Name: בעזרת פחמון זקן התירס כמו סוס טרויאני ב באתרו משלוח של תירס חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: למדו את שיטת הסוס הטרויאני לחקר חלבונים מופרשים בתירס באמצעות זקן התירס. גישה זו מאפשרת מסירה in situ של חלבונים לרקמות שונות ומפשטת את חקר אינטראקציות צמח-פתוגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות דרסלהאוס תומאס, מרטין Parniske, אופיר לא משנה Djella וארמין הילדברנד למתן שטח מעבדה וחומר צמח. היצירה המקורית על שיטת סוס טרויאני נתמכה על-ידי מלגת פוסט דוקטורט Leopoldina אכ מ פרויקט IOS13-39229. העבודה שהוצגו במאמר זה נתמך על ידי SFB924 (פרויקטים A14 ו B14) של DFG.

1. בניית סוס טרויאני זקן התירס U.
הערה: ראה איור 1.
<ol><li>להגביר את הגן ריבית cDNA תירס באמצעות תחל גנים ספציפיים של פולימראז DNA ההגהה. לשכפל את מוצר ה-PCR ראשי ולשנות צורה הבונה של e. coli הספק פלסמיד ההוראות. ודא את הגן הנכון של עניין רצף מאת סנגר רצף לפני השימוש על שיבוט השלבים הבאים. הערה: מפרט PCR צריך להיות מותאם בשל פריימר רצף specificities ואת תנאי ריאקציה אופטימליים DNA פולימראז.</li>
	<li>עיצוב תחל כדי להגביר את הגן תירס עניין ללא רצף קידוד האות פפטיד (SP).</li>
	<li>להאריך בסוף 5´ הראשיים הפוך. עם מוטיב RSIATA, של המפקדיםאני חותכת האתר (טבלה 1).</li>
	<li>להגביר את הגן תירס עניין עם פולימראז DNA ההגהה באמצעות PCR הבונה המופקים 1.1 כתבנית PCR.</li>
	<li>זוגיות-תקציר המוצר PCR ואת פלסמיד טרנספורמציה זקן התירס בארצות הברית , p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, עם Xba, ואני המש אני לטהר את מוצר ה-PCR מתעכל ואת פלסמיד.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים את המוצר PCR מתעכל לתבנית p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha באמצעות T4 DNA ליגאז ההוראות manufacturer´s. להפוך את המוצר מצדו e. coli ולאמת את הגן הנכון של עניין רצף מאת סנגר רצף.</li>
	<li>Linearize את p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmגנים של עניין-mCherry-Ha עם האנזים הגבלת Sspאני והמרה DNA לתוך ארה ב solopathogenic זקן התירס זן SG20016. לבודד transformants זקן התירס בארצות הברית לפי בחירה carboxin ואשר transformants מבודדים על ידי הדרומי כתם ניתוח16. הערה: כל החלבונים של עניין, עצמאית לפחות שלושה זקן התירס U. transformants צריך להיות מבודד וניתח להעריך כל תופעות פנוטיפ של מוטציות אקראי הרקע.</li>
</ol>2. תרבות המדיה
<ol><li>להכין YEPSlight נוזלי בינוני16: תמצית שמרים 1.0% (w/v), 0.4% (w/v) מה נשארתי-Peptone ו- 0.4% (w/v) סוכרוז. להמיס כל הרכיבים ב- ddH2O והחיטוי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; autoclaving בטמפרטורה גבוהה, לתקופה ארוכה יותר של זמן או שוב ושוב יפחית את האיכות של המדיום.</li>
	<li>להכין תפוחי אדמה-dextrose-אגר (PD-אגר)20: אגר דקסטרוז 3.9% (w/v) תפוחי אדמה ו- 1.0% (w/v) M טריס-HCl 1 pH 8.0 (פ. צ. ז 0.01). לערבב את כל הרכיבים ישירות בתוך בקבוק autoclaving ולהוסיף ddH2O ובנוסף בר מערבבים מגנטי. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; autoclaving בטמפרטורה גבוהה, לתקופה ארוכה יותר של זמן או שוב ושוב יפחית את האיכות של המדיום.</li>
	<li>להכין PD-פחם אגר20: 3.9% (w/v) תפוחי אדמה דקסטרוז אגר, פחם 1% (w/v) ו- 1.0% (v/v) M טריס-HCl 1 pH 8.0 (פ. צ. ז 0.01). לערבב את כל הרכיבים ישירות בתוך בקבוק autoclaving ולהוסיף ddH2O ובנוסף בר מערבבים מגנטי. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; autoclaving בטמפרטורה גבוהה, לתקופה ארוכה יותר של זמן או שוב ושוב יפחית את האיכות של המדיום.</li>
</ol>3. הצמח זיהום
