Name: תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למד הערכה בתפוקה גבוהה של השפעת סוכני היפוך השהיה על שעתוק ושחבור HIV. שיטה זו מאפשרת הערכה סימולטנית של השפעת LRAs על עיבוד mRNA של HIV ותובנות לגבי הפעלה מחדש של הנגיף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט גרנט APP1129320, תוכנית מענק APP1052979 NHMRC של אוסטרליה. אנו מודים ד ר אדם וויטלי, ד ר מרינה אלכסנדר, ד ר ג'ני ל' אנדרסון ולי י' מישל על מתן בונה חיוני וייעוץ סיומו המוצלח של עבודה זו. אנו מודים גם הצוות DMI זרימה מתקן עבור שלהם ייעוץ וסיוע נדיב בשמירה על cytometer זרימה השתמשו במחקר זה.

הערה: נהלי שכפול, שינוי, רצף הם דנו במקום18,19. הפרוטוקולים בזאת מתחילים מ תקנים של הווקטורים בתרבית של הביטוי (איור 3).
1. תרביות תאים תאים HEK293T עם כתבת צבע כפול לבנות
<ol><li>לטפח HEK293T תאים הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 μg/מ"ל) בחממה2 CO 5% ב 37 º C. לאחר מפשיר, מעבר תאים HEK293T 2 - 3 פעמים לפני השימוש בהם תקנים ניסויים. זה ייתן את הזמן תאים כדי להתאושש מההליך שהביקושים. התראה: Mycoplasma זיהום של תרביות תאים נשאר בעיה רצינית. מעבדה ובדיקות שגרתיות של תרביות תאים חיוניים כדי להקטין את הסיכון של זיהום mycoplasma למנוע דיפוזיה20.</li>
	<li>לפצל את התאים 1:2 יום אחד לפני זריעה, להעביר אותם לתוך בינוני DMEM טריים. לטפח את התאים עבור 24 שעות ביממה בחממה2 CO 5% ב 37 º C.</li>
	<li>יום לפני תרביות תאים, להסיר את המדיום של הבקבוק על ידי השאיפה ולשטוף את התאים עם פוספט buffered (DPBS) תמיסת Dulbecco חינם של סידן (Ca2 +), מגנזיום (Mg2 +) כדי להסיר שאריות של סרום.</li>
	<li>לוותר על 5 מ של טריפסין-EDTA פתרון (0.05% - 10 מ מ ב- PBS) לתוך כלי תרבות ולמקם אותו ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO 5% למשך 2-5 דקות.</li>
	<li>כאשר התאים מנותקים, הוסף 5 מ של DMEM בתוספת 10% (v/v) FBS נוסף לעכב פעילות טריפסין אשר עלולה לגרום נזק לתאים.</li>
	<li>Resuspend בעדינות על-ידי pipetting התליה תא למעלה ולמטה כדי לשבור את הגושים.</li>
	<li>לדלל 1:10 תאים ב- trypan blue הכתם (0.4%).</li>
	<li>לסמוך על תאים חיים זה לא תופסים trypan blue באמצעות מיקרוסקופ (המטרה x 10) ו- haemocytometer.</li>
	<li>לחשב את מספר התאים קיימא למיליליטר על-ידי לקיחת הממוצע של ספירת הכפלת זה 10,000, על-ידי הגורם דילול (1:10) מ trypan blue כתם.</li>
	<li>לוחית רישוי 2 x 10 תאים4 ב 100 μL בינוני DMEM בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה בצלחת 96-ובכן שטוח התחתונה עבור 24 שעות.</li>
	<li>עבור כל טוב, לדלל 400 ננוגרם של pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng של pCMV-RevNL4.3 ו- 100 ננוגרם של pCMV-Tat101AD8-דגל DNA ב μL 50 בינוני חינם סרום. מערבבים בעדינות. לניסויים ללא Tat, להשתמש שהותאמו ריק Tat וקטור pcDNA3.1 (-). הערה: השימוש של DNA ללא אנדוטוקסין מומלץ מאוד. בשביל זה, להכין ללא אנדוטוקסין DNA באמצעות ערכת טיהור חומצת גרעין midi או maxiprep. לקבוע את הטוהר DNA על ידי מדידת היחס OD 260/280, אשר צריכה להיות בין 1.7 1.9.</li>
	<li>לערבב הכימית השומנים בעדינות לפני השימוש, ולאחר מכן לדלל 0.65 μL ב μL 50 בינוני חינם סרום. לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשלב את ה-DNA מדולל עם הכימית השומנים מדולל.</li>
	<li>לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. הפתרון עשוי להופיע מעונן. הערה: המשך לצעוד 1.15. בתוך 30 דקות.</li>
	<li>לוותר על μL 100 לכל טוב של מתחמי ריאגנט-DNA השומנים drop-wise על גבי התאים.</li>
