החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

סרטון זה ידגים שיטה פשוטה לחקירת מספר גנים מועמדים ב- AML במקביל, באמצעות מערכת Crisper-Cas9 בשילוב עם מוסט הצמיחה התחרותי המבוסס על ציטומטריית זרימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ומדרגית. הדגמת ההליך תהיה בו רוי צ'ן, פוסט דוק מהמעבדה שלנו.

תוכנת תכנון CRISPR מבוססת אינטרנט משמשת לעיצוב ארבעה עד שישה RNAs מדריך יחיד עבור הגן של עניין. כדי להתחיל, מלא את המידע המתאים בשדות בכוכביות. לאחר מכן בחר את גנום היעד עבור עיצוב RNA מדריך יחיד.

הדבק את רצף היעד בתיבת הרצף ולחץ על לחצן השליחה. לשיבוט בביטוי RNA המדריך היחיד הרצוי פלסמיד, הקדים את הנוקלאוטידים CACC לתחושה oglionucleotide ו- AAAC כדי להפוך את אוליגונוקלאוטיד האנטיסנס המחמיא. חוש premixed ו oligonucleotides antisense מסודרים לאחר מכן מהחברה בצלחת 96 גם, שכותרתו אוליגו מיקס.

הגדר צלחת נפרדת U-Bottom 96 באר, שכותרתו צלחת חישול. הכן תערובת אב של מיקרוליטר אחד של T4 פולינוקלאוטריד קינאז, מיקרוליטר אחד של חיץ רצועות DNA 10x T4, ושישה מיקרוליטרים של מים לכל תגובה חישול. הוסף 8 microliters של תערובת האב לכל באר של צלחת חישול, ואחריו 2 microliters של חוש premixed ו antisense oligonucleotides.

פיפטה פעמיים עד שלוש פעמים בעדינות כדי לערבב היטב, ולאחר מכן לסובב את הצלחת בקצרה כדי לקבל את הערבובים לתחתית בארות. השתמש בתוכנית ההתאגנות הבאה במחשב PCR. 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, 95 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ו -30 שניות, ואחריו קירור איטי ל 22 מעלות צלזיוס בקצב של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה.

כאשר חישול הושלם, להכין צלחת 96 באר טרי, שכותרתו תערובת אוליגו מדולל, על ידי דילול זרחן ותוסס oligonucleotides מן התגובה annealing אחד עד 200 עם מים. ליניארית וקטור ביטוי RNA מדריך יחיד על ידי עיכול חמישה מיקרוגרם של הווקטור עם 1.5 microliters של אנזים הגבלת BBS1, באמצעות מאגר מתאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, לקחת צלחת טרי 96 גם שכותרתו לוח קשירה, ולהוסיף 20 ננוגרם של BBS1 מתעכל מדריך יחיד RNA ביטוי וקטור אחד גם לכל מחרוזת RNA מדריך אחד הרצוי.

לשם כך, להוסיף 2 microliters של אוליגונוקלאוטידים זרחן annealed מצלחת תערובת אוליגו מדולל. מוסיפים לכל באר, מיקרוליטר אחד של חיץ ליגות 10X T4, ומיקרוליטר אחד של אנזים ליגס T4, ובעדינות פיפטה לערבב. דגירה הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.

בערך 10 דקות לפני שתגובת הקשירה נעשית, מלאו 90 מיקרוליטרים של תאי אי-קולי מוכשרים כימית על קרח. להעביר 10 aliquots microliter של התאים המוסמכים לתוך כל באר של צלחת נפרדת 96 באר בנפרד. מוסיפים את תערובת הקשירה לתוך בארות המכילות את התאים המוסמכים.

פיפטה למעלה ולמטה בעדינות, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. פיפטה חמישה microliters של תערובת DNA חיידקים מכל תגובת טרנספורמציה ישירות לתוך באר של צלחת 6 באר, המכיל אגר LB עם 100 מיליגרם למיליליטר של אמפיצילין. מוסיפים כחמש עד שמונה גם גם גם, ומנערים את צלחת ה-6 היטב שמונה עד עשר פעמים בתנועה מעגלית.

דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, בחר אחת עד שתי מושבות בודדות מכל באר, עם קצה פיפטה סטרילי 20 microliter, ו streak אותו על נקודה שכותרתו על צלחת פטרי סטרילית 10 ס"מ, עם אגר LB ו 100 מיליגרם למיליליטר של אמפיצילין לאחר פסים על צלחת LB, להוציא את הקצה לתוך שלושה מיליליטר של מדיום אמפיצילין בצינור תחתון עגול 14 מיליליטר מסומן במספר השיבוט החיידקי המתאים. לוחית החיידקים נשלחת ישירות לריווח סנגר.

לאחר אישור רצף של RNAs מדריך יחיד משובט, לטהר את ה-DNA מן הצינור המתאים 14 מיליליטר, באמצעות ערכת miniprep על פי הוראות היצרן. חלקיקי RNA lentiviral מדריך יחיד מיוצרים בפורמט 96 גם, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. והעל-טבעי הוויראלי קפוא מיד במינוס 80 מעלות צלזיוס.

יום אחד לפני ההעתקה של RNAs מדריך יחיד בתאי AML Cas9, מצופה תחתית שטוחה שאינם רקמה תרבות מטופלים 96 צלחת היטב, עם 100 מיליליטר של שבר פיברונקטין אנושי רקומביננטי בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר. לעטוף את הצלחת עם לעטוף נצמד כדי למנוע אובדן אידוי, ולהשאיר אותו על הספסל לילה. ביום שלמחרת, להסיר את שבר פיברונקין אנושי רקומביננטי מכל באר של צלחת 96 היטב.

