ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של מקרופאגים האנושית ואת ליישם את זה נחישות ההשפעה של סביבה חמצן נמוך על מקרופאג קיטוב.

אז שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה מקרופאג, כגון כיצד לאפיין את מצב ההפעלה תחת סביבה רזה ברמת החלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת את ההזדמנות לקבל ביטוי שונה של חלבונים רבים במקרופאגים אנושיים בשיטת כימות ללא תווית. הדגמת ההליך תהיה מארי מאליאר וחזור מגלי מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, להוסיף 15 מיליליטר של פתרון הפרדת תאים הדרגתי צפיפות לתוך כל אחד משני צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר, כך הפתרון יכול להתחמם לטמפרטורת החדר לפני קבלת LRSC. זה חיוני כמו צפיפות תלויה בטמפרטורה. רוקן את ה-LRSC לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

מוסיפים 1x PBS עד 50 מיליליטר ומערבבים. לאחר מכן, לאט מאוד, להוסיף 25 מיליליטר של התערובת על גבי 15 מיליליטר של פתרון שיפוע צפיפות שיווי משקל. היזהר לא לערבב את השלבים במהלך שלב זה.

יש להוסיף את הדם על פתרון שיפוע הצפיפות ללא כל הפרעה בשלב זה. צנטריפוגה שני צינורות צנטריפוגה במשך 25 דקות ב 700 G ללא הפסקות. בסוף צנטריפוגה הדרגתית צפיפות, השכבות מלמטה למעלה הם אריתרוציטים ו granulocytes, להרכיב את גלולה, שלב פתרון שיפוע צפיפות, שכבה של PBMCs, ואת הפלזמה מדולל.

עם פיפטה, לעבור את שלב הפלזמה מבלי לשוות אותו. לאחר מכן, לאסוף את שכבת PBMC לתוך צינור צנטריפוגה חדש 50 מיליליטר. הוסף עד 50 מיליליטר של PBS 1x למחשבים כמערך כביסה וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 G.Aspirate supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 40 מיליליטר של מדיום מקרופאג.

לאחר הספה PBMCs בתא Malassez, להעביר את כמות PBMCs הדרושים לביצוע הניסוי לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה התאים במשך 10 דקות ב 300 G.Aspirate supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 80 microliters של מאגר המיון לכל 10 מיליון PBMCs. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטרים של חיידקים CD14 לכל 10 מיליון PBMCs.

מערבבים היטב, ודגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמדת. לאחר הדגירה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר מיון לכל 10 מיליון PBMCs כצעד כביסה, וצנטריפוגה כבעבר. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת הכדור ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר מיון לכל 100 מיליון מחשבים אישיים.

עכשיו, למקם עמודה בשדה המגנטי של המפריד. הכן את העמודה על-ידי שטיפתה בשלושה מיליליטר של מאגר מיון. החל את ההשעיה של התא על העמודה.

לאחר מכן לאסוף את הזרימה דרך המכיל תאים לא חגורים עבור כתמים הבאים, במידת הצורך. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של חיץ מיון. היזהר לא לייבש את הטור שלך.

לאחר מכן, מניחים צינור איסוף מתחת לעמודה ומסירים אותו מהמפריד. לאחר הכביסה, פיפטה חמישה מיליליטר של מאגר מיון לתוך העמודה. מיד לשטוף את התאים המסווים מגנטית על ידי בחוזקה דוחף את הבוכנה לתוך העמוד.

לבסוף, חזור על שלבים אלה באמצעות עמודה חדשה לפני ציפוי המונוציטים וביצוע קיטוב המקרופאג' כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שמור על המונוציטים והמאקרופאגים בסביבה הנשלטת על ידי חמצן כדי לבצע ניתוח מצב היפוקסי. השתמש בתחנת עבודה היפוקסיה על מנת לשמור על תאים תחת הלחץ החלקי חמצן הרצוי במהלך הניסוי.

כאשר עובדים תחת לחץ חמצן נמוך, חשוב להכין את כל התקשורת ואת מאגרי הכביסה מתחת לתחנה, ולחכות מספיק כדי לקבל את הלחץ החלקי הנכון בנוזל. בצע תן תא במאגר מתחת למכסה המנוע המותאם. לטעון את החלבון שווה ערך של 300, 000 תאים עבור כל מדגם על 4-12%bis-tris אקרילאמיד ג'לים.

