ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

שיטה זו יכולה לעזור להבין שאלות מפתח בתחום נדידת התאים החיסוניים, כגון כיצד הציטוסקלטון שולח כוחות הגזירה וכיצד ליגנדים וכימותרפינים לאtegrin משפיעים על הגירה הנגרמת על ידי זרימה של לויקיטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה סוג חדש של התראת הגירה שקל למתחילים לבצע. היא משתמשת רק בציוד מסחרי זמין reagents, כמו גם תוכנה חופשית.

למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך תאים אזור שולי B, זה יכול להיות מיושם גם על תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי T פעילים. ביום שלפני הניסוי, להפשיר aliquot של ICAM-1, ולדלל אותו PBS לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטרים של ICAM-1 לחדרים הרצויים של מגלשת זרימה.

מניחים את השקופית לתוך תא לח, ולהגדיר אותו בארבע מעלות צלזיוס כדי דגירה לילה. למחרת, לשטוף את התא על ידי הוספת 100 microliters של PBS ל הבאר אחת ולאחר מכן משיכת 100 microliters מה באר השנייה של התא. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של חיץ חסימה לתא, ולהדגיר את השקופית בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.

לאחר מכן, לשטוף את התא על ידי הוספת 100 microliters של PBS ל הבאר אחת, משיכתו מן הבאר השנייה, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של חיץ הגירה לתא. השקופית מוכנה כעת לשימוש. אחסן אותו בתא לח בטמפרטורת החדר עד הניסוי.

ראשית, חבר משאבת נוזלים, ולחבר את יחידת fluidics. לאחר מכן, הפעל את תוכנת המשאבה. לאחר מכן, לשטוף את הצינורות פעם אחת עם חמישה עד 10 מיליליטר של חיץ הגירה.

זה ייקח בערך דקה אחת. לאחר מכן, הוסף 11.7 מיליליטר של מאגר הגירה באופן שווה לשני המאגרים, והסר את בועות האוויר. עכשיו, להדק את הצינורות על 10 ס"מ מהחתיכה המחבר, ולמקם את היחידה הנוזלית בתא הדגירה המחומם על המיקרוסקופ.

בתוכנה, הגדר את בחירת השקופית למיקרו-החלקה VI 0.4 ואת אפשרות הצינור ללבן. כמו כן, הגדר את הלחץ הגזירה הרצוי סביב ארבעה dynes לכל סנטימטר מרובע ואת זמן ההדמיה ל 30 דקות. לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה הרצוי ואת הלחץ הגזיר על-ידי הזנת הערכים לתוכנת המשאבה.

לאחר מכן, מחממים מראש את תא הדגירה של המיקרוסקופ, יחידת הנוזלים ומאגר הנדידה ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר החום, בדוק את המשאבה הנוזלית, כדי להבטיח כי מאגר הנדידה זורם הלוך ושוב במאגרים, כי אין בועות אוויר במערכת. ראשית, לבודד לויוציטים, ולטהר את תאי אזור B השוליים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לאחר מכן, נקה את תחתית המגלשה עם רקמה מעומעמת באתנול. הוסף 30 microliters של ההשעיה התא לתוך באר אחת של התא, ולמשוך 30 microliters של מאגר הנדידה המאוחסן מה באר השנייה. מכסים את השקופית, ו דגירה אותו במשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף.

לאחר מכן, הוסף באיטיות מאגר הגירה מחומם מראש לכל באר של השקופית עד שמניסקוס חיובי עולה מה הבאר. הסר את כל בועות האוויר עם קצה פיפטה. חשוב לשמור על עקביות עם גורמים המשפיעים על הידבקות התא, ולכן לשמור על המאגרים והתאים ב 37 מעלות, ולהימנע משימוש בכוח מופרז בעת צינור החיץ לתוך התא.

מהדקים את השקופית לשלב המיקרוסקופ ומסירים את הצד הלא מסומן של הצינור הנוזלי מפיסת המחבר. לאחר מכן, למלא את הקצה של צינורות עם חיץ הגירה עד מניסקוס חיובי ללא בועות אוויר עולה מהסוף. הופכים את קצה הצינור, ומכניסים אותו לתוך הטופ של תא הזרימה.

