Name: Micronization מכני של Lipoaspirates לטיפול רגנרטיבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: למדו שיטה מכנית לבידוד SVF מרקמת שומן ללא קולגנאז, תוך שימור המטריצה החוץ-תאית. הפרוטוקול מציע חלופה בטוחה לחלץ תאי גזע לרפואה רגנרטיבית ולהנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81471881, 81601702, 81671931), קרן מדעי הטבע של גואנג-דונג פרובינציה של סין (2014A030310155), מנהל קרן של Nanfang החולים (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

מחקר זה אושרה על ידי ועדת הבדיקה האתית Nanfang חולים, גואנגג'ואו, סין. רקמת שומן נאסף מתורמים מאוד בריאים שנתן בכתב הסכמה מדעת להשתתף במחקר. כל ניסויים בבעלי חיים היו אושרה על ידי Nanfang החולים טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה וביצע בהתאם לקווים המנחים של בריאות לאומי המועצה למחקר רפואי (סין).
1. הכנה ECM/SVF-ג'ל
<ol><li>שמן הקציר.<ol>
<li>לבצע שאיבת שומן על אדם עם בצינורית מרובה 3 מ מ, אשר מכילה מספר חורים חד צדדי של 1 מ מ קוטר, ב-0.75 atm של לחץ היניקה.</li>
		<li>אוספים 200 מ של lipoaspirates בשקית סטרילית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין שמן קולמן.<ol>
<li>להעביר את lipoaspirates לתוך צינורות 50 מ ל ארבע ולאפשר את השומן שנקטפו לעמוד עדיין למשך 10 דקות.</li>
		<li>לאסוף את השומן על השכבה העליונה לתוך שני צינורות 50 מ ל באמצעות פיפטה רחב-עצה להעביר, למחוק את החלק הנוזלי על השכבה התחתונה.</li>
		<li>באמצעות צינורות 50 מ ל, centrifugate על שכבת השומן ב 1,200 x g בטמפרטורת החדר (RT) למשך 3 דקות.</li>
		<li>מגדירים השכבה העליונה (כ 80 מ ל) שמן קולמן.</li>
		<li>להעביר 2/3 העליון של השומן קולמן צינור בפטרת באמצעות פיפטה רחב-עצה ולהגדיר את החלק הזה כשומן בצפיפות נמוכה.</li>
		<li>להעביר 1/3 התחתון של השומן קולמן עוד צינור בפטרת באמצעות פיפטה רחב-עצה ולהגדיר את החלק הזה כשומן בצפיפות גבוהה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לייצר ECM/SVF-ג'ל משומן בצפיפות נמוכה.<ol>
<li>באמצעות שני מזרקים 20 מ"ל מחובר על ידי מחבר נעל-סכינים סטריליים נקבה לנקבה (עם קוטר פנימי של 2.4 מ מ) intershift 20 מ של שמן בצפיפות נמוכה.</li>
		<li>לשמור על מהירות הסטה יציב (20 מ ל/s) וחזור עבור x 6 8 x.</li>
		<li>Centrifugate התערובת על 2,000 x g ב- RT למשך 3 דקות.</li>
		<li>לאסוף את החלק שמן על גבי צינור 10 מ"ל, באמצעות פיפטה רחב-טיפ של RT לשימוש נוסף.</li>
		<li>לאסוף את החומר הדביק בתוך השכבה האמצעית, המהווה SVF/ECM-ג'ל (איור 1א'), באמצעות פיפטה של wide-עצה, ולמחוק את הנוזל על השכבה התחתונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לייצר ECM/SVF-ג'ל משומן בצפיפות גבוהה.<ol>
<li>הוסף 5 מ ל שמן (שנאספו משלב 1.3.4) 15 מ"ל של שומן בצפיפות גבוהה.</li>
		<li>Intershift השומן מעורבים בין מזרקים 6 x 8 x עד flocculate נוצרת בתוך האמולסיה.</li>
		<li>Centrifugate התערובת על 2,000 x g ב- RT למשך 3 דקות.</li>
		<li>למחוק את החלק שמן על גבי.</li>
		<li>לאסוף את החומר הדביק בתוך השכבה האמצעית (ECM/SVF-ג'ל) באמצעות פיפטה רחב-עצה ולמחוק את הנוזל על השכבה התחתונה.</li>
		<li>מערבבים ECM/SVF-הג'ל מן השלבים 1.3.5 ו 1.4.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. דגם ה-ECM/SVF-ג'ל שתל עכבר ערום
<ol><li>עזים ומתנגד העכברים עירום (8 שבועות הישן, נקבה) עם איזופלוריין (1% - 3%) שאיפת הרדמה בחדר הניתוח בעלי חיים.</li>
	<li>להעביר את ה-ECM/SVF-הג'ל מזרק 1 מ"ל.</li>
	<li>לחבר את המזרק 1 מ"ל בצינורית חדירה בוטה.</li>
	<li>הכנס את הצינורית subcutaneously בכל אגף של העכבר.</li>