	<li>מערבבים בעדינות במוזיקת את הצלחת אחורה וקדימה.</li>
	<li>
דגירה את הצלחת. בשביל 5 ש ח בחודש 5% CO2 humidified החממה ב 37 º C.
	<ol>
<li>כל תערובת התגובה מספיקה עבור תרביות תאים ובכן יחיד (96-ובכן). התאימו את כמות הנפח של רכיבים לפי מספר תרופות ושילוב זה להיבדק ואת חשבונות עבור וריאציות pipetting. כל התנאים נבדקים בדרך כלל ב- triplicates.</li>
		<li>Transfect בארות נוספות עם 100 ננוגרם של מונחי-CMV פלסמיד EGFP ו- DsRed-אקספרס DNA למטרות פיצויים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. טיפול Transfected HEK293T תאים עם השהיה היפוך סוכנים
הערה: לפני כל assay, לקבוע מצב פיזיולוגי כל איירה על ידי מדידת הכדאיות של התאים לאחר חשיפה למינון גבוה ונמוך של התרופה עם תא התפשטות וזמינותו.
<ol><li>לדלל כל איירה לריכוז עבודה המתאימה עם מדיום הגידול (למשל, μM 1 עבור JQ1(+)). התראה: לשקם את הסמים lyophilized עם הממס המתאים כדי ריכוז של 10 מ מ. החנות כל המניות LRAs ב-80 מעלות צלזיוס אחת להשתמש aliquot (5 μL כל אחד) על מנת להימנע חזר מחזורי מפשיר לקפוא.</li>
	<li>בזהירות תשאף תרביות תאים בינוני עם רב-ערוצי והחלף 100 בינוני μL המכיל המתאים איירה (טבלה 1). הוסף בינוני מאוד בעדינות לצד הקיר היטב כדי למנוע ניתוק התאים HEK293T transfected, אשר ידועים להתנתק בקלות מהמשטח צלחת תרבות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל 48 ש ח בחודש 5% CO2 humidified החממה ב 37 º C.</li>
</ol>3. צביעת תאי Transfected עם הכדאיות ניתן לתיקון צבע לניתוח Cytometry זרימה
התראה: הסרת תאים מתים ופסולת חיוני כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות וכדי להשיג תוצאות באיכות הגבוהה ביותר.
<ol><li>ניתוק התאים לתוך המדיה באמצעות μL 100 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לכל טוב ועל ידי בעדינות pipetting שיהיה (~ 5 פעמים) עם רב-ערוצי תוך הימנעות קצף של המדיה. אם יש צורך, ניתוק התאים מהצלחת באמצעות 35 µL לאדם טוב של טריפסין-EDTA פתרון (0.05% - 10 מ מ ב- PBS) ו המקננת 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לפני נטרול בינונית המכיל סרום.</li>
	<li>העבר את התאים צלחת V-התחתון 96-ובכן.</li>
	<li>לסובב את התאים עבור 5 דקות ב x 500 גרם ב 4 ° C, אז בזהירות וארוקן את בינוני/PBS בלי לגעת בתאים.</li>
	<li>לשטוף את התאים זמן לפחות 1 עם μL 200 ל- PBS חינם חלבון/סרום.</li>
	<li>צנטריפוגה ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע על-ידי הטיית הלוח והסרה המאגר שטיפת בלי לגעת בתאים.</li>
	<li>הכן הפתרון עובד של צבע הכדאיות ניתן לתיקון על ידי דילול 1:1000 לצבוע את הכדאיות ב- PBS חינם חלבון/סרום. להכין µL 50 של הכתם מדולל לכל טוב. הערה: הכדאיות צבעים זמינים במגוון צבעים מתאים לשימוש עם לייזרים כחול, אדום וסגול. להכין פתרון מניות של צבע הכדאיות שניתן לתקן על-ידי resuspending בקבוקון אחד של לצבוע lyophilized (רכיב A) עם 50 μL נטול מים דימתיל סולפוקסיד (רכיב B). חנות ב-20 ° C בשימוש אחד aliquot (1 μL כל), מוגן מפני האור.</li>
	<li>להוסיף 50 μL של צבע מדולל הכדאיות כל טוב ומערבבים את התאים על-ידי pipetting למעלה ולמטה עם רב-ערוצי.</li>
	<li>. הכתם למשך 10-15 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני האור...</li>
	<li>לשטוף 1 - 2 פעמים עם 150 μL שטיפת מאגר (PBS עם EDTA אלבומין ו- 2 מ מ פרה 1%).</li>