<ol><li>בצע ניתוח של חלוקת התא תירס בתגובה סוס טרויאני נמסר חלבון (למשל, תא מבוסס מיקרוסקופיה לספור) מראש. זקן התירס בארצות הברית -induced התפשטות תאים תירס ומתחילה היווצרות הגידול הבאים סביב 4-5 ימים שלאחר זיהום. מחלת כמותיים הערכות תלויי-רקמות, יש לבצע 6 לזיהום פוסט 14 ימים. הערה: הזנים תירס ברורים מראים רמות שונות של רגישות לזיהום זקן התירס בארצות הברית . תירס cלעומת W23, A188, Gaspe פלינט, בנטם הזהב מוקדם או Va35 להראות רגישות לכיוון הפתוגן הזה, ולכן הם הזנים מתאימים ללימודי הסוס הטרויאני.</li>
	<li>הכנת inoculum זקן התירס U.
	<ol>
<li>כוללות המתח קדמון SG200 פקד שלילי בניסויים כל סוס טרויאני כדי לאמוד את תופעות לוואי על הזיהום על ידי המתח מהונדס. . הנה, תשתמש זן U. זקן התירס לבטא גרסה שאינו מופרש החלבון עניין כפקד שלילי. עם זאת, מטעמים של practicability (למשל, הקרנות גדול יותר), המתח קדמון עשוי להיות בחירה קלה יותר של שליטה.</li>
		<li>לפני תחילת הניסוי, להעריך איזה כמויות של זיהום תרבות נדרשים. זכור כי זיהום של כל צמח דורש 1-1.5 מ"ל של ההשעיה זקן התירס U. תלוי בסוג הרקמה תירס. הערה: כ- 1 מ של תרבות לילה מספיקה לדילול כדי OD600 0.2 ב 20 מ של YEPSאור בינוני, 25 מ של תרבות זקן התירס בארצות הברית עם יתר600 של 0.8-1.0 מספיקים. זיהום של הצמחים 13-16.</li>
		<li>גירוד U. זקן התירס של אגר PD צלחת באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר, לחסן ב 5 מ של YEPSאור בינוני ותנו התרבות לצמוח ב 28 ° C עם טלטול מתמיד ב- rpm 200 עבור 16 h.</li>
		<li>לפני ההדבקה, לבחון את התרבות חיסון זקן התירס בארצות הברית על ידי מיקרוסקופ אור רגיל עבור צמיחה נכונה וזיהום חיידקי בהגדלה X 400. הערה: בתרבות מתאימים, רק ופטריות בצורת סיגר הוא גלוי (איור 2).</li>
		<li>לערבב µL 900 של טרי YEPSאור עם 100 µL של התרבות לילה, למדוד את יתר600 באמצעות YEPSאור בינוני ריקים בניתוח ספקטרופוטומטרים.</li>
		<li>לדלל את התרבות לילה עם בינונייםאור YEPS טריים יתר600 של 0.2 ולתת את התרבות לצמוח ב 28 ° C עם טלטול מתמיד ב 200 סל ד עד שהגיע שלב הצמיחה באמצע יומן שמציין OD600 nm של 0.8-1.0. הערה: U. זקן התירס תאים כפול כל 2 h בתנאים אלה, ובכך מתמלאת ה OD הרצוי600 לאחר 4-5 שעות של טיפוח-תרגול.</li>
		<li>לקצור את התאים על יתר600 של 0.8-1.0 מאת ספינינג ב x 3000 g 10 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
		<li>שטיפת בגדר תא פעם אחת עם ddH2O. למטרה זו, תרבות אחת, נפח ddH2O, ספין עם 3000 x g 10 דקות להוסיף ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא בקפידה ddH2O בעזרת פיפטה של 20-מ ל זכוכית, ובכך התאמת ה OD סופית600 ל 3.0 (עבור וזמינותו סוס טרויאני) או 1.0 (עבור דירוג המחלה).</li>
	</ol></li>
	<li>אימות של הסוס הטרויאני: ב הפיסקו הפרשת החלבון פיוז'ן תירס
	<ol>
<li>להדביק שתילי תירס עם זן סוס טרויאני17.</li>
		<li>לבצע הדמיה מיקרוסקופיים של שתילי נגועים ב- 2-3 ימים שלאחר זיהום באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. לשם כך, בלו חתיכה מלבנית של 1 ס מ מתחת לנקודה של הזרקת העלה, למקם את הדגימה לשקופית מיקרוסקופ, להוסיף טיפה של ddH2O. כדי להמחיש חלבון כימרי mCherry, לרגש הדגימה-λ = 561 nm ו הפקת הרשומה בλ = 580-630 ננומטר.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהום של עלים תירס למבוגרים
	<ol>
<li>לטפח צמחי תירס לשלב של עלים בוגרים (כאשר לפחות העלה 7 גדל בתוך הקנה). הערה: בשלב זה ניתן להגיע לאחר ארבעה שבועות בעת הזריעה בתנאים החממה של 14 h. h יום/10 28 ° C, 22 ° C בלילה קצב באמצעות cv. W23. משך הזמן עשוי להשתנות עם התנאים לדבורי ו החממה תירס.</li>
		<li>העברת התרבות זקן התירס בארצות הברית (ראה 3.2.9) לתוך מזרק 3-mL עם מחט תת-עורית 20G x 1.</li>
		<li>לחץ על הקנה בקפידה כדי להתאים לשפה הרקמה meristem בתוך הקנה. הבסיס של meristem ניתן לזיהוי על-ידי מעבר גבעול קשה יותר לרקמות רך יותר.</li>
		<li>סמן את meristem על הקנה באמצעות עט.</li>
		<li>להזריק 1.5 מ ל U. זקן התירס תרבות 1 ס מ מעל meristem לירות או meristem תפרחת.</li>