	<li>להזריק mL 0.3 של ECM/SVF-הג'ל.</li>
</ol>3. רקמות קציר 3, 15 ו- 90 ימים לאחר ההזרקה ECM/SVF-ג'ל
<ol><li>עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין (1% - 3%) שאיפת הרדמה.</li>
	<li>להקריב את העכברים בשיטת נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>לעשות חתך בקו האמצע של העור הגבי של העכבר עם מספריים כירורגיים.</li>
	<li>לנתח ולקצור את השתלים שמן משני הצדדים של העכבר. להטביע את השתלים שמן paraformaldehyde 4% ב RT בן לילה.</li>
	<li>מייבשים את הרקמה להגדיל את ריכוזי אתנול: 70% אתנול, שני שינויים, 1 h כל; 80% אתנול, שינוי אחד, 1 h; 95% אתנול, שינוי אחד, 1 h; 100% אתנול, שלושה שינויים, 1.5 h כל; קסילן, שלושה שינויים, 1.5 שעות כל אחד.</li>
	<li>לחדור את הרקמה עם פרפין (58-60 ° C), שני שינויים, 2 h.</li>
	<li>להטביע את הרקמה לגושי פרפין. לחתוך קטעים-עובי של 4 מיקרומטר ולשים אותם על שקופיות.</li>
</ol>4. hematoxylin ואאוזין מכתים
<ol><li>Deparaffinize השקופיות בלוק פראפין בהשריה של קסילן אני II, III (10 דקות כל אחד).</li>
	<li>נתרענן הסעיפים רקמות על ידי הכנסתם הפחתת ריכוז (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) של אתנול אמבטיות למשך 3 דקות.</li>
	<li>יש לשטוף את המקטעים רקמות במים מזוקקים (5 דקות).</li>
	<li>כתם בסעיפים רקמות hematoxylin במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף את הסעיפים הרקמה הקשה במים במשך 20 דקות Decolorize זורמים ב 1% אלכוהול חומצה (1% HCl ב-70% אלכוהול) עבור 5 ס' שטיפה במים ברז זורמים עד הסעיפים כחולות שוב.</li>
	<li>להוסיף 2-3 טיפות של Eosin Y לצבוע ישירות על השקופיות באמצעות פיפטה, והנח את צבען להגדיר עבור 10 דקות.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות במי ברז למשך 1-5 דקות.</li>
	<li>מייבשים את השקופיות להגדיל את ריכוז (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) אתנול למשך 3 דקות.</li>
	<li>נקה השקופיות קסילן I ו- II למשך 5 דקות.</li>
	<li>הר בשקופיות הרכבה מדיה.</li>
</ol>5. immunofluorescent מכתים
<ol><li>Deparaffinize בסעיפים רקמות קסילן אני II, III (5 דקות כל אחד).</li>
	<li>נתרענן הסעיפים רקמות על ידי הכנסתם ריכוזים שונים (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) של אמבטיות אלכוהול למשך 3 דקות.</li>
	<li>דגירה הסעיפים בפתרון2 O 3% H2ב- RT. מתנול עבור 10 דקות.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות 2 x עם מים מזוקקים, 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>שחרר את השקופיות סל שקופיות. מוסיפים 300 מ ל 10 מ מ ציטראט מאגר (pH 6.0), דגירה השקופיות ב 95-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>מגניב השקופיות RT כעשרים דקות.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות 2 x עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של 10% הסרום שור העובר על השקופיות, דגירה בתוך תא humidified ב RT לשעה.</li>
	<li>דגירה הסעיפים עם נוגדן ראשוני פתרון (שפן אנטי עכבר Perilipin, 1:400) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות עם PBS 3 x, 5 דקות.</li>
	<li>דגירה הסעיפים עם פתרון נוגדנים משניים (אג חזיר אנטי-גינאה עז-488) עבור 2 h-RT.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות עם PBS 3 x, 5 דקות.</li>
	<li>. נגבי את המים סביב הסעיף בנייר טישו נקי.</li>
	<li>ירידה 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ו- isolectin מצומדת אלקסה עבור חיל הים 488 אל המעגל כדי לכסות את החלק בשקופית.</li>
	<li>הר על coverslips ולתת להן להתייבש בחושך.</li>
	<li>לצפות בשקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>

