Name: ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: חקור את השפעת זרימת גזירה על נדידת תאי B מאזור שולי במבחנה. השיטה משתמשת ביחידת זורמים ומיקרוסקופיה לניתוח תנועת תאים חיסוניים ומספקת כלי נגיש לחקר דינמיקת תאים בזרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של 854/TP11 SFB "פתוח" ק-DF.

<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li>
<li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1%2C+ICAM-2%2C+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest%2C+polarization%2C+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li>
<li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li>
<li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li>
<li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li>
<li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li>
<li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+way+out%3A+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li>
<li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginal+zone+B+cells%3A+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
<li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261(2017).</li>
<li>ImageJ. MTrack2. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018).</li>
<li>MTrack2. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018).</li>
<li>ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).</li>
<li>ImageJ. Manual Tracking. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018).</li>
<li>ibidi. ibidi Pump System. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. ">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. </a> (2018).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

נתאר כאן שיטה לניתוח ההעברה של תאי הכוח של הטיה זרימה ויוכל להגיב על-ידי שינוי ההגירה שלהם. ניתוח של MZBs הראה כי MZBs להעביר באופן ספונטני על ICAM-1, בנוכחות זרימה, להעביר את הזרם. בעבודה הקודמת, הראינו כי MZBs אינן מעבירות את הזרם על VCAM-1 אבל במקום זה יישאר קבוע במקום. מאתר הטחול אזור שוליים מכיל בעיקר ICAM-1, בעוד כשלקוח אדום מכיל ICAM-1 והן VCAM-1. מנתונים אלה, זה יכול להיות להסיק כי MZBs להעביר את הזרם בזמן את אזור שוליים אך לא את כשלקוח אדום. הניתוח אומתה ויוו באמצעות MZBs עם אדהזיה פגום זה היו mislocalized כדי כ...

תאים חיסוניים תאי תאי ביותר בגוף האדם, לעיתים קרובות חייב להתמודד עם כוח ההטיה של זרימת הדם והלימפה. עם זאת, ישנם מחקרים מעטים יחסית על הגירה הנוצרות על-ידי כוח ההטיה של לויקוציטים1,2,3,4,5. אנו מציגים כאן פרוטוקול אמין ולא כמותיים כדי לנתח את התגובה של תא החיסון לזרימה במבחנה. ביצוע וזמינותו אינו דורש ייצור של רכיבים, כל הציוד והחומרים המתכלים הם זמינים מסחרית. הפרוטוקול, כולל ניתוח טיהור והעברה של התא, יכול להתבצע ביום אחד. בסופו של דבר, למרות שאנחנו מתארים את ההעברה של אזור שוליים B תאים (MZBs), הפרוטוקול ניתן להתאים לנתח את ההעברה נגד זרימה של סוגים אחרים של תאים חיסוניים. לכן, זה ריאלי לשימוש הזה assay לנתח באופן שיטתי מגוון רחב של לויקוציטים עם פאנל מקיף של תנאים.
MZBs הם אוכלוסייה של תאי B המצויים, העכבר, רק הטחול ואת הסעות בין הפנים של זקיקים8,97,6,אזורי שוליים. אזור שולית היא שכבה של תאים חיסוניים כ 5-10 תאים עבים. השכבה תא עוטפת הזקיק, מורכב בעיקר MZBs, המקרופאגים אבל גם הטבעית הקבועה הרוצח בתאי T (iNKT), תאים דנדריטים (Dc), נויטרופילים, בין היתר10. התאים באזור שוליים חשופים זרימת הדם חד כיווני שמקורם עורקים הטחול לסיים בסינוס שוליים סביב הזקיק. הדם זורם חורים הסינוס שולי דרך אזור שולית היא שליקט סינוסים ורידים בכשלקוח אדום ואז לשחזר את מחזור11. זרימה חופשית של דם שוטף MZBs, וחושפת אותם בפני אנטיגנים נישא בדם. MZBs נושא אנטיגן לתוך הזקיק על ידי הליכה הלוך ושוב באופן אוטומטי בין אזור שולי בתוך הזקיק, אשר אינה נחשפת דם. לפיכך, כמו הסעות MZBs כלפי הזקיק, הם עליך להעביר הכוח הטיה של זרימת דם12 (איור 1 א').
פרוטוקול זה, אנו נתאר כיצד באופן כמותי לקבוע איך החיסון תאים כגון MZBs להגיב אין זרימה או זרימה גבוהה במבחנה, כדי לגלות איך הם מתוכנתים להעביר בתוך vivo. בשלב הראשון, MZBs כבר טהור מן הטחול העכבר באמצעות beads מגנטי מצמידים נוגדנים של ערכות זמינים מסחרית. MZBs טרי מבודד הציג לתוך הבאר של שקופית קאמרית זרימה, מותר להתיישב על ליגנדים אינטגרין, חשוף לזרימה של מאגר העברה באמצעות מערכת משאבת (איור 2 א). התאים הם צילמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות. התמונות מעובדות ואז לניתוח עם תוסף ImageJ חינם, MTrack213,14, לעקוב באופן אוטומטי את התאים. רצועות ואז שניתן לכמתו חינם Ibidi כימוטקסיס כלי15 כדי לקבוע פרמטרים שונים כולל מהירות, יושר אינדקס ההעברה. ערכים אלה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של מעכבי ההעברה, תכשירים תא, נוגדנים וכימיקלים אחרים שמשפיעים על ההעברה על ההעברה הטיה זרימה המושרה על מנת להבין את כוחות שליטה תא החיסון תנועה ויוו.