תוך שמירה על צינורות מהודק, לחזור על ההליך עבור הקצה המסומן של הצינור. כעת, העבר את מערכת ההדמיה למצב Live ובחר שדה תצוגה באמצע השקופית. כאן, להגדיר את המיקוד על התאים, ולאחר מכן לבטל את המיקוד מעט כדי לשפר את קווי המתאר השחורים של התאים לייצר פנים לבן.

הרקע השחור והמרכז הלבן יהיו קלים יותר לשימוש בתוכנית המעקב האוטומטית. הגדר את תוכנית רצף ההדמיה כדי להקליט תמונה אחת כל חמש שניות במשך 30 דקות באמצעות מטרה יבשה 10x. לאחר מכן, התחל להקליט.

מוציאים את המהדק מהצנרת, ומפעילים את המשאבה. פעולה זו תגרום לתאים שאינם חסידים להישטף ולתאים חסידים להתחיל להגר. בסוף תוכנית ההדמיה, תייג ושמור את הסרט.

אם אתה משתמש במעכב או במגביל של העברת תאים, ניתן להוסיף אותו לתאים בהשעיית התא לפני הצבתם בשקופית או למאגר ההעברה ביחידת fluidics. כדי להתחיל בניתוח אוטומטי של מסלול העברה, פתח את התוכנית ImageJ. העתק את MTrack2_kt Java לתיקיה תוספים של ImageJ.

תחת תפריט תוספים, בחר בצע הידור והפעלה. לאחר מכן, הפעל מחדש את ImageJ והתוסף אמור להופיע בתפריט תוספים. פתח את ערימת התמונות מסרט העברת התאים ב- ImageJ, ועיבד את התמונות כפי שמוצג כאן כדי להמיר את הווידאו ממסגרות צבע לתמונות חדות גבוהה המציגות את התאים כאובייקטים שחורים על רקע לבן.

לאחר מכן, חידדו את התמונות פעמיים, תיעבו את התמונות ולאחר מכן המירו את התמונות לשמונה סיביות. בתפריט תמונה, עבור לתפריט המשנה כוונון בהירות/ניגודיות והצב את המחוון חדות בניגוד מרבי. פעולה זו תגרום לתאים להופיע כאובייקטים לבנים על רקע שחור.

לאחר מכן, חזור לת תפריט המשנה התאמת סף כדי להבטיח שהתאים יופיעו כאובייקטים שחורים על רקע לבן. עכשיו, להפעיל את תוסף מעקב התא האוטומטי MTrack2 kt. במסך האפשרויות, הגדר את גודל החלקיק לפיקסל אחד ואת גודל החלקיק ל- 30 פיקסלים לכל היותר.

הגדר את ערך המהירות ל- 10 פיקסלים, אם כי תאי B של אזור שולי בדרך כלל לא יחרגו משני פיקסלים במסגרות עוקבות במרחק של חמש שניות זה מזה. רצועות התא מוכנות כעת לניתוח באמצעות כלי ibidi Chemotaxis. שני שדות אלה מציגים את נתיבי ההעברה של תאי אזור B שוליים שזרעו בשקופיות מצופות ICAM-1.

התאים היו במעקב אוטומטי עם MTrack2 באמצעות השיטות המתוארות במאמר זה. בצד שמאל, תאים דימוי בתנאים סטטיים, ועל התאים הימניים נחשפו לזרימת גימה של ארבעה dynes לסנטימטר מרובע. רצועות התא הבודד ניתן לייבא לתוך כלי ibidi Chemotaxis כדי ליצור עלילות מסלול של כל סרט.

כאן, רצועות התא הבודדות צבועות באדום כדי לציין שהן הסתיימו במורד הזרם של נקודת המוצא או השחורה שלהן אם הן הגיעו במעלה הזרם. ניתוח רצועות תא מארבעה סרטים בודדים הן לזרימה והן ללא תנאי זרימה מוצגים כאן. הדבר כולל את מדד ההעברה הכיוונית הממוצע, מהירות התא, ישרות הנתיב ומרחק הקו הישר הסופי עבור שני התנאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך להבין גם כיצד לזהות את הנדידה הכיוונית של תאי B של אזור שוליים לכיוון זרימת הגזרה וכיצד לעקוב אחר התאים באופן אוטומטי. במהלך הליך זה, שיטות אחרות כגון מיקרוסקופ TIRF ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד cytoskeleton ו integrins להגיב ללחץ גזירה?