<ol><li>Bateman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fat+to+Fight+Disease%3A+A+Systematic+Review+of+Non-Homologous+Adipose-Derived+Stromal%2FStem+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies.</a> Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).</li>
<li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%3A+tissue+localization%2C+characterization%2C+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. , 812693(2012).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).</li>
<li>Halme, D. G., Kessler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+regulation+of+stem-cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FDA regulation of stem-cell-based therapies.</a> New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>van Dongen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intraoperative+procedures+for+isolation+of+clinical+grade+stromal+vascular+fraction+for+regenerative+purposes%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).</li>
<li>van Dongen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractionation+of+adipose+tissue+procedure+to+obtain+stromal+vascular+fractions+for+regenerative+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).</li>
<li>Mashiko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Micronization+of+Lipoaspirates%3A+Squeeze+and+Emulsification+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micronized+cellular+adipose+matrix+as+a+therapeutic+injectable+for+diabetic+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer.</a> Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+flap+survival+improvement+by+composition-selective+fat+grafting+with+novel+adipose+tissue+derived+product+-+stromal+vascular+fraction+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).</li>
<li>Tonnard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofat+grafting%3A+basic+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Nanofat grafting: basic research and clinical applications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Extracellular+Matrix%2FStromal+Vascular+Fraction+Gel%3A+A+Novel+Adipose+Tissue-Derived+Injectable+for+Stem+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting%3A+A+New+Method+for+Tissue+Volumization+and+Rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation.</a> Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Volume+Retention+of+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting+with+Enhanced+Angiogenesis+and+Adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+stem+cell-derived+exosomes+in+tissue+engineering+and+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).</li>
<li>Allen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grading+lipoaspirate%3A+is+there+an+optimal+density+for+fat+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).</li>
<li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Centrifuged+Lipoaspirate+Fractions+Suitable+for+Postgrafting+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

טיפול משובי מבוססי תאי גזע הראה תועלת פוטנציאלית רבה במחלות שונות. השיקופיים הם מועמדים בולטים טיפולית כי הם קלים להשיג ואת יש יכולת התחדשות רקמות הרומן15ותיקון של רקמות. עם זאת, קיימות מגבלות להרחיב את היישום הקליני שלה, מכיוון שהיא דורשת פרוצדורות מסובכות לבודד תאים, collagenase לעיבוד6. לכן חיוני לפתח טכניקה פשוטה לקבל בתאי גזע ללא שימוש collagenase.
במחקר זה, הצגנו תהליך מכאנית בלבד של רקמת שומן להשיג SVF תאים, אשר מוגנים על-ידי ECM אדיפוז מק...

