3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

שיטה חדשה זו לניתוח שעתוק הפוך יכולה לספר לנו דברים חדשים על תחום הווירולוגיה רטרו. לדוגמה, אנו יכולים ללמוד על הפרטים של איך גורמים הגבלות הסלולר לעבוד או איך תרופות תרופתיות לעכב סינתזת DNA HIV1. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלא רק מספק מידע על הרצף של Tran Scrips הפוך המתהווה, אבל זה מאפשר מיפוי מדויק שלהם 3-prime DNA termini ברזולוציה גרעינית הדוקה אחת.

העשרת DNAs משלימים HIV1 מ- DNA הסיטונאי של תאים נגועים HIV1, נעשה על ידי לכידה היברידית צריך להתבצע בתחנת עבודה PCR. הכינו תערובת ראשית של גם גם 100 מיקרוליטרים של חרוזים לדגימה לצינור מיקרו צנטריפוגה אחד, והנחו את הצינור על מגנט המתאים לצינורות מיקרו צנטריפוגה. לאחר חרוזים התיישבו לכיוון הצד המגנט של הצינור, להסיר את מאגר האחסון, להסיר את הצינור מן המגנט, ולהשעות מחדש את חרוזים ב500 microliters של לשטוף קלידנט או חיץ BW.

מניחים את הצינור בחזרה על המגנט, לחכות חרוזים לנדוד למגנט, ולהסיר את העל טבעי. מוציאים את הצינור מהמגנט, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תסנובת קזין, משהים מחדש את החמרוזים, ומדוגים בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות. לאחר עשר דקות, לשטוף את חרוזים עם חיץ BW.

מניחים את הצינור בחזרה על המגנט, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את חרוזים ב500 microliters של חיץ BW. הוסף חמישים picomoles של כל oligonucleotide biotinylated שנתפסו לכל מדגם. דגירה בטמפרטורת החדר תוך נדנדה בסופו של דבר מעל מערבל קצה במשך שלושים דקות.

לאחר מכן, להחזיר את הצינור למגנט, להסיר את supernatant, להסיר את הצינור מן המגנט, להוסיף חמש מאות microliters של חיץ 1x עשר, ולהשעות מחדש את חרוזים. לאחר לשטוף השני להשעות את חרוזים עם אוליגונוקלאוטידים משותקים בעשרה microliters של 1x עשר חיץ לכל מדגם. עבור כל דגימה, סמן צינור microcetrofuge אחד ולהוסיף עשרה microliters של השעיית חרוזים, מאה ושבעים microliters של DNA, ותשעים מיקרוליטרים של חיץ 3x עשר.

דגירה בבלוק חום יבש ב92 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי דה הטבע את ה-DNA. מעבירים את הצינורות לגוש חום יבש אחר, אשר מוגדר חמישים ושתי מעלות צלזיוס, ודגירה במשך שעה אחת. כל עשר דקות במהלך הדגירה הזאת, להפוך את הצינורות לערבב.

כאשר הדגירה של שעה אחת נעשית, לשטוף את חרוזים פעם אחת עם חמש מאות microliters של חיץ 1x עשר, ולהשעות מחדש בשלושים וחמישה microliters של מים ללא גרעין. ודא את חרוזים להתיישב היטב על ידי השארת הצינורות על המגנט במשך כשלוש דקות לפני הסרת כל נוזל. כדי לשאוב, דגירה הצינורות ב 92 מעלות צלזיוס בבלוק חום יבש במשך שתי דקות.

לאחר מכן, הזז במהירות את הצינורות אל המגנט, צינור אחד בכל פעם. לאחר חרוזים מחויבים לצד של הצינור, להעביר את העל טבעי המכיל את ה-DNA HIV1 לצינור טרי. כדי להתחיל בהליך זה, להשעות מחדש את המתאם lyophilized ב 100 micromolar במים חופשיים נוקלאאז ומערבולת הצינור.

לדגימה, בתוספת דגימת בקרה אחת, לשלב נקודת אפס ארבע חמש microliters של חיץ 10x T4 DNA ligase, ארבעה microliters של מתאם, ונקודה אפס חמישה microliters של מים חופשיים גרעין. מחממים ל-92 מעלות במשך שתי דקות, ואז נותנים לו להתקרר לאט ל-16 מעלות צלזיוס במכונת PCR. זה יאפשר מתאם ליצור מבנה סיכת שיער.