	<li>צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לתקן את התאים μL 100 פורמלין 1% שזה עתה הוכנו במאגר שטיפת למשך 10-15 דקות ב 4 ° C בחושך. התראה: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד. להכין 1% פתרון פורמלדהיד ברדס fume כדי למנוע שאיפת בעת לבישת כפפות ומשקפיים בטיחות להגנה.</li>
	<li>לשטוף את התאים 1 - 2 פעמים עם 100 μL שטיפת מאגר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב- 70 μL שטיפת המאגר. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. תאים קבוע עשויה להיות מאוחסנת ב 4 ° C בחושך לניתוח למחרת על cytometer הזרימה.</li>
</ol>4. EGFP ומדידות DsRed על ידי Cytometry זרימה וניתוח נתונים
הערה: לנתח HIV שעתוק (% EGFP) ו- splicing (% DsRed) על cytometer זרימה. לסנן את הדגימה לפני ההפעלה עם תא-מסננת 70 μm או 100 μm רשת ניילון כדי להימנע שחוסמים את הזרבובית.
<ol><li>להתחיל את cytometer ואת המחשב לפחות 10 דקות לפני השימוש, כדי להבטיח לייזרים להתחמם.</li>
	<li>לפני הפעלת דגימות, מתחיל קירור והקפאה, למלא את מיכל הנרתיק עם תמיסת 0.9%, לוודא לוח נתרן תת-כלורי מתווספת למיכל פסולת.</li>
	<li>בדוק את התא זרימה בועות אוויר.</li>
	<li>ודא גלאי ומסננים המתאימים לניסוי. הערה: EGFP, לשימוש של לייזר כחול (488 ננומטר), 530/30 bandpass, בעוד DsRed אקספרס מזוהה בצורה אופטימלית באמצעות לייזר צהוב (561 ננומטר) ו bandpass 610/20. לייזר כחול (488 ננומטר) 610/20 bandpass יכול לשמש גם כדי לזהות ביטוי DsRed.</li>
	<li>בדוק את הביצועים cytometer ואת רגישות על פני גלאי על-ידי הפעלת כיול חרוזים.</li>
	<li>התאם פארווערטס (FSC-A) ואת הצד המתחים פיזור (האס-A) עם מוכתם. דוגמה כך האוכלוסייה העיקרית היא על המסך, ניכרת בבירור. הערה: FSC (אור מפוזר-קדימה) הוא מידה של אור עקיפה ב זווית שטוחה, אשר תלויה הנפח של התא (תא שטח או גודל), בעוד האס (צד-מפוזרים אור) היא מדידה של שבירת אור ב זווית ישרה, אשר הוא יחסי תא צפיפות והמורכבות פנימי.</li>
	<li>לבצע פיצוי הידנית או האוטומטית באמצעות דגימות שהוכתמו יחיד הבטחת והתאמת מינימלי מאוכלוסיית EGFP + גלאי DsRed או להיפך. התראה: למטרות פיצויים, להשתמש במדגם של תאים המבטאים כל אחד חלבון פלואורסצנטי צבע אחד, כמו גם תאים ביחידים מוכתם לצבוע הכדאיות ניתן לתיקון. אל תשתמש FITC ו- PE חרוזים פיצוי עבור EGFP ו- DsRed חלבונים פלורסנט פיצויים בשל מאפיינים ספקטרלי שונים. פקדים הפיצוי צריך להיות מספיק פיקח כדי לפתור האוכלוסייה חיוביים ושליליים.</li>
	<li>יצירת מגרשים ולהגדיר את השערים בעזרת קרינה פלואורסצנטית מינוס אחד פקדים (FMO).</li>
	<li>לרכוש ולהקליט למינימום של 10,000 אירועים תא קיימא עבור דגימה. דוגמאות לרוץ במהירות בינונית או נמוכה כדי להימנע doublets עובר דרך נקודת החיתוך בלייזר. השתמש הדופק הגיאומטריה gating כגון האס-A מול האס-H כדי לחסל את doublets. לבדוק את היציבות המרוץ ידי הזמן נגד האס-A כדי לראות כיצד גם זרימת היא במהלך הריצה.</li>
	<li>בסוף המרוץ, לנקות את פלואידיקה cytometry זרימה עם חומרי ניקוי מרוכז ואז מים במשך 5 דקות.</li>
	<li>לכבות את המערכת, להשליך את הפסולת ולמלא מחדש את מיכל הנרתיק לאחר הרכישה.</li>
	<li>ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים cytometry זרימה. לא לכלול שאריות תאים, סבך (doublets) המבוסס על פיזור קדימה ואת הצד, ואז לחסל את התאים המתים בעזרת כתם צבע הכדאיות (שלילית האוכלוסייה = תאים חיים). לזהות את התאים לבטא EGFP ו- DsRed (איור 4), כמו גם האחוזים של המוצר משולבים DsRed /(DsRed + EGFP) (איור 5).</li>
	<li>לקבוע את ההשפעה של אתה בטוח על HIV שעתוק ו שחבור על-ידי השוואת לא מטופל תאים והתאים נחשף הפרט או שילוב של LRAs (איור 5).</li>
</ol>

