אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

שיטה זו מטפלת בבעיה נפוצה בתחום ומספקת זרימת עבודה מלאה לבידוד ואפיון מהירים של דם חוץ-תאי יחיד עם סמנים ספציפיים של עניין. ניתוח מעקב חלקיקים הוא שיטה חצי אוטומטית. הוא מנצל את המאפיינים של פיזור אור ותנועה בראונית כדי לנתח את התפלגות הגודל של ארסים חוץ-תאיים.

הדגימה של ההליך תהיה ורה שמידט, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. כדי לבודד את הווסקולים החוץ-תאיים, לאחר איסוף שתי דגימות מיליליטר של דם שלם אנושי לצינורות מפרידים בסרום, אפשר לדגימות להתקרש במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני הפרדת התאים מהנסיוב על ידי צנטריפוגה. להעביר מיליליטר אחד של סרום מכל מדגם לתוך צינורות תגובה בודדים 1.5 מיליליטר עבור צנטריפוגה כדי להסיר את טסיות הדם, ולהעביר 100 microliters של טסיות פלזמה עניים חדש 1.5 צינורות תגובה מיליליטר.

לאחר מכן, להוסיף 25 microliters של פתרון משקעים אקסוזום לפלזמה ומערבולת הדגימות ביסודיות. לאחר דגירה של 30 דקות על קרח, לאסוף את הווסיקים חוץ תאיים על ידי צנטריפוגה. גלולה יופיע בצבע בז ' או לבן.

שאף את העל-טבעי ודגום שוב את הדגימה. לאחר מכן, להסיר את כל טראנסים של נוזלים resuspend גלולה ב 100 microliters של PBS. כדי להכתים את קרום התא של הווסיקים, להוסיף 10 microliters של ההשעיה EV ל 50 microliters של פתרון צבע אתנולית PKH67 טרי מוכן ומערבבים ביסודיות.

לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך, לדלל 50 microliters של ההשעיה חוץ תאית מוכתמת עם 2.5 מיליליטר של מים מזוקקים בצינור חרוט 15 מיליליטר, עם ערבוב יסודי. כדי לתייג את הווסיקים בנוגדנים, לדלל 10 עד 20 מיקרוליטרים של ההשעיה החוץ-תאית הבלתי מוכתמת עם 50 מיקרוליטרים של מים מזוקקים בצינור תגובה של 1.5 מיליליטר, עם ערבוב יסודי. הוסיפו 2.5 עד 5 מיקרוליטרים של הנוגדן המעניין את צינור התגובה, עם ערבוב יסודי, עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר מכן, להעביר 50 microliters של וקסיקים שכותרתו צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל את נפח הניסוי המתאים של מים מזוקקים, עם ערבוב יסודי, כפי שצוין בטבלה. לפני ניתוח וריקולים חוץ-תאיים מוכתמים או מסומנים, העבר תחילה את מסנן הפלואורסצנטיות לנתיב האופטי של המיקרוסקופ והמצלמה והתחל את התוכנית, בהתאם להוראות המופיעות על המסך ליישום אוטומטי. תחת הכרטיסיה בדיקת תאים, בחר את מספר התא הנכון למדידת פלואורסצנטיות ואת מיקום הייחוס עבור האופטיקה, כדי לאשר שהלייזר והמיקרוסקופ נמצאים במוקד משותף.

השתמש במזרק כדי לשטוף את ערוץ התא עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים, דואג כי תא המדידה הוא ללא בועות אוויר, כי בועות אוויר אינם מוזרקים לתוך המערכת. לאחר מכן, לדלל 10 microliters של 200 ננומטר בגודל חלקיקי פוליסטירן שכותרתו 990 microliters של מים מזוקקים ולהוסיף 10 microliters של מתלה חלקיקים זה לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מים מזוקקים. לאחר מכן, להזריק 2.5 מיליליטר של פתרון החלקיקים מדולל הראשון לתוך ערוץ התא ולחץ על מטב פוקוס כדי להתאים את המצלמה.