הצעד העיקרי בהליך זה הוא קשירה יעילה ובלתי משוחדת של מולקולות מותאמות לפתיחת טרמיני DNA 3-prime. מולקולות cDNA מטוהרות באורך משתנה מקשתות למתאם דנ"א יחיד עם סיכת ראש באמצעות קשירה T4 DNA. המתאם נושא רצף ברקוד אקראי של שישה נוקלאוטידים, המאפשר ניתוח כדי להקל על קשירה, ובו זמנית משמש כמזהה עבור קריאות ייחודיות.

מתאם טרמיני 3-prime נושא רווח כדי למנוע קשירה עצמית. כדי להגדיר שישים מיקרוליטר תגובות קשירת נפח סופית, להוסיף את הדברים הבאים לכל צינור PCR:שישה microliters של חיץ 10x T4 DNA ligase, עשרים וארבעה microliters של ארבעים אחוז PEG, שישה microliters של חמישה בטאין טוחנת, ארבע נקודה חמש microliters של מתאם, נקודה אחת שני microliters של רצועות DNA T4, ו 18 נקודות מיקרוליטרים של DNA. לאחר ערבוב התגובות היטב, דגירה במכונת PCR ב 16 מעלות צלזיוס לילה.

ביום שלאחר רצועות המתאם, בשלושים מיקרוליטרים של formamide המכיל מאגר טעינת ג'ל DNA לכל תגובת קשירה ומערבבים היטב על ידי כותרת צינור. מחממים במכונת PCR בתשעים וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ואז מיד לשים על קרח. השלב הבא הוא להתכונן לניתוק אלקטרופורזה של ג'ל.

מניחים יצוק מראש שישה אחוזים TBE denaturing אוריאה פוליאקרילמיד ג'ל במיכל ג'ל מתאים ולהוסיף חיץ ריצה 1x TBE. יש להפעיל מראש את הג'ל במשך עשרים דקות. לאחר מכן, השתמש במזרק ומחט מד עשרים ואחד לשטוף את כיסים ג'ל עם חיץ פועל.

לאחר מכן לטעון שלושים microliters לתוך בארות אותו לתוך שלוש בארות. מומלץ להפעיל רק דגימה אחת לכל ג'ל כדי למנוע זיהום צולב. לרוץ במשך עשרים דקות.

בזמן שהג'ל פועל, הכינו שלוש נקודות אפס חמש מיליליטר צינורות מיקרוצנטריפוגה לדגימה באמצעות מחט מזרק של עשרים ואחד מד כדי לתקוע חורים בתחתית. הכנס כל אחד מהצינורות המוכנים לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר ותייג אותם בשם המדגם בתוספת נמוך, בינוני או גבוה. כאשר חזית הצבע הכחול הכהה היא בערך באמצע הג'ל, לעצור את האלקטרופורזה ולהסיר את קלטת הג'ל.

חטטן לפתוח את הקלטת לחתוך את הג'ל אנכית עם razorblade. כדי למלמל בנדיבות את הרצועה עם שלוש בארות של דגימות טעונות. מוסיפים את רצועת הג'ל למיכל עם 1x TBE וחמישה מיקרוליטרים של כתם חומצת גרעין ציאנין ודגירה במשך שלוש עד חמש דקות.

ודא כי הכתמים מספיקים כדי לזהות בקלות את החלק העליון של המתאם החופשי שיש להסירו מאוחר יותר. לאחר מכן, לנקות את פני השטח של transilluminator אור כחול ביסודיות עם מים מזוקקים דה מיוינים. לאחר מכן מוציאים את חתיכת הג'ל ממיכל הכתמים ומ מניחים אותה על קופסת האור.

הפעל את תיבת האור ולבדוק את חומצות הגרעין המוכתמות דרך המסנן הכתום. דגימת דנ"א מגרירה מייצגת על ג'ל מוכתם, מוצגת כאן. המתאם בדרך כלל נראה עמוס מדי ורץ כמו כתם גדול עם DNA HIV1 קשור פועל מעל כמו פס.

הקווים האדומים מציינים את האתרים שיש לחתוך את הג'ל כדי להסיר מתאם חופשי, ולחלק את המדגם לשלוש חתיכות אפילו. באמצעות razorblade חדש, לחתוך את הצדדים של הג'ל אם יש אזורים ללא מדגם טעון עדיין נוכח. לאחר מכן, חותכים ממש מעל המתאם כדי להסיר את המתאם ואת חלקי ג'ל נמוך.