<table><tbody><tr><td>מסננת תאים VWR, 70 ומיקרו; m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>מסנני הפרדה מראש, 30 ומיקרו; m</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאים MZB ו- FOB</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-366</td><td></td></tr><tr><td>B220 CD45R, שיבוט RA3-6B2, FITC</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>CD21 / CD 35, שיבוט 7G6, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>558658</td><td></td></tr><tr><td>CD23, שיבוט B3B4, PE</td><td>Biolegend</td><td>101608</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Biochrom</td><td>L2035</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS 1x</td><td>Gibco של Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>BSA אלבומין חלק V, ללא חומצות שומן</td><td>Roth</td><td>"0052.3"</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>796-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi &micro;-slides VI 0.4, הידרופובי, לא מצופה</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>סט זלוף, לבן, 50 ס"מ, 0.8 מ"מ</td><td>Ibidi</td><td>10963 Ibidi 10963</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi</td><td></td><td>10902</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי b מאתר אזור שולי במבחנה

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

אזור שוליים B תאים (MZBs) הם אוכלוסיה של תאי B השוכנים באזורי העכבר הטחול שולית אופפים זקיקים. כדי להגיע הזקיקים, MZBs עליך להעביר את הכוח הטיה של זרימת הדם. אנו מציגים כאן שיטה לניתוח תזרים-induced MZB העברה זו במבחנה. ראשית, MZBs מבודדים מן הטחול העכבר. שנית, MZBs התיישבו על ליגנדים אינטגרין בשקופיות קאמרית זרימה, חשוף להטיית זרימה, עם תמונה תחת מיקרוסקופ בעת העברת. שלישית, תמונות של MZBs העברת מעובדים שימוש בתא MTrack2 אוטומטי מעקב תוסף עבור ImageJ, הרצועות תא וכתוצאה מכך הם לכמת באמצעות הכלי כימוטקסיס Ibidi. העברת הנתונים לחשוף כמה מהר להעביר התאים, באיזו תדירות הם משנים כיוון, אם הווקטור זרימה ' הטיה ' משפיעה על כיוון ההגירה שלהם, ליגנדים אינטגרין אשר מעורבים. אמנם אנו משתמשים MZBs, שיטת בקלות ניתן להתאים לניתוח העברה של כל ליקוציט המגיבה לכוח של זרימה הטיה.

אנחנו נעשה שימוש בפרוטוקול שפורטו לעיל כדי להשוות בין העברה של MZBs בשקופיות ICAM-1-מצופה ללא זרימה (0 רמות דינ/cm2) ונחשף להטיית זרימה (4 רמות דינ/cm2). התאים היו מעקב באופן אוטומטי עם MTrack2, המסלול וכתוצאה מכך קבצים פרסו לקולנוע ההעברה לתא של אין זרימת (0 רמות דינ/cm2) ו- (4 רמות דינ/cm2) כדי להראות את התפלגות והצורה של המסילה (איור 4A). תא רצועות ואז יובאו לתוך הכלי כימוטקסיס Ibidi (ICT) כדי ליצור מסלול חלקות כ...

אזור שוליים B תאים (MZBs) להגיב בכוח גזירה זרימה על ידי מחדש המכוונת את נתיב הנדידה שלהם כן. פרוטוקול זה מראה כיצד לתעד ולנתח את ההעברה באמצעות יחידת פלואידיקה, משאבה, מערכת הדמיה במיקרוסקופ, תוכנה חופשית.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