<ol><li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li>
<li>Khoury, G., et al. Ch. 8. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhoury%2C+G+%22HIV+vaccine+and+cure+-+The+Path+Towards+Finding+an+Effective+Cure+and+Vaccine%22">HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine</a>. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).</li>
<li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transcription+and+latency%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67(2013).</li>
<li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4%2B+T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li>
<li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li>
<li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+Vacc-4x%2C+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination%2C+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+%28REDUC%29%3A+a+single-arm%2C+phase+1B%2F2A+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panobinostat%2C+a+histone+deacetylase+inhibitor%2C+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy%3A+a+phase+1%2F2%2C+single+group%2C+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li>
<li>Søgaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li>
<li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodomain+and+extra-terminal+%28BET%29+bromodomain+inhibition+activate+transcription+via+transient+release+of+Positive+Transcription+Elongation+Factor+b+%28P-TEFb%29+from+7SK+small+nuclear+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).</li>
<li>Boehm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+bromodomain-targeting+compounds+reactivate+HIV+from+latency+via+a+Tat-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism.</a> Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).</li>
<li>Contreras, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+reactivates+HIV+from+latently+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development%3A+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li>
<li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071(2014).</li>
<li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected%2C+resting+CD4%28%2B%29+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li>
<li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li>
<li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+in+isolated+patient+CD4%2BT+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation%2C+completion%2C+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4%2BT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li>
<li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li>
<li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Linear+and+Discontinuous+Ribosome+Scanning+Are+Used+for+Translation+Initiation+from+Bicistronic+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+env+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs.</a> Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).</li>
<li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+detection+of+Mycoplasma+contamination+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).</li>
<li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+reversing+agents+act+through+Tat+post+translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications.</a> Retrovirology. 15 (1), 36(2018).</li>
<li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency%3A+experimental+systems+and+molecular+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li>
<li>Dahabieh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17(2014).</li>
<li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li>
<li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955(2015).</li>
<li>Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter-regulatory+region+of+the+major+immediate-early+gene+of+human+cytomegalovirus+responds+to+T-lymphocyte+stimulation+and+contains+functional+cyclic+AMP-response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements.</a> Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).</li>
<li>Reeves, M., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+human+cytomegalovirus+latency+and+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).</li>
<li>Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li>
<li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60(2011).</li>
<li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li>
<li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li>
<li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li>
<li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4%28%2B%29+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li>
<li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li>
<li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