תא גזע טיפולים מספקים שינוי פרדיגמה רקמות תיקון והתחדשות כך הם עשויים להציע של משטר טיפולי חלופיים עבור מחלות שונות1. תאי גזע (למשל, גזע pluripotent המושרה, תאי גזע עובריים) הפוטנציאל הטיפולי נהדר אבל הם מוגבל בשל תא ושיקולים אתיים. שומן-derived mesenchymal סטרומה/תאי גזע (השיקופיים) הם קל להשיג lipoaspirates, שאינם כפופים למגבלות זהות; לכן, זה הפך מסוג תאים אידיאלי עבור רפואה רגנרטיבית מעשי2. בנוסף, הם הינם nonimmunogenic וכוללים שפע המשאבים השומן autologous3.
כיום, השיקופיים מתקבלים בעיקר על ידי בתיווך collagenase עיכול של רקמת שומן. השבר בכלי הדם סטרומה (SVF) של רקמת שומן מכיל השיקופיים, תאים ובתאים אנדותל, pericytes של תאים חיסוניים. למרות קבלת צפיפות גבוהה של SVF/השיקופיים enzymatically הראו שיש השפעות מועילות, החקיקה במספר מדינות מסדיר בקפדנות את היישום הקליני של מוצרים מבוססי תאים באמצעות collagenase4. לעכל את רקמת שומן עם collagenase למשך 30 דקות כדי 1 h כדי להשיג SVF התאים, מגביר את הסיכון של שני חומרים אקסוגניים הכנה, המתפללים. התרבות חסיד הטיהור של השיקופיים, אשר לוקח ימים עד שבועות, דורשים ציוד מעבדה ספציפי. יתר על כן, רוב המחקרים, SVF תאים, השיקופיים משמשים ההשעיה. בלי ההגנה של מטריצה חוץ-תאית (ECM) או נושא אחר, תאים פנויים פגיעים, לגרום השמירה תא המסכן לאחר ההזרקה, לסכן את התוצאה הטיפולית5. מכל הסיבות הללו להגביל יישום נוסף של טיפול בתאי גזע.
להשיג השיקופיים של רקמת שומן ללא עיכול בתיווך collagenase, מספר הליכים עיבוד מכניים, כולל צנטריפוגה, מכני קוצץ, גיזום, pureeing, הא, היה מפותח6,7 , 8 , 9. שיטות אלה נחשבים לדחוס רקמת ו השיקופיים ע י מכנית שיבוש adipocytes בוגרת ושלפוחיות שלהם המכילים שמן. יתר על כן, ההכנות הללו, המכיל ריכוז גבוה של השיקופיים, הראה פוטנציאל טיפולי רב כמו רפואה רגנרטיבית של בעל חיים מודלים8,9,10.
בשנת 2013, Tonnard. et al. הציג את nanofat הרכבה טכניקה, אשר כרוך בהפקת emulsified lipoaspirates על ידי intersyringe עיבוד11. הטיית הכוח שנוצר על-ידי intersyringe הסטה יכול לשבור באופן סלקטיבי adipocytes בוגרת. בהתבסס על הממצאים שלהם, פיתחנו שיטת עיבוד מכניים גרידא מסירה את רוב השומנים נוזל, lipoaspirates משאיר רק SVF תאים, ECM fractionated, אשר הוא ECM/SVF-ג'ל12. במסמך זה, אנו מתארים את הפרטים של תהליך מכני של האדם, נגזר רקמת שומן כדי לייצר את ה-ECM/SVF-הג'ל.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 איזולקטין מצומד GS-IB4</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>שרקנים נגד עכבר פריליפין</td><td>Progen</td><td>GP29</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>קצה רחב פיפט</td><td>Celltreat</td><td>229211B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>לייקה&nbsp;</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td>עירום נחמד&nbsp;</td><td>האוניברסיטה הדרומית של מדיקל</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור&nbsp;</td><td>אולימפוס</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>צינור 50 מ"ל</td><td>קורניג</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>שקית סטרילית</td><td>Laishi</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>microtome</td><td>Leica&nbsp;</td>צנטריפוגה <td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Heraus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