		<li>שיעור תסמיני המחלה ב 6 ו 12 ימים שלאחר זיהום.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהום של גדילים
	<ol>
<li>לגדל צמחים תירס עד שהגיע השלב ציצית. הערה: לוח זמנים מפורט לפיתוח בצרכן, ציצית תירס cv. W23 היה שתואר לעיל1819. הגדילים המכיל פורים מראש meiotic מאוד רגישים לזיהומים זקן התירס בארצות הברית ; cv. תירס W23 גדילים הם בגודל של 4-7 ס מ.</li>
		<li>לחץ על הקנה בקפידה כדי להתאים לשפה של ציצית בגזע.</li>
		<li>סמן את הטיפ ובסיס ציצית על הגזע באמצעות עט.</li>
		<li>העברת התרבות זקן התירס בארצות הברית (ראה 3.2.9) לתוך מזרק 3-mL עם מחט תת-עורית 20G x 1.</li>
		<li>להזריק 1.5 מיליליטר inoculum מסביב ציצית. כדי להבטיח חלוקה שוויונית של inoculum, לאט במקום 0.5 מ ל כל אחד הטיפ, החלק האמצעי, ועל בסיס ציצית מסומן באמצעות העט.</li>
		<li>שיעור תסמיני המחלה ב 10 ימים שלאחר זיהום.</li>
	</ol></li>
	<li>דלקת אוזניים הערה: התפתחות רקמת האוזן שונה ברורים תירס הזנים ותנאי החממה, יש להקפיד בקפידה לפני חיסון. האוזניים החל מתגברים על בדי משי הם רגישים מאוד לזיהומים זקן התירס בארצות הברית .<ol>
<li>העברת התרבות זקן התירס בארצות הברית (ראה 3.2.9) לתוך מזרק 3 מ עם מחט תת-עורית 20 G x 1.</li>
		<li>להחדיר את המחט חיסון לתוך הרווח בין העלים קליפה עמוק ככל האפשר מבלי לפצוע את האוזן.</li>
		<li>שחרור 1.5 מיליליטר inoculum סביב האוזן.</li>
		<li>הסר את המזרק בתוספת המחט ועיסוי בקפידה קלח להפיץ את הפתרון זקן התירס בארצות הברית באותה מידה.</li>
		<li>שיעור תסמיני המחלה ב 14 ימים שלאחר זיהום.</li>
	</ol></li>
	<li>לאשר את הכדאיות של זקן התירס בארצות הברית inoculum
	<ol>
<li>ירידה µL 10 של inoculum על צלחת אגר פחם PD, דגירה בטמפרטורת החדר במשך יומיים. הערה: אם בהתאמה זקן התירס U. תרבות היא היכולת טופס חוטים, תפטיר רך, לבן הופך גלוי (איור 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+tumour%3A+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+a+maize+plant%3A+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep1%2C+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.%2C+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290(2009).</li>
<li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li>
<li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355(2014).</li>
<li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177(2013).</li>
<li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li>
<li>Juárez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut+%28%27Huitlacoche%27%29+as+a+new+platform+for+oral+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535(2015).</li>
<li>Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarkari%2C+P+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).</li>
<li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+%28Zea+mays%29+anther+cell+behavior+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li>
<li>Bösch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522(2016).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li>
<li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li>
<li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Maydica%22%5BJournal%5D)">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34(2015).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Bacteria%2C+Bacteriophages%2C+and+Fungi%3A+Volume+1%22">Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1</a>. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).</li>
<li>Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li>
<li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li>
<li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