כדי למדוד את המדגם, לשטוף את ערוץ התא מספר פעמים עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים ולהזריק את ההשעיה ורידים חוץ תאיים מוכתמים. באמצעות מיקום ההפניה, התאם את פרמטרי הרכישה המתאימים תחת הכרטיסיה בדיקת תא, כפי שמצוין בטבלה. כדי לזהות את טווח הרגישות האופטימלי, לחץ על מספר החלקיקים לעומת.

רגישות, כדי להציג עקומה של החלקיקים שנמדדו לכל מסך עבור רמות רגישות שונות. עבור הפרמטר Shutter, התאם את פרק הזמן שהמצלמה מאפשרת לאור לעבור למשך מרווח זמן נחוש. עבור הפרמטרים Postacquisition, בחר בהירות מינימלית של 20, גודל מינימלי של 20 ננומטר, וגודל מדידה מרבי של 500 ננומטר.

שים לב למספר החלקיקים שזוהו בשדה התצוגה. בר פיזור צריך להיות בירוק לכתום, 50 עד 300 חלקיקים טווח. לחץ על בדוק סחף חלקיקים באפס וולטים ופתח את הכרטיסיה מדידה.

לחץ על הפעל רכישת וידאו והגדר את מספר הניסויים לשלוש עד חמש, ואת השהיית הזמן בין הניסויים לאפס דקות. הגדר את מספר מיקומי תת-התת-וולטום הבודדים ל- 11 ואת מספר מחזורי המדידה ל- 10 בכל מיקום מדידה שבו יש לנתח את החלקיקים. לאחר מכן, בחרו תיקייה, צרו שם קובץ חדש ולחצו על 'אישור' כדי להתחיל את המדידה.

בסוף הניתוח, פתח את הכרטיסיה ניתוח כדי לסקור את התוצאות. לאחר מכן, בדוק את המספר הממוצע של חלקיקים לכל מיקום, את המספר הכולל של חלקיקים נעוצים וריכוז החלקיקים, את רוחב ההתפלגות של החלקיקים, ואת הערך של הממוצע, ואת סטיית התקן. באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים להתאמה וכיול של המדידה נותן רגישות הגדרה אופטימלית של 85% באמצעות הגדרות אלה, המצלמה מציגה תמונה חדה ומדידות חוזרות להפגין סטיית תקן נמוכה.

כתמים בערכת מקשר תאים הכוללת מקשר תאים פלואורסצנטי המשלב צבע פלואורסצנטי ירוק עם זנבות ארוכים ועליפטיים לאזורי השומנים של קרום התא, מגלה מתאם חזק בין הרגישות למספר החלקיקים שנמדדו. נוגדן מכתים חוץ-תאי נגד חלבון מעניין מצביע על התפלגות חלקיקים מ-220 ל-1,145 ננומטר, עם גודל מרבי שיא של 541 ננומטר. לא מזוהים חיידקים חוץ-תאיים לאחר כתמי נוגדנים של מים נטולי חיידקים, עד לרגישות הקרובה ל-100% אם המדידה מתחילה כאשר הסחף גדול מ-5 מיקרומטר לשנייה, החזרה האישית מדגימה סטיות ברורות.

חשוב לציין כי שימוש פלואורסין isothiocyanate כמו פלואורוכרום תוצאות מדידות לא מדויקות ובלתי ניתנות להפקרה, כמו פלואורופור זה נוטה פוטובלצ'ים מהירים. פרוטוקול זה עונה על הביקוש המוביל של חוקרים רבים בתחום זה לאפיון מהיר של וריקולים חוץ-תאיים בודדים, באמצעות סמנים ספציפיים. למרות העובדה כי בעשור האחרון, שיטות השתפרו במידה ניכרת, עדיין אין פרוטוקול סטנדרטי לניתוח של דם חוץ תאי יחיד.

ללא קשר להתקדמות עתידית של המחקר על ביולוגיה חוץ-תאית של הגוף, שיטה זו מספקת פרוטוקול מהיר ואמין לאפיון ורי דם חוץ-תאיים בודדים באמצעות סמנים ספציפיים. מכיוון שהפרוטוקולים הנוכחיים שלנו אינם כרוכים בזמני עיבוד ארוכים או בצעדים עתירי עבודה, הם מתאימים גם לתפוקת מדגם גבוהה.