לאור הקושי במדידת הפעלה מחדש וירוס ex-vivo, מגוון רחב של במבחנה מודלים שפותחו במהלך הזמן ללימוד השהיה HIV כולל לחשוף נגוע תא T-קווים (J-השרירים, ACH2, U1), מודלים העיקרי של דלקת סמויה של נח ( מודלים O'Doherty, לוין, גרין, Spina) או תאי CD4 + T מופעל מראש (Sahu, מריני, Planelles, Siliciano, מודלים Karn) עם יחיד עגול או שכפול כתב מוכשר וירוסים22. המודל התנאים הפיזיולוגיים של HIV השהיה ב נח CD4 + T תאים, מערכות כתב פלורסנט כפול התפתח כמו הכתבת RGH (אדום-ירוק-HIV) שפותחה על ידי הקבוצה של איוון סדוסקי ...

למרות טיפול תרופתי ארוך טווח יעיל, HIV נמשכת במצב נסתר כמו provirus משולב בזיכרון CD4 + T תאים1. המבנה כרומטין של HIV-1 5' מסוף זמן חוזר (משמאל לימין) יזם שינויים epigenetic היסטון מתילציה ו deacetylation על ידי ה-DNA methyltransferases (DNMT) ו היסטון deacetylases (HDAC) הם מנגנוני חשוב המוביל דיכוי גנים ברמת השעתוק ובכך השהיה פוסט-אינטגרציה2,3. מגוון גדול של סוכנים היפוך השהיה (LRAs) נחקר על היעילות שלהם לעודד ייצור וירוס במבחנה, לחשוף ויוו מן נגוע מנוחתו CD4 + T תאים4,5,6,7 ,8. בין LRAs נבדק, HDACi (מעכבי HDAC), מעכבי bromodomain ההימור (בו בטיס) זירוז כרומטין decondensation ושחרור של b גורם התארכות שעתוק חיובי (P-TEFb) בהתאמה, שמוביל הבאים להקל על תעתיק דיכוי-5' LTR והפעלה של HIV ביטוי9,10,11,12,13. עם זאת, סדר הגודל של הפעלה מחדש מושגת על ידי אלה LRAs היה מוגבל רק עלייה צנועה הקשורים תא unspliced HIV mRNA (אותנו RNA), מעידה על שעתוק ויראלי, נצפתה ex-vivo14,15. חשוב לציין, LRAs אלה גם נכשל לזירוז ירידה בשכיחות של תאים נגועים לחשוף.
הביטוי HIV עשוי מוגבלת עוד יותר באמצעות splicing לא יעיל16 , כמו גם פגמים גרעיני הייצוא של הכפל משולבים HIV RNA (MS RNA)17. לפיכך, נדרשים זיהוי שיעורים חדשים של LRAs זה יותר חזקות והוא יכול להשפיע על היבטים שונים של נגיף אינטגרציה שלאחר הייצור. בנוסף, נדרש הפיתוח של מבחני הרומן המסייעים הגדרת תרכובות האופטימלית להפוך ביעילות את זמן השהיה.
. הנה, פרוטוקול מוצג, אשר משתמשת בגישה תפוקה גבוהה להערכה תפקודית של ההשפעה של התערבויות על שעתוק מונחה HIV LTR ו שחבור. בקצרה, דואלי מונחה-LTR חדש צבע הכתב מערכת pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (איור 1) משמש כדי להעריך HIV הפעלה מחדש על ידי cytometry זרימה. כתבת פלורסנט, הביטוי של HIV unspliced mRNA (4kb) מוביל לביטוי משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP), ואילו הביטוי של mRNA משולבים (2 kb) יוביל ביטוי חלבון פלואורסצנטי Discosoma sp. אדום (DsRed). בקצרה, השתמשנו של חלבון כימרי פלורסנט Env-EGFP, gp140unc. ? EGFP, איפה רצף קידוד של EGFP בוצעה במסגרת עם צורה cleaved האו ם, קטום של המעטפה (מעטפה). הוכנסו שינויים כדי ablate האתר המחשוף מונע את הדיסוציאציה של מעטפה עבה לתוך gp120, gp41-EGFP, וכדי לעגל את החלבון gp160 לפני התחום transmembrane יצירת אנלוגי Env מסיסים, המאפשרת את הקיפול הנכון, ביטוי של EGFP. על הביטוי בתוך תא, Rev. רגישה את הגרעין איפה זה שמתווכת גרעיני cytoplasmic הייצוא של 4 kb env mRNA דרך האינטראקציה עם הרכיב להגיב rev (הכנה). העיגול של מעטפה לא מתפשרים על הכנה, הנמצא בין gp120, gp41 A7 3' אחוי באתר. במערכת זו, החדרת ב- HIV-1 אחוי התורם 4 (SD4), אחוי מקבל 7 (SA7) תוצאות בייצור של 2 קילובתים mRNA קידוד חלבון Rev פונקציונלי נקטע בנקודת חומצת אמינו 38 דבוקה חלבון פלואורסצנטי DsRed, RevΔ38-DsRed. בקצרה, DsRed הוכנס לתוך אקסון 2nd של Rev-חומצת אמינו 38 מאת חפיפה סיומת18. כדי להקל על הייצוא הגרעין של unspliced mRNA, וקטור ביטוי בתרבית של קידוד Rev (pCMV-RevNL4.3) היה שותף transfected עם הבונה כתב פלורסנט (איור 2). המבנה הזה, כתב ייחודי המתוארים כאן הוא שימושי תפוקה גבוהה הערכה של HIV שעתוק שחבור, ללא הצורך להשתמש וקטורים ויראלי.