חיתוך מודרני מחקר דורשת פרוטוקולים עבור ניתוח מולקולרית על גנטי ורמות החלבון. נגישות גנטי באמצעות טרנספורמציה אינה זמינה או לא יעיל ולגזול עבור רוב היבול מינים כגון תירס. יתר על כן, כלי אמין גנטיות כגון מערכות כתב יזם הם נדירים, מה שהופך את זה קשה ללמוד באתרו וחלבון לתפקד עם רזולוציה גבוהה ייתכן באתרים רקמות שונות. Apoplastic חלבונים יכולים להילמד על-ידי הסתננות של חלבונים heterologously ביטוי וטיהר לתוך הרקמות. עם זאת, למרות ההתקדמות בביטוי חלבונים heterologous, יישוב חדירה לרקמות חיתוך נשאר קשה ולא לעתים קרובו...

המחלה biotrophic פחמון זקן התירס הוא סוכן סיבתי של המחלה הזימה תירס1. הוא מדביק כל החלקים אווירי של תירס וכתוצאה מכך גידולים גדולים שמכילים נבגים melanized, שחור. ברמה הגלובלית, זקן התירס בארצות הברית מעריכים כי לגרום אובדן שנתי של 2% תשואה תירס, בעוד גידולים מוערכים כמו למעדן גסטרונומי במקסיקו. צמח זיהום הוא שיזם appressorium מפריש אנזימים lysing דופן התא לחדור את השכבה הראשונה של תאים אפידרמיס תירס. מאתר זיהום ראשי, U. זקן התירס גדל intracellularly, intercellularly, פולשים תא אחד או שניים שכבות כל יום1,2. התוצאות זיהום מוצלחת בהיפרטרופיה צמח זה הופך גלוי גידולים על חמישה ימים פוסט זיהום-1,-3,-4. לאורך כל שלבי הזיהום, הפטריה invaginate קרום הציטופלסמה הצמח ללא מגע ישיר ל-1,הציטופלסמה מארח2. הרווח apoplasmic הדוקה בין hyphae המזהם את קרום פלזמה הצמח נחשב האתר המארח/פתוגן אינטראקטיבי, נקרא האזור האינטראקציה biotrophic. כדי להתגבר על מערכת החיסון המולדת צמח, זקן התירס בארצות הברית מפריש מערך של חלבונים אפקטור לתוך אזור האינטראקציה biotrophic1. כמה effectors נתפסות על ידי תאי צמחים, ואילו אחרים נשארים biotrophic אינטראקציה אזור5,6,7,8. אפקטור apoplastic אחד הוא UmPit2, אשר מקיים אינטראקציה עם apoplastic תירס פרוטאזות למניעת המהדורה של ה-פפטיד ZmZIP1 מ- ZmPROZIP על ידי apoplastic פרוטאז פעילות9,איתות10.
בעשורים האחרונים, זקן התירס בארצות הברית נעשו לא רק למודל גנטיקה פטרייתי באינטראקציה צמח-פתוגן, אלא גם כלי חשוב בתחום הביוטכנולוגיה עקב מחזור חיים מובנות, נגישות קלה גנטית והוא מופרש heterologous ביטוי חלבונים11,12,13. אותות עבור שניהם הפרשת חלבון קונבנציונאלי ובלתי קונבנציונאלי שנקבע המאפשר השליטה של שינויים posttranslational14. לאחרונה, זקן התירס בארצות הברית היה מועסק כלי סוס טרויאני ללמוד קטן, מופרש חלבונים תירס באתרו15. הגישה סוס טרויאני שימש בהצלחה כדי לנתח את תפקוד החלבון קטן, המופרש ZmMAC1 המעורב בפיתוח בצרכן. ZmMAC1 גורם חלוקת תאים pluripotent מפרט הגורל התא של תאי שהוקם15periclinal. באותה שיטה, תפקוד ביולוגי תירס נזק-הקשורים פפטיד ZmZIP1 נחשף. זקן התירס בארצות הברית מפריש את תירס ש-zmzip1, גרמו נפגעת היווצרות הגידול10. לפיכך, מייצג גישה סוס טרויאני מסלול חלופי בעל ערך חלבון במחקרים באתרו עם רזולוציה גבוהה ייתכן שעושה גם דורשים דור של קווים טרנספורמציה תירס יציב ולא חדירה לרקמות עם heterologously ביטוי וטיהר חלבונים. בפרט, האסטרטגיה סוס טרויאני מאפשר ההפרשה של כל חלבון heterologous לתוך אפופלסט תירס השוואה ישירה של נגועים לעומת צמח לבריא תאים בתוך הרקמה זהה.
פרוטוקול זה ממחיש את השלבים העיקריים ליצירת זן סוס טרויאני זקן התירס בארצות הברית ללמוד חלבון עניין. כוללת מידע מדויק על נוהלי זיהום של שלושה סוגים של רקמות תירס שונים (עלים בוגרים, גדילים, האוזניים) עם זקן התירס בארצות הברית, אשר הינה תנאי לימוד הפונקציה התקדמות, חלבון ייתכן זיהום ברקמות המטרה אלה. לא מפרטים נוספים הינם נתון על תירס גנטי הגברה מיקרוסקופיים הדמיה טכניקות, מאז השלבים במטרה הינם תלויי-כלי נגינה. לפיכך, פרוטוקול זה מיועד למשתמשים מנוסים של ביולוגיה מולקולרית סטנדרטי טכניקות.