micronization מכני של lipoaspirates לטיפול רגנרטיבית

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

השבר בכלי הדם סטרומה (SVF) הפך להיות כלי משובי עבור מחלות שונות; עם זאת, החקיקה מסדיר בקפדנות היישום הקליני של התא מוצרים באמצעות collagenase. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור תערובת להזרקה של תאים SVF מטריצה חוץ-תאית מקורי מתוך רקמת שומן על ידי תהליך מכאנית בלבד. Lipoaspirates הם הכניסו לתוך צנטריפוגה, ויצא ב x 1,200 g למשך 3 דקות. השכבה האמצעית שנאספו, הפרדתו בשתי שכבות (צפיפות גבוהה שומן בחלק התחתון) ושומן בצפיפות נמוכה בחלק העליון. השכבה העליונה היא ישירות emulsified על ידי העברת intersyringe, בקצב של 20 מ"ל/s עבור x 6 8 x. השומן emulsified הוא centrifuged ב x 2,000 g למשך 3 דקות, ואת החומר דביק מתחת לשכבת הנפט ונשתמש כהגדרתו של מטריצה חוץ-תאית (ECM) / SVF-ג'ל. השמן על השכבה העליונה נאסף. כ- 5 מ ל שמן להוסיף 15 מ"ל של שומן בצפיפות גבוהה, emulsified על ידי העברת intersyringe, בקצב של 20 מ"ל/s עבור x 6 8 x. השומן emulsified הוא centrifuged ב x 2,000 g למשך 3 דקות, והוא החומר הדביק גם ECM/SVF-ג'ל. לאחר ההשתלה של ECM/SVF-הג'ל לתוך עכברים עירום, השתל שנקטפו, מוערך על ידי בדיקה היסטולוגית. התוצאה מראה כי המוצר הזה יש פוטנציאל להתחדש לתוך רקמת שומן רגילה. ההליך זה הליך פשוט, יעיל דיסוציאציה מכני לתמצת את התאים SVF נעוץ ECM תומכת הטבעי שלהם למטרות משובי.

לאחר העיבוד השומן קולמן ECM/SVF-ג'ל, הנפח של שמן שהושלכו תופס 80% של הכרך האחרון, רק 20% מכלל רקמת שומן נשמר מתחת לשכבת הנפט נחשב SVF/ECM-ג'ל (איור 1א'). ECM/SVF-ג'ל בעל מרקם נוזלי דמוי חלקה מאפשר לו לעבור דרך מחט בסדר 27 G; אולם, קולמן שומן מורכב מבנה אדיפוז נפרד עם סיבים גדולים, יכול רק לעבור על בצינורית 18 גרם (איור 1B).
ביום השלישי ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג סטרומה השבר בכלי הדם של רקמת שומן באמצעות סדרה של תהליכים מכניים, הכוללים תחליב centrifugations מרובים.