לבסוף, לחתוך את החלק העליון של הג'ל כולל כמילימטר אחד של כיסי ג'ל אשר לעתים קרובות יש אות אינטנסיבי חד של DNA משקל מולקולרי גבוה יותר. מחלקים את חתיכת הג'ל הנותרת המכילה את הדגימה אופקית לשלוש חתיכות אפילו. אזורים בעלי משקל מולקולרי נמוך, בינוני וגביה.

לאחר מכן, חותכים כל אחד משלושת שברי הג'ל לשניים על שתי חתיכות מילימטר ומעבירים אותם לנקודת האפס המוכנה חמש צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר. סובב במהירות שיא עם מכסים פתוחים למשך דקה אחת. כדי לסחוט את חתיכות הג'ל דרך החור לתוך הצינור שני מיליליטר כדי ליצור רפש ג'ל.

אם חלקיקי ג'ל כלשהם נשארים בתחתית הצינור של נקודת האפס חמישה מיליליטר, העבר אותם לצינור שני מיליליטר באופן ידני באמצעות מחט. התחל את הליך מיצוי ה-DNA על ידי הוספת מיליליטר אחד של חיץ מיצוי ג'ל אוריאה לתנופה ג'ל בכל צינור microcentrifuge. סובבו את הצינורות עם קצה מעל מערבל קצה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות.

הכן את עמודות הסינון. השתמש בקבוצה נקייה של פינצטה כדי להוסיף מסנן סיבי זכוכית עגול אחד קטן לכל עמוד צנטריפוגה עם מסנני קרום אצטט תאית, המונע סתימת קרום. שים את המסנן במקום עם קצה ראש צינור הפוך.

סובבו בקצרה את שני הצינורות המיליליטריים עם רפש ג'ל וחוצץ מיצוי במיקרוצנטריפוגה, והעבירו 700 מיקרוליטרים של העל-טבעי לעמודי המסנן המוכנים. צנטריפוגה עמודות המסנן במיקרוצנטריפוגה במהירות שיא למשך דקה אחת. ואז להעביר את הזרימה דרך צינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר חדש.

טען מחדש את העמודות עם העל-טבעי הנותר. נסו להשיג נוזלים רבים ככל האפשר מן רפש החילוץ ולא להיות מודאג אם חתיכות ג'ל כלולים. תסתובב שוב.

שלב את הזרימה דרך אותן דגימות חילוץ והמשך כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פרוטוקול זה הועסק בדגימות מתאים CEMS-ST נגועים ב- HIV-1 חסר Vif בהיעדר או נוכחות של החלבון האנושי האנטי-רטרו-ויראלי A3G. חלקה של המספר הכולל של קריאות ייחודיות המתקבלות מכל מדגם מצביעה על כך שרמות הולכות וגדלות של A3G מפחיתות את מספר הקריאה הכולל.

המשקף את ההשפעה המעכבת של A3G על סינתזת cdna מתווית תעתיק הפוך. בשלוש החלקות הבאות, שבר המולקולות בכל אורך אפשרי בתוך מאה שמונים ושני הנוקלאוטידים הראשונים, מוצג בהיסטוגרמות כחולות. התוספת של A3G עלתה עלייה חדה של מולקולות cdna חתוך קצר יותר בכמה תנוחות מאוד ספציפיות לשחזור.

הקווים האדומים המקווקווים, מראים את אחוזי ההקפות הנושאות מוטציות C עד T בעמדה המתאימה. שליטה חיובית יכולה להיות מיוצרת על ידי עיבוד מאגר של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים של רצף יודע, אורך וריכוז. כל המולקולות צריכות להופיע קרוב לשפע שווה עם וריאציות קטנות בלבד.

אם הפעלת ספריה יוצרת הטיית אורך משנית, ברצף, מומלץ להחיל גורם נורמליזציה הנגזר מהשיפוע המייצג את הטיית הגודל. הליך זה יכול להיות מותאם בקלות למערכות אחרות שבהן קביעת שלושת הקצוות העיקריים של מולקולות DNA יוסיף תובנות מפתח לתוך ערים של חילוף החומרים של חומצת גרעין. אנא אל תשכח כי עבודה עם HIV יכול להיות מסוכן מאוד וכמה זיהומים צריך להתבצע רק במעבדות בטיחות ייעודיות.