<table><tbody><tr><td>מזרק 2 מ"ל&nbsp;</td><td>ב. בראון</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 גרם x 1 1/4 מחט היפודרמית</td><td>ב. בראון</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>cDNA מתירס</td><td></td><td></td><td>מרקמת תירס המבטא את הגן של interrest</td></tr><tr><td>פחם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> סריקת לייזר קונפוקלי <td>משתמש בציוד זמין מקומי</td></tr><tr><td>Cuvette (10 מ"מ x 4 מ"מ x 45 מ"מ</td>) <td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור-שייקר מוגדר ל-28 מעלות; C, 200 סל"ד</td><td></td><td></td><td>שימוש בציוד זמין מקומי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור עם הגדלה</td><td></td><td></td> פי 400 <td>השתמש בציוד זמין מקומי</td></tr><tr><td>Nco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>נא ליצור קשר עם המחבר המתאים&nbsp;</td></tr><tr><td>ניתן להחליף פיפט פסטר (זכוכית, קצה ארוך)</td> <td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td><td>בווקטורי שיבוט בסיסיים אחרים כמו pENTR או pJET</td></tr><tr><td>תפוח אדמה דקסטרוז אגר&nbsp;</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr><td>עט</td><td></td><td></td> שארפי <td>משתמש בציוד זמין מקומי</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td>משתמש בציוד זמין מקומי</td></tr> <tr><td>Ssp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>em>Xba תמצית</td> שמרים <td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

