מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה

לימפומות הן גידולים מורכבים מבחינה היסטולוגית. לכן, אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מרובת-פלקסים מציעה יתרונות על פני אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית קונבנציונלית כדי לחקור סמנים של עניין בתאי הגידול ובמיקרו-וירוס. טכניקה זו יש פוטנציאל סטנדרטיזציה של ניקוד של כתמים מבוססי נוגדנים בדגימות לימפומה היסטולוגית, תהליך זה היה מאתגר מבחינה היסטורית בשל המורכבות של microenvironment הגידול.

באופן ספציפי, אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מרובת-פלקסים והדמיה ספקטרלית מאפשרת מדידה כמותית של כתמים מרובים בתוך שקופית אחת, ובכך מאפשרת הערכה של ביטוי אנטיגן שותף וקשרי ספאל בתוך חומר קליני. התחל על ידי טבילת שקופיות de-waxed ו rehydrated במאגר אחזור אנטיגן סטנדרטי בצנצנת זכוכית לחסוך במיקרוגל וביצוע אחזור epitope הנגרמת על ידי חום במיקרוגל מתאים. בצע סבבים נוספים של הפשטת מיקרוגל בהתבסס על מיקום הנוגדן ברצף מולטיפלקס הסופי.

לדוגמה, הנוגדן הרביעי דורש שלושה סבבים נוספים של הפשטת מיקרוגל לפני הכתמה. לאחר השלמת תהליך החשפנות, יש להשתמש במדפים ובכפפות חסינות חום כדי להעביר את המגלשות למים מזוקקים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. כאשר פתרון אחזור אנטיגן התקרר, לחסום את פעילות peroxidase הרקמה עם בלוק peroxidase מסחרי במשך 10 דקות ואחריו לשטוף חמש דקות מלוחים טריס-buffered, או TBS, ודטרגנט לא יוני.

לחסום כל כתמים לא ספציפיים עם דגירה של 10 דקות במאגר חסימה ואחריו דגירה עם הנוגדן העיקרי של עניין בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ושלוש חמש דקות שוטף עם חיץ TBS-D. לאחר מכן, הדגירה את הדגימות עם peroxidase חזרת מתאימה תרכובת נוגדן משני במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שלוש שטיפות במאגר TBS-D כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, יש למרוח רהט פלואורסצנטי מתאים המבוסס על טיראמיד על השקופיות במשך חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר ואחריה שלוש שטיפות TBS-D של חמש דקות.

בצע הפשטה נוספת מבוססת מיקרוגל כדי להסיר את הנוגדנים העיקריים והמשניים בתתסמת אחזור אנטיגן טרי כפי שהוכח. בסוף האחזור, מקררים את המגלשות במים מזוקקים ומייבשים את האזורים במגלשות ללא רקמה עם מגבוני מעבדה. דגירה להחליק עם dappy במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש שטיפות TBS-D.

לאחר מכן, בזהירות לייבש את השקופיות עם מגבונים במעבדה מבלי ליצור קשר עם הרקמות ולהרים את הדגימות עם מדיום הרכבה מתאים להדמיה. לסריקת שקופיות מונופלקס, בחר את המסננים המתאימים מהפלורופורים המשמשים לתיוג הדגימות ובחן כל סמן ואת ערוץ הפלואורסצנטיות המתאים לו כדי לזהות זמן חשיפה מתאים לקבלת אות נקי, תוך התמקדות ברכיב הרקמה שאמור להיות האות החזק ביותר עבור הסמן. כדי לאפשר השוואה בין דגימות של עוצמת הפיקסל, השתמש בהגדרת המצלמה החיה כדי לכוונן את זמן החשיפה בכל ערוץ בודד עד שלא יהיו אזורים עם חשיפת יתר בתצלום המצלמה החיה.

לאחר סריקת כל השקופיות, רכוש תמונות שדה בהיר מדומה כדי להשוות באופן חזותי לתבנית האימונוהיסטוכימית הרגילה ולקבוע אם תבנית הכתמים נכונה. כדי לסרוק שקופיות microarray רקמות, להשתמש במצב סריקת microarray רקמות במערכת ההדמיה ואלגוריתם מיקוד אוטומטי מתאים. עבור שקופיות סעיף רקמה שלמה, יש את השקופיות נבדקו על ידי פתולוג מוסמך כדי לבחור תמונות אופטימליות מאזורי הגידול המייצגים ביותר.

לפני תחילת הניתוח, בחר סמן גידול כדי לזהות את התאים המעניינים לניתוח. יש פתולוג לסקור את התמונות ולהחליט אם פילוח רקמות נדרש. במידת הצורך, בחר את אזורי הבקרה המתאימים לפילוח ובדוק אם תוכנת ניתוח התמונה יכולה לזהות כראוי אזורים כאלה.

לאחר פילוח התאים, תן לפתולוג לסקור את מפת הפילוח כדי להבטיח את נאמנותה של גישת הפילוח המיועדת וסקור תמונות בודדות כדי לקבוע אם פילוח התאים מתאים או אם נדרש פילוח רקמות נוסף כדי לבחור אזורים מועשרים עבור תאים סרטניים, סטרומה או נמק. לאחר מכן לקבוע את ערך ניתוק חיובי בעוצמה אופטית עבור כל סמן בשילוב עם הפתולוג וליצור היסטוגרמות בתוכנה סטטיסטית מתאימה כדי לנתח את התפלגות התדירות של עוצמת הסמן לכל תא. כדי ליצור נתוני אחוזים עבור סמנים ספציפיים של עניין בתוך תאים מוגדרים, הוסף טבלת ציר לתוך גליון הנתונים ובחר Sum כדי לחשב את אחוז החיוביות של סמן עניין יחיד.

המספר הכולל של תאים חיוביים של סמן חלקי המספר הכולל יחושב. התוצאה היא אחוז התא החיובי של הסמן עם ליבה אחת, או מספר מחקר אחד. כדי ליצור נתונים מספריים, השג את העוצמה הממוצעת של כל סמן עניין בכל התאים לחקור בתוך מדגם כדי לחלץ את הספירה מנורמל חציון עבור כל סמן של כל ליבה או מספר מחקר.

כאן, תמונות אימונוהיסטוכימיות פלואורסצנטיות ייצוגיות עבור דגימת לימפומה גדולה מפוזרת של תאי B עם סידור מחדש של גנים c-MYC ו- BCL2 מוצגים. תמונות אימונוהיסטוכימיות של שדה בהיר מדומה מדגימות דפוס כתמים דומה של סמן גידול. היישום של תמונות אימונוהיסטוכימיות פלואורסצנטיות מולטיפלקס לפאנל תאי T בלימפומות תאי T אנגיואימונובלסטיות חושף את ההטרוגניות התאית של דגימת הגידול.

כאן, האופטימיזציה של דגימת בקרת שקדים וניתוח הנתונים המתקבל מוצגים. ניתן להשתמש במגוון תוכנות לניתוח תמונה לאחר השלב הבלתי מעורער לכמת ביטוי סמן ולוקליזציה בתאי הגידול ובמיקרו-וירוס הגידול. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים ללמוד את הביטוי השותף של סמנים מרובים בתוך סוגי תאים ספציפיים בחלקים רקמות בודדות של לימפומה.

יש לדאוג כדי למנוע פגיעה הנגרמת על ידי חום במהלך שלבי microwaving להיות מודעים לסיכוני נפילה במהלך שלבי הסריקה המבוצעים בסיפון.