<table><tbody><tr><td><תרבית תאים חזקה></תאים חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T (תאי כליה עובריים אנושיים)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>משכפל וקטורים הנושאים את אזור השכפול SV40.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>+ 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז + 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>מקור אוסטרליה</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט בופר (DPBS) של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפאן, 0.4%</td> <td>גיבקו</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>גיבקו</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>מגיב טרנספקציה ליפידים</td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x) סרום מופחת בינוני</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>בינוני ללא סרום</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Marcherey-Nagel</td><td>740414.50</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 פלסמיד</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>6085-1</td><td>ביטוי של EGFP בתאי יונקים, מקדם CMVIE.</td></tr><tr><td>pDsRed-Express-N1</td><td>Clontech (TaKaRa)632429</td><td></td> <td>ביטוי של DsRed-Express בתאי יונקים, מקדם CMVIE.</td></tr><tr><td>pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed</td><td>Addgene</td><td>115775</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-RevNL4.3</td><td>Addgene</td><td>115776</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td><td>Addgene</td><td>115777</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Millipore</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>JQ1(+)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11187</td><td>מלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO; ריכוז עבודה 1 &mu; M</td></tr><tr><td>JQ1(-)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11232</td><td>מלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO; ריכוז עבודה 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td>מלאי ב-100 &mu; גרם/מ"ל ב-DMSO; ריכוז עבודה 10 ננומטר</td></tr><tr><td>Phytohaemagglutinin (PHA)</td><td>Remel</td><td>HA15/R30852701</td><td>מלאי ב-1 &mu; g/&mu; L ב-PBS; ריכוז עבודה 10 &mu; גר'/מ"ל</td></tr><tr><td>Vorinostat (VOR)</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009929</td><td>מלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO; ריכוז עבודה 0.5 &mu; M</td></tr><tr><td>Panobinostat (PAN)</td><td>TRC</td><td>P180500</td><td>מלאי ב-10 מ"מ ב-DMSO; ריכוז עבודה 30 ננומטר</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td><td>Promega</td><td>63581</td><td></td></tr><tr><td>Venor GeM Classic</td><td>Minerva Biolabs</td><td>11-1100</td><td>Mycoplasma Detection Kit, מבוסס PCR</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>Flow cytometry reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow Cytometer (4 לייזרים-כחול, אדום, סגול וצהוב)</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>ציטומטר זרימה (3 לייזרים-כחול, אדום וסגול)</td></tr><tr><td>LIVE / DEAD ניתן לתיקון קרוב ל- IR מת ערכת כתמי תאים</td><td>Life Technologies</td><td>L34976</td><td>צבע כדאיות: לעירור של 633 או 635 ננומטר, 400 בדיקות. רכיב A ו-B מסופקים שניהם בערכה.</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5M pH8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 37/10 (37%)</td><td>Chem-Supply</td><td>FA010</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva CS& T מחקר חרוזים</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>חרוזי כיול</td></tr><tr><td>Sphero קשת חלקיקי כיול (8 פסגות)</td><td>BD Biosciences</td><td>559123</td><td>3.0 - 3.4 מ"מ</td></tr><tr><td>תמיסת נדן</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>90 גרם NaCl ב 10 ליטר מים</td></tr><tr><td>HAZ-כרטיסיות</td><td>אורח רפואי</td><td>H8801</td><td>טבליות שחרור כלור לחיטוי</td></tr><tr><td>דקון 90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td>N / A</td><td>חומרי ניקוי מרוכזים של ציטומטר זרימה. פתרון עבודה Decon 90 5%.</td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט (תמיסה של 12-13%)</td> <td>Labco</td><td>SODHYPO-5L</td><td>חומרי ניקוי מרוכזים של ציטומטר זרימה. תמיסת עבודה אקונומיקה 1%.</td></tr><tr><td>7x</td><td>MPBio</td><td>IM76670</td><td>חומרי ניקוי מרוכזים של ציטומטר זרימה. פתרון עבודה 7x 1%.</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק><</td><td>חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות (75 ס"מ2, צוואר משומר, כובע מאוורר)</td><td>קורנינג</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות (96 תחתית שטוחה היטב עם מכסה)</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות (96 באר V-bottom ללא מכסה)</td><td>Costar</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה (10 מ"ל)</td><td>SARSTEDT</td><td>62.9924.284</td><td>100x16 מ"מ</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל)</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>30x115 מ"מ</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)</td><td>Corning Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>סרולוגי פיפטה סטרילית (25 מ"ל),</td> פיפטה סרולוגית <td>סטרילית קורנינג</td><td>CLS4489-200EA</td><td></td></tr><tr><td>(10 מ"ל),</td> פיפטה סרולוגית סטרילית <td>קורנינג</td><td>CLS4488-200EA</td><td></td></tr><tr><td>(5 מ"ל),</td> מאגרי ריאגנטים סטריליים <td>של קורנינג</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>(50 מ"ל),</td> מבחנת פוליסטירן סטרילית <td>קורנינג</td><td>CLS4470-200EA</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים</td><td>קורנינג</td><td></td><td>352235 סגנון 12 x 75 מ"מ, 70 מ"מ</td></tr><tr><td>רשת ניילון</td><td>SEFAR</td><td>03-100/32</td><td>100 מ"מ</td></tr><tr><td>Titertube מבחנות מיקרו,</td><td>צינורות מיקרופקס</td><td>BIO-RAD</td><td>2239391</td> בתפזורת</tr><tr><td>5 מ"ל מבחנת פוליסטירן תחתונה עגולה, ללא מכסה</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>12x75 מ"מ</td></tr><tr><td>מכסי הצמד למבחנות 12x75 מ"מ</td><td>Corning</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה, נויבאואר שיפר את פסיקת הרשת הכפולה, קו בהיר (Haemocytometer, LO-Laboroptik)</td><td>ProSciTech</td><td>SVZ4NIOU</td><td>ריבועים גדולים בגודל 3x3 של 1 מ"מ2; עומק 0.100 מ"מ; נפח 0.1 מ"ל; שטח מינימלי 0.0025 מ"מ2</td></tr><tr><td>Coverslips (Menzel-Gl&auml; סר)</td><td>Grale Scientific</td><td>HCS2026</td><td>20 x 26 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon TMS</td><td>310528</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>5811000487</td><td>עם רוטור A-4-81 כולל מתאמים לצינורות חרוטיים של 15/50 מ"ל</td></tr><tr><td>קורא מיקרו-צלחת FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>N/A</td><td>קורא צלחות לבדיקת התפשטות תאים. מסנן 490 ננומטר.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow תוכנית איסוף וניתוח נתונים של ציטומטר זרימה, גרסה 8.0.1</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo 10.4.2</td><td>תוכנית ניתוח נתונים של ציטומטר זרימה, FlowJo Engine v3.05481</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>FLUOstar בקרת קורא מרובה משתמשים, גרסה 5.11</td></tr><tr><td>Omega - ניתוח נתונים</td><td>BMG Labtech</td><td>MARS</td><td>FLUOstar ניתוח נתונים, גרסה 3.20R2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Excel:mac 2011</td><td>version 14.0.0</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>גרסה 7.0c</td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על hiv שעתוק ו שחבור