בעזרת פחמון זקן התירס כמו סוס טרויאני ב באתרו משלוח של תירס חלבונים

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

בהשראת המיתוס סוס טרויאני Homer´s, מתוכנן לנו את הפתוגן תירס פחמון זקן התירס כדי לספק חלבונים מופרשים לתוך אפופלסט תירס יאפשר ניתוח פנוטיפי ויוו. בשיטה זו אין להסתמך על טרנספורמציה תירס, אבל מנצלת גנטיקה של חיידקים ויכולות הפרשה של פתוגנים. במסמך זה, היא מאפשרת בדיקה של ויוו נמסר חלבונים מופרשים עם רזולוציה גבוהה ייתכן-סוגים שונים של אתרים זיהום ורקמות. האסטרטגיה סוס טרויאני יכול להיות מנוצל כדי להשלים transiently תירס פנוטיפים אובדן-של-פונקציה, לאפיין באופן פונקציונלי חלבון תחומים, כדי לנתח את המטרה חלבון אפקטים, או ללמוד כמויות חלבון onside יתר, מה שהופך אותו כלי רב עוצמה עבור מחקרים חלבון במערכת חיתוך תירס. עבודה זו מכיל פרוטוקול מדויק על איך ליצור זן סוס טרויאני ואחריו זיהום מתוקננת פרוטוקולים ליישם שיטה זו שלושה סוגי רקמות תירס שונים.

בונה לניסויים סוס טרויאני זקן התירס בארצות הברית הם משובטים לתוך פלסמיד p123-PUmpit2-SpUmpit2-גנים של עניין-mCherry-Ha. הגן תירס עניין מותך כתב זריחה mCherry , של epitope HA-תג. הביטוי של החלבון היתוך הוא תחת שליטה של האמרגןpit2 זקן התירס בארצות הברית Um אשר מופעל באופן ספציפי במהלך זיהום21. כדי הפרשת ישירה של החלבון של עניין פפטיד ל...

עבודה זו מתארת את שכפול של זן סוס טרויאני פחמון זקן התירס למסירה באתרו של חלבונים תירס מופרשים לתוך שלושה סוגים שונים של רקמות תירס.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

