ג'יברלין הסלולר להמחיש רמות שימוש באנרגיה תהודה פורסטר NlsGPS1 העברה (סריג) ביוסנסור

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום פיתוח הצמח לגבי התפלגות פיטוהורמונים רגולטוריים צמיחה. באמצעות biosensors FRET מקודד גנטית, למשל nlsGPS1 אשר מזהה ג'יברלינים, ניתן למדוד את ההתפלגות הדינמית של תרכובות חשובות ברקמות Arabidopsis בתת הפתרון התאי. בדרך כלל, אנשים חדשים בעניין זה יתקשו, כי ניתוח BIOSENSORS FRET כרוך הדמיה יחס אשר הגביר רעש צעדים אנליטיים נוספים לעומת הדמיה מטרי כוונה.

התחל על ידי זריעת כ 20 זרעי Arabidopsis מעורק על 1/2 Murashige ו Skoog או MS אגר צלחות מרובעות. לאטום את הצלחות עם סרט כירורגי נקבוביות ולעטוף אותם עם רדיד אלומיניום במשך יום עד שלושה ימים של דגירה בארבע מעלות צלזיוס עבור ריבוד. להדמיית שורש, מעבירים את הלוחות לתא צמיחה בכיוון אנכי למשך שלושה ימים בתנאים שצוינו.

עבור Hypocotyl כהה, להעביר את הצלחות לתא הצמיחה עבור פעימת אור של שעה עד ארבע שעות כדי לסנכרן את הנביטה. לאחר מכן לעטוף את הצלחות עם רדיד אלומיניום, ומ מניחים אותם לתוך תא הצמיחה בכיוון אנכי במשך שלושה ימים. למדידות מצב יציבות, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פתרון מדומה לשקופית מיקרוסקופ נקייה והניחו בעדינות שלושה חיישן תפיסת ג'יברלין מקומי גרעיני אחד או nlsGPS1 המבטא שתילים על השקופית.

ואז לזהות טיפה שומן ואקום בכל פינה של להחליק כיסוי נקי בעדינות מקום לכסות להחליק על השתילים. בזהירות הוספת פתרון מדומה נוסף כדי להסיר את כל בועות האוויר לפי הצורך. לפני טיפול gibberellin ארבע או GA4, להשתמש מזרק 20 מיליליטר מלא גריז ואקום מצויד קצה פיפטה 200 מיקרוליטר שונה עם פתח בקוטר מילימטר אחד כדי לצייר שכבות אחידות שלושה וחצי ס"מ ארוך על ידי שני סנטימטר וחצי מלבן רחב על מגלשת זכוכית נקייה.

הוסף 50 microliters של פתרון מדומה למרכז המלבן ולהשתמש מדפים נקיים להרים nlsGPS1 הבעת שתילים על ידי החלק התחתון של הקוטילדונים שלהם להעברה זהירה לתוך הפתרון מדומה. מניחים כתם כיסוי הבחין עם שומן ואקום כפי שהוכח רק למרכז מלבן גריז ואקום בזהירות למלא את המאגר עם פתרון מדומה נוסף מבלי להפריע השתילים. לאחר מכן לרכוש תמונות של שתילים על מיקרוסקופ confocal מצויד לייזרים מתאימים עבור CFP מרגש ו YFP לבצע הדמיה העברת אנרגיה תהודה פורסטר.

עבור GA4 לטיפול, להסיר את המחווה מן שלב מיקרוסקופ ולהגדיר טיימר במשך 20 דקות. הסר מיד את הפתרון המדומה מהצד הימני של החלקת המכסה תוך הוספת 17 מיקרוליטרים של נוזל טרשת נפוצה אחד בתוספת GA4 מיקרו טוחן אחד בצד שמאל של החלקת הכיסוי עד שכל הפתרון המדומה הוחלף. לאחר מכן מניחים את החלקת הזכוכית בחזרה לשלב המיקרוסקופ ומחכים עוד 10 דקות לפני רכישת תמונת הטיפול לאחר GA4.