Micronization מכני של Lipoaspirates לטיפול רגנרטיבית

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

קבלת שברי כלי דם סטרומה, או SVFs, מ lipoaspirates דורש עיכול עם קולגן, אשר מגביר את הסיכון לזיהום ביולוגי. יש לפתח דרך טובה יותר להשיג SVF ללא קולגן. טכניקות אלה מאפשרות לנו להשיג את ה- SVF במטריצה החוץ-תאית המקורית שלו באמצעות תהליך מכני פשוט.הדגמת ההליך תהיה שיהאנג צ'ן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. לאחר קבלת דגימות השומן, להעביר את lipoaspirates לתוך צינור אחד 50 מיליליטר, ולאפשר את השומן שנקטף כדי לצייד במשך 10 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה קצה רחב כדי למשוך את השומן מהשכבה העליונה של הצינור לתוך צינור חדש 50 מיליליטר ולסובב את השומן על ידי צנטריפוגה.השכבה העליונה בצינור היא שבר השומן של קולמן. להעביר את 2/3 העליון של שומן קולמן לתוך צינור חדש 15 מיליליטר. חלק זה נחשב שומן בצפיפות נמוכה.מעבירים את השלישי התחתון של שומן קולמן לצינור שני של 15 מיליליטר. חלק זה נחשב שומן בצפיפות גבוהה. כדי לייצר ג'ל שבר כלי דם סטרומה מטריצה חוץ תאית מהשומן בצפיפות נמוכה, השתמש בשני מזרקים 20 מיליליטר המחוברים על ידי נקבה למחבר מנעול לורה נקבה כדי intershift 10 מיליליטר של שומן בצפיפות נמוכה.זהו צעד המפתח להשמדת אדיפוזיטים. המהירות והזמן בו מתבצעת הסטת האינטרסירינג תורמים לאיכות המוצר הסופי. לאחר הפגישה האחרונה intershift, לאסוף את השומן על ידי צנטריפוגה ולהעביר את שכבת השמן העליון לצינור 15 מיליליטר.ואז להעביר את מטריצה דביקה באמצע סטרומל שבר כלי דם שכבת ג'ל לתוך צינור חרוט חדש 15 מיליליטר. כדי לייצר ג'ל שבר כלי דם סטרומה מטריצה חוץ תאית מן השומן בצפיפות גבוהה, להוסיף שני מיליליטר של שבר שמן בצפיפות נמוכה לחמישה מיליליטר של מדגם שומן בצפיפות גבוהה. לסבך את השומן המעורב כפי שהוכח עד flocculate נצפתה בתוך אמולסיה.לאסוף את flocculate על ידי צנטריפוגה להשליך את שכבת השמן העליון. לאחר מכן לאסוף את השכבה האמצעית דביק לערבב את השבר הזה עם צפיפות נמוכה מטריצה חוץ תאית סטרומה שבר כלי דם ג'ל מדגם. לאחר עיבוד שומן קולמן כדי מטריצה חוץ תאית ג'ל שבר כלי דם סטרומל, נפח השמן מושלך תופס 80% של הנפח הסופי, ורק 20% של רקמת השומן השתמר מתחת לשכבת השמן נחשב מטריצה חוץ תאית מטריצה סטרומה שבר כלי דם ג'ל.ג'ל שבר כלי דם סטרומה מטריצה חוץ תאית יש מרקם חלק דמוי נוזל המאפשר לו לעבור דרך מחט בסדר 27 מד. עם זאת, שומן קולמן מורכב מבנה שומן אינטגרלי עם סיבים גדולים שיכולים רק לעבור 18 מד cannula. ביום השלישי לאחר ההשתלה, מספר גדול של טרום adipocytes בגודל קטן עם טיפות שומנים תאיים מרובים, רקמת חיבור נרחבת היטב vascularized, ותאים דלקתיים הסתננו מופיעים.החל מהיום ה-15, מספר התאים הדלקתיים מתחיל לרדת בהדרגה, והאדיפוזיטים מתחילים להתבגר. ביום 90, רוב רקמת החיבור של כלי הדם בשתלים הוחלפה באדיפוזיטים בוגרים. מטריצה חוץ-תאית שתלי ג'ל שבר כלי דם מכילים גם כמה adipocytes חיובי perilipin שלושה ימים לאחר ההשתלה, עם טרום adipocytes בגודל קטן, עם טיפות שומנים תאיים מרובים מתחילים להופיע ביום 15.בכל שדה של היום 90 מטריצה חוץ תאית סטרומה שבר כלי דם חלקי ג'ל קטעים להציג adipocytes חיובי perilipin רבים וכלי דם שנוצרו לאחרונה. ניתן לבצע ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את אוכלוסיית התאים במוצר. וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים יכולה להתבצע כדי לדמיין את המיקרו-מבנה של המוצר.טכניקה זו מספקת שיטה פשוטה עבור מנתחים וחוקרים כדי להשיג מוצר עם ריכוז גבוה של תאים SVF עם סיבי מטריצה חוץ תאית מקורית מרקמה שומן.

mechanical-micronization-of-lipoaspirates-for-regenerative-therapy

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של שומן הנגזר מתאי סטרומה lipoaspirate ויצירת 4 calvarial פגם קריטי בגודל מ"מ להעריך התחדשות שלד.

תיקון של דגם פגם Calvarial הקריטי בגודל תאי שומן באמצעות נגזרת סטרומה נקטפו מן Lipoaspirate

ב2001, חוקרים באוניברסיטת UCLA תאר את בידודה של אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים, המכונה תאי גזע שמקורם בשומן או ASCs, מרקמת שומן. מאמר זה מתאר את הבידוד של ASCs מlipoaspirates באמצעות פרוטוקול עיכול ידני, האנזימטית באמצעות collagenase.