חקירת תהליכים על רמות גנטיות וחלבון היא חיונית במחקר היבול. הגישה שלנו מאפשרת בדיקה של חלבוני מבוך מופרשים עם רזולוציית הזמן המרחבית הגבוהה ביותר בצדדים ורקמות זיהום שונים. שיטת הסוס הטרויאני בוחנת יכולות הפרשה אוטומטיות שימושיות.היא עוקפת טרנספורמציות מבוך זמן רב ומאתגרות, ומאפשרת מחקרים מפורטים על חלבונים מופרשים בתוך ה-appelplatz במבוך. מידע מפורט על זיהום נכון של עלים מבוך נוסף, גדילים ואוזן. ומראה את המחקר המוצלח של התקדמות זיהום ותפקוד חלבון ברקמת היעד.הפגנת ההליך תהיה איזבל פידלר, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה. כדי להתחיל את הניסוי, לגרד Eumadous מצלחת pediatr באמצעות פיפטה פסטר סטרילי. לחסן 5 מיליליטר של YEPS בינוני קל עם Eumadous.לגדל את התרבות ב 28 מעלות צלזיוס, עם רעידות קבועות ב 200 סל"ד במשך 16 שעות. למחרת מערבבים 900 מיקרוליטרים של תאורת YEPS טרייה עם 100 מיקרוליטרים של תרבות הלילה. למדוד את OD-600 באמצעות YEPS בהיר בינוני כמו ריק בניתוח ספקטרופוטומטר.לדלל את תרבות הלילה עם בינוני אור YEPS טרי כדי OD-600 של 2. תן לתרבות לגדול ב 28 מעלות צלזיוס עם רעידות קבועות ב 200 סל"ד, עד שהוא מגיע לשלב הצמיחה באמצע יומן, מסומן על ידי OD-600 של 8 עד 1.0. לאחר הדגירה, לקצור את התאים על ידי ספינינג אותם ב 3000 פעמים צ'י במשך 10 דקות.השלך את העל-טבעי. לאחר מכן, לשטוף את פילט התא פעם אחת עם נפח תרבות אחד של DDH2O. לסובב את התאים ב 3000 זמן צ'י במשך 10 דקות ולהשליך את העל טבעי.לאחר מכן, להשעות מחדש את פילט התא בזהירות DDH2O, באמצעות פיפטה זכוכית 20 מיליליטר. ובכך להתאים את OD-600 הסופי כדי 3.0 עבור מדוד סוס טרויאני או 1.0 עבור דירוג המחלה. מטפחים את צמחי המבוך לשלב של עלים בוגרים, שבו לפחות עלה 7 גדל בתוך הגבעול.לאחר מכן, להעביר את התרבות Eumadous למזרק 3 מיליליטר עם 20 מד דו אחד מחט hypodermic. לחץ על הגבעול בזהירות כדי לוקליזציה של רקמת גזע המראה. הבסיס של גזע המראה ניתן להבדיל על ידי מעבר מ גבעול קשה יותר לרקמה רכה יותר.סמן את גזע המראה על הגבעול באמצעות עט. להזריק 1.5 מיליליטר של תרבות Eumadous 1 סנטימטר מעל גזע מראה לירות או גזע מראה תפרחת. לאחר שצמחי המבוך מגיעים לשלב צאסלה, לחץ על הגבעול בזהירות כדי לוקליזציה של צ tassel בגזע.סמן את הקצה ואת בסיס צ tassel על הגבעול באמצעות עט. להעביר את התרבות Eumadous לתוך מזרק 3 מיליליטר עם מחט מזרק 20 מד דו אחד להזריק סך של 1.5 מיליליטר של inoculum סביב הציצית. כדי לבטח חלוקה שווה של inoculum, לאט למקם 5 מיליליטר בקצה, באמצע, ואת הבסיס של ציצית מסומן עם העט.העבר את תרבות Eumadous למזרק 3 מיליליטר עם 20 מד דו אחד מחט hypodermic. להזריק את מחט החיסון לתוך החלל בין עלי ההצקת עמוק ככל האפשר מבלי לפגוע באוזן, ולאחר מכן לשחרר 1.5 מיליליטר של inoculum סביב האוזן. לאחר מכן, להסיר את המזרק ואת המחט בזהירות לעסות את קלח כדי להפיץ את הפתרון Eumadous באופן שווה.טיפה 10 microliters של inoculum על צלחת Auger פחם PD. ואז דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 ימים. היפי מפריש ZM Mach1 מוקף באות פלואורסצנטי ודובדבן.לעומת זאת, היפים שאינם מזכירים מראים רק אות פלואורסצנטי בציטופלסמה הפטרייתית. לוקליזציה לא נכונה של צסול או חלוקה לא שוויונית של אינוקולום עלולה לגרום לטביעה לא מדביקה או לזיהום חלקי בלבד של הטסל בהשוואה להפצה אחידה. סולו פתוגניים סוס טרויאני Progenester זן SG-200, מתורבת על Auger פחם PD, יוצר תריסים מוך לבן על הצלחת כפי שמוצג.בעוד זן Eumadous FB1 דורש הזדווגות לפני היווצרות תריס זיהומיות. בעקבות זיהום, התגובה האפשרית של סימנים חלבון כבד סוס טרויאני ניתן לנתח בשיטות שונות כולל דירוגי מחלות או הדמיה מיקרוסקופית. עבור פתוגנים רבים, טרנספורמציה והפרשה מובנים היטב ו ניתן לחקור אותם באופן דומה.לכן, הם מאפשרים את המחקר של המארח, אשר אינם רגישים לשינוי.