כדי לקבוע מסלול זמן לרקמה מעניינת, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של פתרון מדומה למרכז ערוץ הזלבה של מגלשה דביקה איבידית, והניחו בעדינות שתילי nlsGPS1 בתסומה המדומה כפי שהוכח. השתמש במקלפים כדי למקם בעדינות להחליק כיסוי על השתילים באמצעות החלק האחורי של המקלות כדי ללחוץ בעדינות על הקצוות החיצוניים של החלקה המכסה עד שהוא יוצר קשר חזק עם החומר הדביק על הפריפריה של החלקה דביקה. לאחר מכן, השתמש בשני מחברי לוטר בקוטר פנימי בקוטר 0.8 מ"מ ובפיסת צינורות סיליקון בקוטר פנימי של 0.8 מילימטר כדי לחבר את השקופית הדביקה למזרק 20 מ"מ מלא בתתכנון מדומה ולחבר את השקופית למיכל שקע לאיסוף פתרון הזרימה.

בעדינות לדכא את הבוכנה כדי לוותר על פתרון מספיק לתא כדי להבטיח כי אין בועות אוויר ולאחר מכן לטעון את המזרק על משאבת מזרק ניתנת לתיכנות. ואז להתחיל את המשאבה כדי ליזום את קורס הזמן. עבור טיפולי GA4 במהלך קורס הזמן, השהה את המשאבה כדי לעצור את הזלוש ולהחליף את המאגר המדומה המכיל מזרק עם מזרק מלא בנוזל טרשת נפוצה אחד בתוספת GA4.

לניתוח תמונה תלת-מימדית, יבא את הקבצים לתוכנה לניתוח תמונות IMARIS ופתח את אשף המשטחים. הגדר את חיסור הרקע לשלושה מיקרון ואת הסף כברירת מחדל. במהלך פילוח הגרעינים יש לדאוג לא לכלול את הגרעינים הרבים עם פלואורסצנטיות עמומה כמו הקצבת אות לרעש של האובייקט עם רמות רקע קרובות של אות יהיה נמוך מדי עבור ניתוח תמונה יחסמטרי.

לאחר מכן מסווה את ערוצי פליטת CFP ו- FRET בהתבסס על המשטחים שנוצרו באמצעות פליטת YFP. השתמש בהרחבת יחס העוצמה של XT כדי לחשב יחס של פליטת מקבלי העירור של התורם חלקי פליטת תורם העירור בין ערכי העוצמה הממוצעים של המשטחים הבודדים בשני הערוצים. לצבוע את המשטחים הבודדים ביחס פליטת nlsGPS1, בחרו קידוד צבע עם סטטיסטיקה והגדירו את יחס העוצמה הממוצע כסוג הסטטיסטיקה.

תחת סמל הסטטיסטיקה, יצא את היחסים בין ערכים בודדים מהטבלה והעתק והדבק את הערכים בגיליון אלקטרוני לייצוג גרפי של הנתונים. בשורש Arabidopsis, שיפוע יחס הפליטה nlsGPS1 מעיד על רמות GA4 נמוכות באזורי המריסטיקה והחלוקה ורמות GA גבוהות באזור התארכות מאוחר. לעומת זאת, שיפוע יחס פליטה אינו נצפתה בשורשים שאינם מגיבים nlsGPS1, מה שמרמז כי שיפוע GA4 אנדוגני אינו חפץ.

שיפוע יחס פליטה nlsGPS1 נוצר גם hypocotyls כהה עם רמות נמוכות ב cotyledons ואת וו טיפוסי רמות גבוהות באזור הבסיסי התארכות במהירות של hypocotyl. לעומת זאת, שיפוע יחס פליטה אינו נצפה בהיפוקוטילים שאינם מגיבים nlsGPS1. יתר על כן, GA4 המסופק באופן אקסוגני מצטבר באופן מועדף באזור התארכות בהשוואה לאזור החלוקה של שורש Arabidopsis המציין כי nlsGPS1 יכול לשמש לחקר דפוסים אנדוגניים אקסוגני GA.

בנוסף, ניתוח קורס זמן של שתילי NLSGPS1 שטופלו GA4, מגלה הצטברות מהירה יותר של GA4 אקסוגני בהארכת השורש כך בהשוואה לאזור החלוקה. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להימנע פיקסלים רוויים במהלך ההדמיה הכמותית כדי לשמור על הפרמטרים הדמיה קבוע כדי למזער את הסחף ואת בעיות שינוי המוקד במהלך חליטה מדגם. בעקבות הליך זה שיטות מפורטות, כמו הדמיה שורשים הגדלים במכשירי שפע של סוג שבב שורש יכול להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות על איך שיפוע GA לשנות טיפים שורש Arabidopsis גדל בשיעורים שונים או בתגובה ללחץ לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום צמיחת הצמח לחקור את ההתפלגות הדינמית של ג'יברלינים ברקמות ואיברים נוספים Arabidopsis thaliana.