש דקות. לאחר מכן, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהם התנתקו.

כאשר התאים הרימו, ב 70 microliters של תרבות בינוני לכל גליל כדי להשבית את טריפסין. השתמש פיפטה 200 מיקרוליטר לערבב בעדינות את המתלה התא, הקפד לא להזיז את הצילינדר תוך ערבוב. הגדר שתי צלחות 24 באר, ולתייג אותם צלחת A וצלחת B.Add מיליליטר אחד של DMEM לכל באר.

מוסיפים 30 מיקרוליטרים של מתלי תאים לכל באר של צלחת A, ומוסיפים 70 מיקרוליטרים ל הבאר המתאימה של צלחת B. מניחים את הצלחות בחזרה לתוך החממה. כאשר התאים בצלחת B הם ב 90%confluence, להסיר את המדיה בזהירות לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS. הסר את ה- PBS לחלוטין והוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר טעינה של 1X SDS-PAGE כדי לריס את התאים.

לאחר חמש דקות, להעביר את התא lysate מצלחת 24 באר ל 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. מרתיחים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הפעל את הדגימות על 10% ג'ל SDS במתח קבוע של 80 וולט במשך 15 דקות ולאחר מכן ב 120 וולט במשך שעה אחת.

לאחר מכן מעבירים את החלבון לממברנה פלואוריד פוליווינילידין על ידי העברה רטובה בזרם קבוע של 400 מיליאמפר במשך שעתיים. לדלל את הנוגדן העיקרי על ידי גורם של 5, 000 ב 5% חלב דל שומן כי הוא מומס ב- TBST. מוסיפים את הנוגדן של FLAG לממברנה, ודגירה בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.

באמצעות שייקר decoloring להגדיר 200 סל"ד, לשטוף את הממברנה עם TBST במשך 15 דקות, רענון TBST כל חמש דקות. לאחר מכן, לדלל נוגדן משני נגד העכבר על ידי גורם של 10, 000 בחלב 5% דל שומן. דגירה הממברנה עם נוגדן משני מדולל בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש עד שש שעות.

לשטוף את הממברנה על שייקר decoloring שוב כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, השתמש chemiluminescence משופרת המערבית מערכת תיעוד ג'ל כדי תמונה הממברנה ולזהות את הביטוי FLAG. ראשית, לאסוף הן HT29 ו HT29-DR3 תאים על ידי טריפסיניזציה, ולהשתמש מונה תאים אוטומטי כדי למדוד את צפיפות התא.

זרע את התאים לתוך בארות של 12 צלחות היטב עם DMEM בצפיפות של 30, 000 תאים ל באר, ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, להוסיף 10 nanomolar של דיאזונמואיד לכל באר המכילה תאים באמצעות 1% DMSO כשליטה שלילית, ולהעביר את הצלחות לאנקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני. לאחר 48 שעות של טיפול, תמונה התאים תחת מיקרוסקופ ב 10 פעמים הגדלה.

לאחר מכן, זרע הן HT29 ו HT29-DR3 תאים לתוך הבאר של צלחת 96 גם עם DMEM בצפיפות של 3, 000 תאים ל הבאר, ולאפשר להם לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להוסיף ריכוזי דיאזונומיד הסלמה במינון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר 48 שעות של טיפול, השתמש בערכת בדיקה לכדאיות תאים המבוססת על זוהר כדי למדוד את הכדאיות התאית.

מוציאים את צלחת ה-96 היטב מהחמה, ותנו לה לעמוד בטמפרטורת החדר במשך כ-30 דקות. לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של רה-גנטים לכל באר, ומנערים את הצלחת במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לתפושים את התאים. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולאחר מכן להשתמש בקורא מיקרופלסטיק כדי לקבוע את luminescence של כל באר.

אפיון של תאי HT29 המבטאים את DR3 מגלה כי השיבוטים מבטאים רמות משתנות של DR3 בעוד שתאי הבר אינם מראים ביטוי גנים אקסוגני. גנים 1 ו-5 נראים מבטאים את הרמות הגבוהות ביותר של DR3, ולכן נבחרים לניסויים נוספים. המורפולוגיה של HT29 ו HT29-DR3 תאים נצפו לאחר שטופלו במשך 48 שעות עם דיאזונמיד.

תאי HT29-DR3 מציגים אפופטוזיס ברור עם קרום תא שבור ופסולת תאים. עם זאת, תאי HT29 מראים מעצר מיתוטי בלבד עם תאים שלמים המציגים צורת תא מעוגל. הכדאיות התאית של סוגי תאים אלה נקבעת לאחר טיפול במשך 48 שעות עם שלושה ננומולרים של דיאזונומיד.

HT29-DR3 תאים נראים יש מוות תאי של מעל 80%בעוד התאים ההורים HT29 להפגין רק תגובה קלה בצורה של מעצר מיתוטי. הדבר מצביע על כך שדיכוי יתר של DR3 מחדש את מסלול האפטומטי הנגרמת על ידי דיאזונומיד בתאים אלה. דילול סדרתי נכון חשוב כדי לקבל צפיפות אופטימלית של שיבוטים בודדים.

חשוב גם לוודא שכל גליל שיבוט מכיל רק מושבה אחת ולהימנע מזיהום מושבות סמוכות. קווי התאים המדפרסים יתר על כן של DR3 הקלו על המחקר הביוכימי של המנגנונים המולקולריים במבחנה. אנחנו יצרנו HT29-DR3 xenografts באמצעות הזרקה תת עורית של תאים HT29-DR3, וזה עזר לפרט את המנגנונים של אפופטוזיס הנגרמת על ידי סוכנים אנטימיטוטיים ב vivo.

פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר גנים של עניין בקווי תאים אחרים. בנוסף, נוקאאוט גנים הוא דרך נוספת למחקר תפקודי, והפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם למערכות הפלת הגנים. לכן, זה בדרך כלל ישים כדי להבהר פונקציות גנים.

זכור להפיל את ממסר הווירוס לאשפה למכולות ספציפיות לסילוק בטיחות.