using-ustilago-maydis-as-trojan-horse-for-situ-delivery-maize

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מקור: בירנינק, ב. מ. ואחרים. הזרקה ישירה של שתילי תירס באמצעות הזרקה של וירוס הפסיפס של זנב שועל רקומביננטי ושיבוטים זיהומים של וירוס פסיפס קנה הסוכר. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון הזה מדגים את העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריה לשתילי תירס לצורך השתקת גנים. הוא מתאר את תהליך זיהום האגרובקטרים , התפשטות וירוסית מערכתית ושינויים פנוטיפיים המונעים מהפרעות RNA.

העברת שיבוטים ויראליים רקומביננטיים בתיווך אגרובקטריום לשתילי תירס להשתקת גנים

השימוש בשיטת הזרקת מחט לחסן תירס וצמחי teosinte עם פתוגן ביוטרופי Ustilago maydis מתואר.  שיטת החיסון להזרקת מחט מקלה על מסירה מבוקרת של הפתוגן הפטרייתי בין עלי הצמח שבהם הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות appresoria. שיטה זו יעילה ביותר, ומאפשרת חיסונים הניתנים לשחזור עם U. maydis.

שיטה מהירה ויעילה להערכת פתוגניות של מיאדי אוסטילגו על קווי תירס וטוסינטה

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

גנים מורפולגניים הצמח יכול לשמש כדי לשפר את הטרנספורמציה גנטית של גנוטיפים הסרבן. המתואר כאן הוא Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית (quickcorn) פרוטוקול עבור שלושה חשובים הציבור תירס שורות.

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

פרוטוקול הזרקה מבוסס אגרובקטריום (אגרובקטריה) מוצג לחיסון של וירוס פסיפס זנב שועל ווירוסי פסיפס קני סוכר לשתילי תירס. חיסון באופן זה מוביל לזיהום ויראלי, השתקת גנים הנגרמת על ידי וירוס של גנים סמן, ו overexpression ויראלי של GFP.

אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בתפוקה גבוהה להעברה זמנית של מיליוני פרוטופלסטים של תירס לבדיקת ספריות גדולות של פלסמידים בתאי מזופיל תירס.

טרנספקציה ניתנת להרחבה של פרוטופלסטים של מזופיל תירס

רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

מוצגת אסטרטגיה ליצירת מוטציות בגנים היסטונים במיקומם האנדוגני ב-Saccharomyces cerevisiae.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

כאן נתאר את המסירה של microRNA באמצעות serotype של וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים 9 במודל של עכברים של מחלה עצב-שריר. ניהול היקפיים יחידה בעכברים כתוצאה miRNA מתמשכת ביטוי שריר, מוטורי לגלוקוז, מתן הזדמנות טיפולית פוטנציאל vivo בתוךותפקוד miRNA של המחקר.

משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים

למדו את שיטת הסוס הטרויאני לחקר חלבונים מופרשים בתירס באמצעות זקן התירס. גישה זו מאפשרת מסירה in situ של חלבונים לרקמות שונות ומפשטת את חקר אינטראקציות צמח-פתוגן.

בעזרת פחמון זקן התירס כמו סוס טרויאני ב באתרו משלוח של תירס חלבונים

גלה סרטונים נוספים