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV נותר ללא מרפא בשל קיומה של מאגר של תאים זה בנמלים טופס החבויים ויציבה של הנגיף, אשר נשאר בלתי נראה המערכת החיסונית, לא מכוון על ידי טיפול תרופתי הנוכחי (עגלה). שעתוק ו שחבור הוכחו לחזק את השהיה HIV-1 בנח תאי CD4 + T. היפוך של השהיה על ידי שימוש השהיה סוכנים היפוך (LRAs) הגישה "הלם ולהרוג" נחקר בהרחבה, בניסיון לטהר את המאגר הזה, אבל עד כה לא הראה כל הצלחה בניסויים קליניים עקב חוסר התפתחות נאותה קטנים מולקולות יכול ביעילות perturb את המאגר הזה. פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה אמינה ויעילה הערכת השהיה היפוך סוכנים (LRAs) ב- HIV שעתוק של שחבור. גישה זו מבוססת על השימוש הכתב צבע כפול מונחה משמאל לימין בו זמנית יכול למדוד את ההשפעה של חשבון גמלאות אישי על שעתוק ו שחבור על ידי cytometry זרימה. הפרוטוקול המתואר כאן מספיקה עבור תאים חסיד, כמו גם את התאים ההשעיה. זה שימושי לבדיקת מספר רב של תרופות במערכת תפוקה גבוהה. השיטה היא טכנית פשוטה ליישום וחסכונית. בנוסף, השימוש של cytometry זרימה מאפשר להערכת הכדאיות התא, ובכך תרופות רעילות באותו זמן.

נציג התוצאות מוצגות באיור 5 עבור הביטוי של HIV-1 unspliced (EGFP), משולבים המוצרים (DsRed) בעקבות טיפול עם מעכבי bromodomain JQ1. הן JQ1(+) והן בלשכת המידע לתיירים הגדילה משמעותית את אחוז התאים לבטא EGFP (FC 2.18 ו 4.13 מעל דימתיל סולפוקסיד בהתאמה; n = 3) מעידה על תעתיקים unspliced. יתר על כן, JQ1(+) גדל באופן משמעותי את אחוז התאים לבטא DsRed (46.6 FC מעל דימתיל סולפוקסיד) כמו גם היחס משולבים המוצר (7.37 FC מעל דימתיל סולפוקסיד) לרמה דומה מידה (FC 59.6 ו 5.83...

פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך במבחנה, את ההשפעה של השהיה היפוך סוכנים על עיבוד MRNA HIV. הפרוטוקול מספק שיטה יעילה ואמינה פשוטה להערכת, בו זמנית את ההשפעה של LRA על שעתוק HIV ושזור. טכניקה זו סיפקה תובנה על היכולת של LRAs לגרום להפעלה מחדש של וירוסים וסיווג של המאגר הסמוי.לאחר טיפוח תאים, מקום 20, 000 מהם 100 microliters של מדיום DMEM, בתוספת 10% FBS, וללא אנטיביוטיקה בארות של צלחת תחתונה שטוחה 96 היטב במשך 24 שעות. למחרת לדלל את מבנה כתב צבע כפול. ה-DNA של Tat ו-Rev ב-50 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום, ומערבבים בעדינות.מערבבים בעדינות את ריאגנט השומנים, ולאחר מכן מדללים 0.65 מיקרוליטרים שלו לכל תגובה ב-50 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום. מערבבים בעדינות, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מערבבים את ריג'נט השומנים המדולל עם הדנ"א המדולל ומערבבים בעדינות.דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, לוותר על 100 microliters של זה תסביך DNA ריג'נט השומנים טיפה חכם, על גבי התאים בכל באר. מטלטלים את הצלחת בעדינות קדימה ואחורה כדי לערבב.ולהדגור את הצלחת באינקובטור לח, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך חמש שעות. לאחר מכן, להדביק בארות נוספות עם 100 ננוגרם של CMV מונחה EGFP ו DsRed אקספרס DNA פלסמיד למטרות פיצוי. כדי להתחיל, לדלל כל סוכן היפוך השהיה למצב העבודה המתאים עם מדיום הצמיחה.בעזרת ראש צינור רב-ערוצי, ישאףו בזהירות את מדיום ההמרה, והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטרים של מדיום המכילים את סוכן היפוך ההשהיה המתאים. דגירה באינקובטור לח ב 37% צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. כדי להתחיל להכתים את התאים, השתמש בראש צינור רב ערוצי כדי להוסיף 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר.יש להצינור בעדינות את הראש למעלה ולמטה בערך חמש פעמים. תוך הקפדה להימנע מקצף כדי לנתק את התאים לתוך התקשורת. לאחר מכן, להעביר את התאים לתוך הבאר של צלחת V-התחתון 96 היטב.צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות. שאף את המדיום ואת PBS מבלי לגעת בתאים. לשטוף את התאים לפחות פעם אחת עם 200 microliters של חלבון PBS ללא סרום.צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות. להטות את הצלחת כדי להשליך את supernatant ולהסיר את מאגר לשטוף מבלי לגעת בתאים. לאחר מכן לדלל את צבע הכדאיות הקבוע בחלבון ו PBS ללא סרום ביחס של 1 עד 1000, כדי להכין פתרון עובד.מוסיפים 50 מיקרוליטרים של הצבע המדולל לכל באר, ומצינורים למעלה ולמטה כדי לערבב. דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בעוד מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום במשך 10 עד 15 דקות.לאחר מכן לשטוף את התאים פעם או פעמיים עם 150 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 500 פעמים כבידה, וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי. כדי לתקן את התאים, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של 1%פורמלדהיד טרי וחוצץ שטיפה.ודגירה בארבע מעלות צלזיוס בעוד מוגן מפני אור במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעם או פעמיים עם 100 microliters של חיץ לשטוף. צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות.השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את גלולת התא ב-70 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה. לאחר בדיקת הביצועים והרגישות של הגדרות הציטרומטר על ידי הפעלת קדילי כיול, כוונן את מתחי הפיזור קדימה וצד עם מדגם לא מוכתם, כך שהאוכלוסייה הראשית תהיה על המסך ותובחנה בבירור. בצע פיצוי ידני או אוטומטי באמצעות דגימות מוכתמות יחיד, הבטחת לשפוך מינימלי על האוכלוסייה החיובית EGFP לתוך גלאי DsRed ולהיפך.באמצעות הפלואורסצנטיות מינוס אחד שולט, ליצור חלקות ולהגדיר את השערים. לאחר מכן, התאימו את מתחי הפיזור קדימה וצד עם מדגם לא מוכתם, כך שהאוכלוסייה העיקרית נמצאת על המסך ומובחנת בבירור. רכוש והקליט מינימום של 10,000 אירועי תאים בני קיימא לכל מדגם.לאחר מכן, השתמש בתוכנה לניתוח נתונים של cytometry זרימה כדי לנתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תוצאות מייצגות לביטוי של HIV-1, מוצרים לא מרוסנים ושזורים, לאחר טיפול עם מעכבי bromodomain JQ1, מראים כי הן JQ1 חיובי ו Tat, להגדיל באופן משמעותי את אחוז התאים המבטאים EGFP. מה שמעיד על תעתיקים לא מרוסנים.JQ1 חיובי נראה גם להגדיל באופן משמעותי את אחוז התאים המבטאים DsRed. ולהגדיל את חלקו של מוצר שאנחנו שותק לרמות דומות כמו Tat. זה מאשר את היכולת של JQ1 חיובי להפעיל שעתוק HIV ושזור.עם זאת, טיפול עם שליטה stereoisomer JQ1 שלילי, מבטל את ההשפעה החיובית JQ1 על שעתוק HIV ושזור. לאחר השליטה, שיטה זו יכולה להתבצע באמצעות תרופות בנפרד או בשילוב. בודקים את היכולת שלהם לסינרגיה ביעילות.מה שיוביל למינון נמוך יותר של התרופה ורעילות. לאחר כל התפתחות, טכניקה זו סללה את הדרך לבדיקת שילובי תרופות יעילים במודלים ראשוניים של השהיה בדגימות של מטופלי אקס ויוו.