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

בלוטות הלימפה הן הרקמות החיסוניות המתזמרות את התגובה החיסונית והן יעד קריטי לחיסונים. Biomaterials הועסקו כדי למקד טוב יותר בלוטות הלימפה כדי לשלוט על משלוח של אנטיגנים או אדג'ובנטים. מאמר זה מתאר טכניקה המשלבת רעיונות אלה כדי להזריק חלקיקי פולימר תואמים ביולוגית לתוך בלוטות הלימפה.

הזרקת בלוטות תוך-לימפתיות של חלקיקי פולימר מתכלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר של רקמת שומן-derived סטרומה וסקולרית שבר ויישומו לשיפור הברך פונקציות על-ידי התחדשות רקמות הסחוס כמו בני אדם חולים עם דלקת מפרקים ניוונית.

פרוטוקול קליני של ייצור רקמת שומן-Derived השבר בכלי הדם סטרומה עבור פוטנציאל התחדשות הסחוס

גילוי מדויק של שיטות ופרוטוקולים הוא חיוני לקליטה בקנה מידה גדול של טיפולים בתאי גזע. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד תאים רגנרטיביים שמקורם בשומן, המשמשים להזרקה תוך-תאית אחת כטיפול בבעיות זיקפה (ED) בעקבות כריתת ערמונית רדיקלית (RP).

בידוד של תאים רגנרטיביים שמקורם בשומן לטיפול בבעיות זיקפה בעקבות כריתת ערמונית רדיקלית

. בעזרת מכשיר מערכת סגור שיטה חדשה זו מאפשרת בידור של אשכולות תת-מילימטר של רקמת האדיפוז המתאימים להשתלה vivo, בתרבות החוץ-גופית ובבידוד תאים נוסף ואפיון.

מיקרו-הפיצול האנושי של רקמת אדיפוז לפנוטיפים של תאים ואפיון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה משופרת לבידוד ADSC וכתוצאה מכך תפוקה תאית אדירה עם רווח בזמן בהשוואה לספרות. מחקר זה מספק גם שיטה פשוטה להשגת מספר גדול יחסית של תאים בני קיימא לאחר שימור בהקפאה לטווח ארוך.

טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח

מקטע כלי דם סטרומה מבודד מכנית (SVF) בשילוב עם הידרוג'ל פיברין מציע נשאות קלה ויעילה לתאי סטרומה ברי קיימא שמקורם בשומן עבור אינדיקציות שונות, כולל הנדסת רקמות או מטרות ריפוי פצעים. כאן, אנו מציגים את ההכנה של מבנה מכני SVF (mSVF)-פיברין הידרוג'ל למחקר תרגומי ויישום קליני.

השילוב של מקטע כלי דם סטרומה מבודד מכנית והידרוג'ל פיברין: פרוטוקול עיבוד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיכול להפוך רקמת שומן אוטולוגית לחומרים מרכיבי שומן שונים בעלי תכונות ותפקודים פיזיקוכימיים שונים.

פיצול רקמת שומן חדשני להפיכת שומן לרכיבים מיוחדים

פרוטוקול זה מתאר ייצור טלאי מחטים מיקרו-מתמוססים הכוללים ננומיצלות α-לקאלבומין טעונות בקפסאיצין. השיטה מציעה גישה כפולה ומינימלית פולשנית להעברה ממוקדת טרנסדרמלית של חומרים ביואקטיביים הידרופוביים לרקמת השומן, מה שמקל על הפחתת שומן מקומית יעילה ועלול להרחיב יישומים בניהול השמנת יתר.

ייצור מדבקות מיקרו-מחט ממוססות טעונות בננומיצלות α-לקטאלבומין להעברת קפסאיצין טרנסדרמל והפחתת רקמת שומן

למדו שיטה מכנית לבידוד SVF מרקמת שומן ללא קולגנאז, תוך שימור המטריצה החוץ-תאית. הפרוטוקול מציע חלופה בטוחה לחלץ תאי גזע לרפואה רגנרטיבית ולהנדסת רקמות.

Micronization מכני של Lipoaspirates לטיפול רגנרטיבית

גלה סרטונים נוספים