מחקר Immunohistopathologic פרופיל חומצה פולית קולטן בטא מקרופאג של כלי הדם Microenvironment המערכת החיסונית ב Arteritis תא ענק

פרוטוקול אימונוהיסטוכימי והיסטופתולוגי זה יכול לשמש לבחינת בטא קולטן פולאט, שהוא חלבון מועמד עם ערך פרוגנוסטי וטיפולי פוטנציאלי למיקרו-וירוס כלי הדם בעורקי התאים הענקיים. פרוטוקול זה נבדק בזמן ומועסק באופן נרחב ונוזל לשמש כדי לחקור את תכונות בטא קולטן פולאט ברקמות עורקים זמניים, גם לאחר אחסון לטווח ארוך. כדי לרכוש מקטעי רקמה, השתמש במיקרוטום כדי לחתוך ארבעה עד חמישה חלקים בעובי מיקרומטר של עורקי זמן מוטבעים בפרפין, צפים כל קטע באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס כפי שהם מתקבלים, כדי להסיר קמטים.

השתמש שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כדי ללכוד שלושה חלקים לכל שקופית, לחמם את המגלשות על צלחת התחממות, בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. כאשר המקטעים דבקים בשקופיות, מקם את השקופיות בארון תקשורת אנכי לייבוש ב- 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, להעביר את השקופיות למיכל שקופית לאחסון בארבע מעלות צלזיוס לפחות 12 שעות.

לאחר מכן, לטעון שקופיות לתוך ארון תקשורת שקופיות לחות את הרקמות עם שתי חמש דקות, 100% קסילן טבילות יורד, חמש דקות לכל ריכוז אתנול טבילה סדרה, עם 10 שניות של תסיסה כל 30 שניות. לאחר טבילת האתנול של 70%, שטפו את המגלשות פעמיים במים מזוקקים פעמיים במשך חמש דקות, עם 10 שניות של תסיסה כל 30 שניות. לאחזור אנטיגן, להעביר את המדף לתוך מיכל זכוכית עם 200 microliters של 95 מעלות צלזיוס, 10 מילימולאר לליטר חיץ ציטראט במשך 30 דקות.

בסוף הדגירה, לאפשר את המגלשות להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 20 דקות לפני שטיפה עם מים זורמים במשך חמש דקות. כדי להסיר את פעילות peroxidase אנדוגני, תחילה להשתמש סמן הידרופובי לצייר עיגול סביב כל דגימת רקמה, לפני דגירה הדגימות ב 200 microliters של 3%מי חמצן במשך 10 דקות, ואחריו 3 שטיפות ב 200 micoliters של תמיסת מלח טריס-buffered, או TBSS, לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לטבול כל שקופית בעדינות כדי להסיר כל חיץ עודף ולהוסיף 200 microliters של קוקטייל נוגדנים העיקרי של עניין להחליק כיסוי לכל שקופית עבור דגירה של שעה אחת בתא לח בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, להשליך את החלקות הכיסוי ולשטוף את השקופיות עם שלוש שטיפות שתי דקות ב- TBSS טרי. לאחר הסרת המאגר העודף, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תוסף נוגדנים משני ביוטינילציה מתאים וכיסוי לכל שקופית עבור דגירה של 45 דקות בתא הלח בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת החלקות הכיסוי, שטפו את השקופיות ב- TBSS כפי שהוכח.

הסר כל מאגר עודף. ולתייג את החלקים עם 200 microliters של מאגר מצע DAB במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות עם TBSS ומי ברז זורמים במשך 10 דקות, לפני הנגד עם hematoxylin במשך שלוש דקות.

לאחר מכן, להוסיף 70 microliters של מדיום הרכבה מתאים לכל שקופית לאט להטות רצועת כיסוי זכוכית על המדיום הרכבה, כדי למנוע יצירת בועות כמו להחליק את המכסה הוא הוריד למקומו. לניתוח היסטופתולוגי, מניחים את המגלשה על הבמה של מיקרוסקופ אור ולהעריך את ארכיטקטורת כלי הדם של קטע הרקמה הראשונה. לאחר מכן, לכמת את מספר מקרופאגים יחסית למספר לימפוציטים לכל סעיף.

לניתוח אימונוהיסטוכימי, בדקו את תבנית הכתמת הבטא של קולטן האיוולת בכל קטע רקמה וכמתו את מספר התאים החיוביים של קולטן האיוולת, CD68 חיובי ו-CD3 ב-10 שדות הספק גבוה שנבחרו באקראי לכל מקטע. המטוקסילין וכתמי אאוסין בדגימות רגילות חושפים אנטומיה עורקית תקינה, עם תאי אנדותל באינטימה של טוניקה, תאי שריר חלקים במדיה של טוניקה ומטריצת קולגן הטרוגנית, הכוללים פיברובלסטים וכלי הזנה הנקראים ואסה וזורום בהרפתקה של טוניקה. עורקי זמן חיוביים של תאי ענק מדגימים דלקת בינונית עד חמורה, עם אגרגטים ומאקרופאגים, או היסטיוציטים, לימפוציטים, תאי פלזמה מזדמנים ותאי ענק מרובי גרעין.

כמו כן, נרשמת הצטמצמות לומינלית, המלווה בעיבוי אטימאלי ושיבוש של 90% בלמינה האלסטית הפנימית. CD3 לימפוציטים חיוביים CD68 מקרופאגים חיוביים נמצאים גם בכל הדגימות החיוביות של עורקי התא הענק, עם דפוסי כתמים דומים שנצפו בכל הביופסיות. כתמים עבור בטא קולטן פולאט מוגבל מקרופאגים ותאים ענקיים מרובי גרעין המעדיפים לוקליזציה על ההרפתקה והמדיה.

יש לציין כי בטא קולטן פולאט היוותה כ -30% מכלל המקרופגים. עיבוד ביופסיה עורקים זמניים, חיתוך, dewaxing דורשים מומחיות זהירה על מנת לבצע את השלבים הבאים. פרשנות השקופית דורשת מומחיות של פתולוג לב וכלי דם מנוסה.

הזכר לצופים להשתמש באמצעי זהירות למגע ולנשימה, כגון כפפות וקפוצ'ון מאוורר, בעת טיפול בדגימות ובריג'ים.