שיטה זו יכולה לעזור להבין שאלות מפתח בתחום נדידת התאים החיסוניים, כגון כיצד הציטוסקלטון שולח כוחות הגזירה וכיצד ליגנדים וכימותרפינים לאtegrin משפיעים על הגירה הנגרמת על ידי זרימה של לויקיטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה סוג חדש של התראת הגירה שקל למתחילים לבצע. היא משתמשת רק בציוד מסחרי זמין reagents, כמו גם תוכנה חופשית.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך תאים אזור שולי B, זה יכול להיות מיושם גם על תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי T פעילים. ביום שלפני הניסוי, להפשיר aliquot של ICAM-1, ולדלל אותו PBS לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטרים של ICAM-1 לחדרים הרצויים של מגלשת זרימה.מניחים את השקופית לתוך תא לח, ולהגדיר אותו בארבע מעלות צלזיוס כדי דגירה לילה. למחרת, לשטוף את התא על ידי הוספת 100 microliters של PBS ל הבאר אחת ולאחר מכן משיכת 100 microliters מה באר השנייה של התא. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של חיץ חסימה לתא, ולהדגיר את השקופית בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.לאחר מכן, לשטוף את התא על ידי הוספת 100 microliters של PBS ל הבאר אחת, משיכתו מן הבאר השנייה, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של חיץ הגירה לתא. השקופית מוכנה כעת לשימוש. אחסן אותו בתא לח בטמפרטורת החדר עד הניסוי.ראשית, חבר משאבת נוזלים, ולחבר את יחידת fluidics. לאחר מכן, הפעל את תוכנת המשאבה. לאחר מכן, לשטוף את הצינורות פעם אחת עם חמישה עד 10 מיליליטר של חיץ הגירה.זה ייקח בערך דקה אחת. לאחר מכן, הוסף 11.7 מיליליטר של מאגר הגירה באופן שווה לשני המאגרים, והסר את בועות האוויר. עכשיו, להדק את הצינורות על 10 ס"מ מהחתיכה המחבר, ולמקם את היחידה הנוזלית בתא הדגירה המחומם על המיקרוסקופ.בתוכנה, הגדר את בחירת השקופית למיקרו-החלקה VI 0.4 ואת אפשרות הצינור ללבן. כמו כן, הגדר את הלחץ הגזירה הרצוי סביב ארבעה dynes לכל סנטימטר מרובע ואת זמן ההדמיה ל 30 דקות. לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה הרצוי ואת הלחץ הגזיר על-ידי הזנת הערכים לתוכנת המשאבה.לאחר מכן, מחממים מראש את תא הדגירה של המיקרוסקופ, יחידת הנוזלים ומאגר הנדידה ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר החום, בדוק את המשאבה הנוזלית, כדי להבטיח כי מאגר הנדידה זורם הלוך ושוב במאגרים, כי אין בועות אוויר במערכת. ראשית, לבודד לויוציטים, ולטהר את תאי אזור B השוליים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.לאחר מכן, נקה את תחתית המגלשה עם רקמה מעומעמת באתנול. הוסף 30 microliters של ההשעיה התא לתוך באר אחת של התא, ולמשוך 30 microliters של מאגר הנדידה המאוחסן מה באר השנייה. מכסים את השקופית, ו דגירה אותו במשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף.לאחר מכן, הוסף באיטיות מאגר הגירה מחומם מראש לכל באר של השקופית עד שמניסקוס חיובי עולה מה הבאר. הסר את כל בועות האוויר עם קצה פיפטה. חשוב לשמור על עקביות עם גורמים המשפיעים על הידבקות התא, ולכן לשמור על המאגרים והתאים ב 37 מעלות, ולהימנע משימוש בכוח מופרז בעת צינור החיץ לתוך התא.מהדקים את השקופית לשלב המיקרוסקופ ומסירים את הצד הלא מסומן של הצינור הנוזלי מפיסת המחבר. לאחר מכן, למלא את הקצה של צינורות עם חיץ הגירה עד מניסקוס חיובי ללא בועות אוויר עולה מהסוף. הופכים את קצה הצינור, ומכניסים אותו לתוך הטופ של תא הזרימה.תוך שמירה על צינורות מהודק, לחזור על ההליך עבור הקצה המסומן של הצינור. כעת, העבר את מערכת ההדמיה למצב Live ובחר שדה תצוגה באמצע השקופית. כאן, להגדיר את המיקוד על התאים, ולאחר מכן לבטל את המיקוד מעט כדי לשפר את קווי המתאר השחורים של התאים לייצר פנים לבן.הרקע השחור והמרכז הלבן יהיו קלים יותר לשימוש בתוכנית המעקב האוטומטית. הגדר את תוכנית רצף ההדמיה כדי להקליט תמונה אחת כל חמש שניות במשך 30 דקות באמצעות מטרה יבשה 10x. לאחר מכן, התחל להקליט.מוציאים את המהדק מהצנרת, ומפעילים את המשאבה. פעולה זו תגרום לתאים שאינם חסידים להישטף ולתאים חסידים להתחיל להגר. בסוף תוכנית ההדמיה, תייג ושמור את הסרט.אם אתה משתמש במעכב או במגביל של העברת תאים, ניתן להוסיף אותו לתאים בהשעיית התא לפני הצבתם בשקופית או למאגר ההעברה ביחידת fluidics. כדי להתחיל בניתוח אוטומטי של מסלול העברה, פתח את התוכנית ImageJ. העתק את MTrack2_kt Java לתיקיה תוספים של ImageJ.תחת תפריט תוספים, בחר בצע הידור והפעלה. לאחר מכן, הפעל מחדש את ImageJ והתוסף אמור להופיע בתפריט תוספים. פתח את ערימת התמונות מסרט העברת התאים ב- ImageJ, ועיבד את התמונות כפי שמוצג כאן כדי להמיר את הווידאו ממסגרות צבע לתמונות חדות גבוהה המציגות את התאים כאובייקטים שחורים על רקע לבן.לאחר מכן, חידדו את התמונות פעמיים, תיעבו את התמונות ולאחר מכן המירו את התמונות לשמונה סיביות. בתפריט תמונה, עבור לתפריט המשנה כוונון בהירות/ניגודיות והצב את המחוון חדות בניגוד מרבי. פעולה זו תגרום לתאים להופיע כאובייקטים לבנים על רקע שחור.לאחר מכן, חזור לת תפריט המשנה התאמת סף כדי להבטיח שהתאים יופיעו כאובייקטים שחורים על רקע לבן. עכשיו, להפעיל את תוסף מעקב התא האוטומטי MTrack2 kt. במסך האפשרויות, הגדר את גודל החלקיק לפיקסל אחד ואת גודל החלקיק ל- 30 פיקסלים לכל היותר.הגדר את ערך המהירות ל- 10 פיקסלים, אם כי תאי B של אזור שולי בדרך כלל לא יחרגו משני פיקסלים במסגרות עוקבות במרחק של חמש שניות זה מזה. רצועות התא מוכנות כעת לניתוח באמצעות כלי ibidi Chemotaxis. שני שדות אלה מציגים את נתיבי ההעברה של תאי אזור B שוליים שזרעו בשקופיות מצופות ICAM-1.התאים היו במעקב אוטומטי עם MTrack2 באמצעות השיטות המתוארות במאמר זה. בצד שמאל, תאים דימוי בתנאים סטטיים, ועל התאים הימניים נחשפו לזרימת גימה של ארבעה dynes לסנטימטר מרובע. רצועות התא הבודד ניתן לייבא לתוך כלי ibidi Chemotaxis כדי ליצור עלילות מסלול של כל סרט.כאן, רצועות התא הבודדות צבועות באדום כדי לציין שהן הסתיימו במורד הזרם של נקודת המוצא או השחורה שלהן אם הן הגיעו במעלה הזרם. ניתוח רצועות תא מארבעה סרטים בודדים הן לזרימה והן ללא תנאי זרימה מוצגים כאן. הדבר כולל את מדד ההעברה הכיוונית הממוצע, מהירות התא, ישרות הנתיב ומרחק הקו הישר הסופי עבור שני התנאים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך להבין גם כיצד לזהות את הנדידה הכיוונית של תאי B של אזור שוליים לכיוון זרימת הגזרה וכיצד לעקוב אחר התאים באופן אוטומטי. במהלך הליך זה, שיטות אחרות כגון מיקרוסקופ TIRF ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד cytoskeleton ו integrins להגיב ללחץ גזירה?