high-throughput-vitro-assessment-latency-reversing-agents-on-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating...

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

פתוגנזה של HIV-1 מוגדרת הן על ידי מאפיינים נגיפיים והן על ידי גורמים גנטיים של המארח. כאן אנו מתארים שיטה חזקה המאפשרת מדידות הניתנות לשחזור כדי להעריך את ההשפעה של וריאציה של רצף גן ה-gag על יכולת השכפול במבחנה של הנגיף.

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

מתוארות שיטות להערכת היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לשלבים שלאחר האינטגרציה של מחזור השכפול של HIV-1. שיטות אלו שימושיות לסינון מולקולות חדשות ולאופטימיזציה של הפורמט של מולקולות קיימות.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

דוח זה מתאר מבחן חוץ גופי למדידת פעילות האינטגרציה הקשורה לנגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) בתמציות הציטופלזמיות של תאים נגועים באופן חריף. השילוב של DNA HIV-1 הקשור ל-PIC ב-DNA מטרה הטרולוגי מכומת על ידי שימוש באסטרטגיית תגובת שרשרת פולימראז מקוננת בזמן אמת.

מדידה במבחנה פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

כאן אנו מציגים בגישה רצף עמוק המספקת של קביעה לא משוחדת של nascent-3' טרמיני, כמו גם פרופילים mutational של מולקולות דנ א חד גדילי. היישום העיקרי הוא אפיון nascent retroviral משלימים DNAs (cDNAs), intermediates שנוצר במהלך התהליך של retroviral שעתוק במהופך.

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

כאן, אנו מתארים כמה שיטות מבוססות לקביעת מתח רשתית אנדופלסמית (ER) והפעלת תגובת חלבון פרושה (UPR), עם דגש מיוחד על זיהום HIV-1. מאמר זה מתאר גם סדרה של פרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעה של מתח ER / UPR על שכפול HIV-1 והדבקה virion.

מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1

למד הערכה בתפוקה גבוהה של השפעת סוכני היפוך השהיה על שעתוק ושחבור HIV. שיטה זו מאפשרת הערכה סימולטנית של השפעת LRAs על עיבוד mRNA של HIV ותובנות לגבי הפעלה מחדש של הנגיף.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

גלה סרטונים נוספים