להפשיר את העל-טבעי הוויראלי של כל מדריך RNA בטמפרטורת החדר. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של על-טבעי ויראלי מכל צינור לכל באר מצופה של צלחת ההעתקה. לעטוף את הצלחת עם לעטוף נצמד כדי למנוע זיהום פוטנציאלי במהלך צנטריפוגה.

לסובב את הצלחת ב 1, 300 פעמים גרם ב 35 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לקראת סוף הספין-קצינה, ספרו את ה-Cas9 הגבוה המבטא תאי B3 משובבים מבקבוק התרבות. לאחר הספירה, סובב כלפי מטה את מספר התאים הנדרש והתן מחדש במדיום טרי.

לאחר ספינפוט של 90 דקות, השתמשו בפיגט רב-ערוצי המותאם ל-50 מיקרוליטרים כדי להסיר את העל-טבעי מכל הבארים באיטיות על-ידי הטיית הצלחת. הוסף 100 microliter של התרבות של שיבוט B3 תאים לכל גם לאט, מחליק למטה מן השפה. לסובב את הצלחת ב 1, 300 פעמים גרם ב 35 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתחתית.

מעבירים את הצלחת לאנקובטור ברמת 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחר, להוסיף 100 microliters של מדיום טרי לכל באר המכילה תאים RNA מדריך יחיד, כך נפח בינוני הסופי הוא 200 microliters. תחזיר את הצלחת לאנקובטור.

72 שעות לאחר ההעתקה, לבדוק את אחוז RNA מדריך יחיד המכיל תאים חיוביים BFP בכל באר על ידי cytometry זרימה. השתמש בצבע יכולת הקיום של התא כדי לסמן ולהחריג תאים מתים מהניתוח. המשך לציפוי מחדש של חלק מהתאים לתוך בארות חדשות עם מדיום טרי לאחר כל ניתוח עובדות כדי למנוע צפיפות יתר במהלך ההתמדה.

כל יומיים עד שלושה ימים, חזור על ניתוח העובדות כדי לבדוק את השיעור היחסי של תאים חיוביים BFP בהשוואה לעמיתיו השליליים BFP. נתח את אחוז התאים החיוביים של BFP עבור כל נקודת זמן, באמצעות תוכנת ניתוח עובדות. המפתח להצלחת ההתרבות התחרותית הוא להשתמש בטכניקות הגטינג המתאימות כדי להבטיח שמספרי התאים החיים בסופו של דבר יהיה מדויק.

גרור קבצי FCS עבור כל דוגמה לתוכנה. לחץ פעמיים על כל קובץ לדוגמה אחד, והתוות עלילה נקודה של פיזור קדימה לעומת פיזור בצד, עם פיזור קדימה על ציר x, ו פיזור בצד על ציר y. שער כל התאים.

לחץ פעמיים על התאים המגודרים, וכתם הכדאיות של העלילה על ציר ה- y לעומת גובה פיזור קדימה או חלקת נקודה באזור. שער הכדאיות כתם תאים שליליים. לחץ פעמיים על התאים החיים מגודרים, ועלילה BFP על ציר y לעומת פיזור קדימה על ציר x.

שער התאים החיוביים BFP. החל את כל השערים האלה על כל הדוגמאות על-ידי גרירת הדוגמה שנבחרה לכל הדוגמאות תחת כרטיסיית הקבוצה. לחץ על עורך הטבלה כדי להפוך את טבלת ניתוח של כל הדוגמאות.

גרור את הספירה החיובית של BFP מדגימה אחת לטבלה ולחץ על לחצן התצוגה בעורך הטבלה כדי ליצור דוח אצווה של כל הדגימות, כאשר הטבלה מציגה את אחוז התאים החיוביים של BFP. שמור את הטבלה כקובץ Excel. מערכת זו שימשה כדי לחקור את התפקיד של גנים שעשויים לשחק תפקיד התפשטות או הישרדות של קווי תאים אנושיים מורין AML.

מיקוד AAVS1 נמל בטוח עם שני RNAs מדריך יחיד נפרד לא הייתה השפעה על התפשטות של תאים אנושיים MOM13 Cas9 לעומת זאת, כאשר הגן הקשורים שכפול DNA, RPA3, היה ממוקד, ירידה פרוגרסיבית ומשמעותית באחוז התאים החיוביים BFP בהשוואה לעמיתים שליליים BFP שלילי untransduced נצפתה. באופן דומה, ההשפעות של מדריך יחיד RNAs מיקוד Dot1l, ווסת אפיגנטי, ורודופסין, גן פיגמנטציה העין, נבדקו בתאי העכבר MLL-AF9 Cas9. מדריך יחיד RNAs מיקוד Dot1l, הראה ירידה דרמטית ומתקדמת התפשטות תחרותית לעומת מדריך יחיד RNAs מיקוד רודופסין.

תוצאות אלה ממחישות את הפגיעות של MLL-AF9 המביעים תאי לוקמיה המוניים לדלדול Dot1l, ומאשרות תוצאות שפורסמו בעבר. בהנחה של ארבעה עד שישה RNAs מדריך לכל גן, שיטה זו מתאימה היטב לשמש לבדיקת לפחות 16 עד 24 גנים במקביל, וזה יכול להיות מיושם גם כדי לבדוק תלות בגנים בכל קו תאים סרטניים. במקרה של מספר גדול יותר של גנים, כגון מסלול מולקולרי שלם שצריך להיבדק בתאי AML, מסכים מבוססי CRISPR-Cas9 בבריכה יהיו שימושיים יותר.