analysis-shear-flow-induced-migration-murine-marginal-zone-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T...

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

מכשיר תא הזרימה תלת ממדים הוא...

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

מתואר מבחן בעכברים למעקב אחר נדידת תאים מהעור לבלוטת הלימפה המנקזת המאפשר אפיון של תאים דנדריטיים בעור המגויסים לבלוטת הלימפה לאחר זיהום כרית כף הרגל ב-Bacille Calmette-Guérin.

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

כאן, אנו מתארים מודל מחסום דם-מוח אנושי המאפשר לחקור גלגול לימפוציטים למערכת העצבים המרכזית במבחנה.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

כאן אנו מתארים שיטה של הבעה overexpression והעברה המאמצת של תאים מורנין ב-1a כדי לבחון ב vivo B-1a תא הגירה ולוקליזציה. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור שונים הזרם התפקודי של המטה אומר כולל כימות של לוקליזציה של התורם B-1a או ניתוח של הגורמים הנגזרים לתא התורם הנגזר לאחר העברה המאמצת.

Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

חקור את השפעת זרימת גזירה על נדידת תאי B מאזור שולי במבחנה. השיטה משתמשת ביחידת זורמים ומיקרוסקופיה לניתוח תנועת תאים חיסוניים ומספקת כלי נגיש לחקר דינמיקת תאים בזרימה.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

גלה סרטונים נוספים