שלוט במשך הנדידה האלקטרופורטית כדי לאפשר לכל דגימת חלבון להתפצל לשש להקות ג'ל כפי שמוצג כאן. לאחר תיקון וכתמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש למלמל את רצועות החלבון באזמל נקי. קוביות כל רצועה excised לפני הצבת אותם לתוך 500 צינורות microliter.

עכשיו, לשטוף את פרוסות ג'ל שלוש פעמים ב 200 microliters של 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, השלכת אמוניום ביקרבונט בין כל צעד. בצע זאת עם שטיפה אחת ב 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט ואצטוניטריל. לאחר מכן, לייבש את חתיכות ג'ל עם 200 microliters של 100% אצטוניטריל במשך 10 דקות.

דגירה כל חתיכת ג'ל עם 10 מילימולר DTT ו 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט במשך 45 דקות ב 56 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשליך את DTT ו דגירה חתיכת ג'ל עם 55 מילימולרים iodoacetamide ב 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט במשך 35 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. כדי לעצור אלקילציה, להשליך את הפתרון בשימוש דגירה כל חתיכת ג'ל עם 200 microliters של 10 מילימולר DTT ב 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לשטוף את חתיכות ג'ל 200 microliters של 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט. לאחר מכן, להתייבש עם 200 microliters של 100% אצטוניטריל במשך 10 דקות. לעכל את החלבונים לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם טריפסין / Lys-C לערבב על פי הוראות היצרן.

יש לחלץ את הפפטידים המתקבלים מפיסות ג'ל על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של 50% אצטוניטריל למשך 15 דקות בצינורות בעלי ספיגה נמוכה. לאחר הוספת 50 microliters של 5% חומצה פורמית במשך 15 דקות, להוסיף 50 microliters של 100% אצטוניטריל במשך 15 דקות. משוך וייבש כל שבר בצינורות ספיגה נמוכה כדי להגביל את ספיגת הפפטידים ואובדן הדגימה.

אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מוצג כאן הוא טוהר מייצג מוערך על ידי cytometry זרימה בעקבות בחירת חרוזים מגנטיים של CD14 מונוציטים חיוביים. הדמיית ניגודיות פאזה של מקרופאגים אנושיים מובחנים מראה הטרוגניות של מורפולוגיות שהושגו עבור שני קיטובים שונים לאחר תשעה ימים של תרבות.

דוגמה לעיכול מחוץ לג'ל באמצעות ג'לים דף SDS מוכתמים כסף מוצג. הערכה של חלבון מתזה התא ולאחר עיכול בתסיסה מראה את היעדר השפלה במהלך תזה ואת היעילות של העיכול. מוצג כאן דוגמה של ספקטרום דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות של פפטיד נמצא ביחס מסה לטעינה של 597.29 על הספקטרום MS עם מטען חשמלי של חיובי שני.

מתוך ספקטרום זה, הרצף המתאים נקבע. התוצאה הסופית לאחר הניתוח היא מפת חום המייצגת את הקיבוץ ההיררכי של כל מצבי הקיטוב באמצעות חלבונים המובעים באופן דיפרנציאלי. ניתוח מגלה מקבץ של חלבונים יתר על כן לידי ביטוי בכל הקיטובים במצב 3%חמצן.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי אתה צריך להחליט תחילה איזה סוג של שבר תבצע על דגימות חדשות כדי להתאים את הפרוטוקול שלך בהתאם. הגישה הפרוטומית המשתמשת בעבודה זו משלימה גישות גנומיות ששימשו בשנים האחרונות בתחום מחקרי הקיטוב בביולוגיה מקרופאגים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקר בתחום האימונולוגיה לחקור את מצבי ההפעלה השונים של תאי החיסון בבני אדם וגם ביונקים אחרים.

אל תשכח כי עבודה עם DTT יכול להיות מסוכן אז אתה צריך לעבוד תחת מכסה המנוע מותאם לעשות את ההליך הזה.