Name: הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: חקור את פתוגנזת זיהום Aeromonas ב Caenorhabditis elegans. שיטות אלו מאפשרות הערכת רעילות בין ובתוך מיני Aeromonas ותורמות להבנת אינטראקציות מארח-פתוגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אסירי תודה על הסיוע המתקן הליבה C. elegans בטייוואן, מיקרוביולוגיה אבחון ומבודד Antimicrobial ההתנגדות מעבדה של הלאומית צ'נג קונג החולים האוניברסיטאי למתן את Aeromonas . אנו להכיר גם מרכז הגנטיקה Caenorhabditis (CGC), את WormBase. אנו מודים גם Savana מור לעריכת כתב היד.
מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענקים של משרד המדע, הטכנולוגיה של טייוואן (105-2628-B-006-017-MY3 ביותר) ומבית החולים האוניברסיטאי קונג צ'אנג (NCKUH-10705001) הלאומי חן פ. ל.

1. הכנת המדיום תרבות
הערה: ראה טבלה 1 להכנה פתרון.
<ol><li>כדי להכין M9 בינוני12, להמיס 1.5 גר'2פו ח'4, g 5.66 של Na-2-HPO-4ו- 2.5 גר' NaCl ב 500 מ"ל מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ של 1 מ' MgSO4 לפני השימוש הראשון.</li>
	<li>כדי להכין נמטודות צמיחה בינוני (NGM)12, להמיס 3g NaCl, peptone חיידקי 2.5 g, ו- 20 גרם אגר ב- 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ"ל של 5% כולסטרול אתנול, 25 מ של מאגר פוספט. מערבולת לערבב היטב.</li>
	<li>יוצקים על 5 מ"ל NGM לתוך כל 6 ס מ פטרי. הימנע לייצור בועות על פני השטח של צלחת. להשאיר צלחות בטמפרטורת החדר במשך לילה 1 וחבילת כדי לשמור על 4 מעלות צלזיוס. להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
	<li>כדי להכין מועשר NGM ואקלים, להמיס 3g NaCl, 5 g peptone חיידקי, תמצית שמרים 1 g, ו- 30 גרם אגר ב- 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דק עד מקורר עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים, ולהוסיף 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ"ל של 5% כולסטרול אתנול, 25 מ של מאגר פוספט. מערבולת לערבב היטב.</li>
	<li>יוצקים על 10 מ"ל ENGM לתוך כל 9 ס מ פטרי. הימנע לייצור בועות על פני השטח של צלחת. להשאיר צלחות בטמפרטורת החדר במשך לילה 1 וחבילת כדי לשמור על 4 מעלות צלזיוס. מביאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
	<li>כדי להכין S בינוני12, מערבבים 40 מ ל S הבזליים, 0.4 מ ל 1 מ' פוטסיום ציטראט, מעקב מ ל 0.4 מתכות פתרון, 0.12 מ של 1 מ' CaCl2, 0.12 מ של 1 מ' MgSO4, 40 µL של 5% כולסטרול אתנול, 1 מ"ל של 8 מ"מ FudR לפני השימוש.</li>
</ol>2. סינכרון של C. elegans6,9,12
<ol><li>רחץ תולעים כ-2,000 בשלב םיפתתשמ gravid עם 10 מ ל מים יונים סטרילי בשפופרת 15 מ"ל. לשטוף החוצה את החיידקים 3 x, לשמור את התולעים בתחתית הצינורית.</li>
	<li>Centrifuge לדוגמה עבור 1 דקות ב x 500 g כדי להוריד את התולעים. הסר את תגובת שיקוע, ולשמור את התולעים יונים 3.5 מ"ל מים.</li>
	<li>להוסיף 1 mL NaOCl (10-15%) ו- 0.5 מ ל 5 מ' KOH לתוך הצינור. תערובת אחיד ע י ניעור עבור < 6 דקות כדי lyse הגופים תולעת.</li>
	<li>אחרי הביצים משתחררים מן התולעים, מוסיפים יונים 10 מ"ל מים כדי לעצור את פירוק. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב x 1,200 g כדי לנתץ את הביצים ולהסיר את תגובת שיקוע ככל האפשר. לשטוף עם x לפחות 3 בינוני 15 מ"ל M9. הערה: ראה צעד 1.1 ההרכב של M9 בינוני.</li>
	<li>שמור ביצים 1 מ"ל M9 בינוני. תחבורה ביצים מאכל 3.5 ס"מ עבור הדגירה ב- 20 ° C ללילה אחד (כ ח 12-18). הערה: לאחר הדגירה, הביצים יבקעו לתעל זחל אשר נקרא בשם בשלב הראשון פגית (L1).</li>
	<li>פיפטה החוצה µL 10 התולעים L1 M9 בינוני. לספור את התולעת ולחשב שהריכוז של L1 תולעים M9 בינוני.</li>
	<li>זרע לכל היותר 10,000 מודגרות L1 הבמה תולעים עם pipet על צלחת ENGM 9 ס מ, מורחים עם Escherichia coli OP50.<ol>
<li>בשלב זה, התפשטות 0.5 mL תרבותי בין לילה e. coli OP50 עם מרק לוריא-Bertani (LB) על הצלחת ENGM 9 ס מ. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h הערה: כדי למנוע זיהום, הצעד מתפשטת צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.</li>
		<li>להתקרר לטמפרטורת החדר לפני זריעה L1 תולעים. זרע לכל היותר 10,000 מודגרות L1 תולעים הבמה בצלחת ENGM עם OP50 e. coli .</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה התולעים ב- 20 ° C 44 h או עד שהם גדלים לבמהth פגית (L4) 4. הערה: ראה שלב 1.3 להרכב ENGM בינוני. תולעת יש נקודה לבנה בצורת חצי ירח-אמצע הגוף בצד בשלב L4.</li>
	<li>השתמש L4 מסונכרן על הבמה תולעים את מבחני הבאים. השתמש בסוג הפרוע ש-n2 תולעים וזמינותו להישרדות C. elegans עם Aeromonas dhakensis ואת וזמינותו רעילות נוזלי C. elegans עם Aeromonas dhakensis. השתמש תולעים RW1596 (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) ב- C. elegans נמק שריר וזמינותו עם Aeromonas dhakensis.</li>
</ol>3. C. elegans וזמינותו להישרדות עם6, Aeromonas9
<ol><li>ביום של זריעה L1 תולעים על ENGM התפשטות עם OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas או e. coli OP50 והתרבות עם 2 מ ל ציר LB בהתאמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. הערה: כדי למנוע זיהום, שלב זה צריך להתבצע בתוך תא למינארי. כאן, שימשו את זני חיידקים הבאים: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג.</li>
	<li>למדוד את ספיגת600 OD מרק חיידקי ולהתאים שהמרק בקטריאלי כדי OD600 = 2.0 עם מרק ליברות.</li>
	<li>לזהות ולהפיץ 30 µL מרק חיידקי שהלוח NGM 6 ס מ. תרבות הלוחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה. הערה: ראה שלב 1.2 עבור הרכב NGM בינוני.</li>
	<li>ביום שהתולעים L1 לגדול על הבמה L4, באופן אקראי לאסוף ולהעביר תולעים 50 ל צלחת NGM עם אחד של ארבעה זנים Aeromonas או OP50 e. coli .</li>
	<li>דגירה הלוחות NGM ב- 20 ° C עד לסיום וזמינותו.</li>
	<li>העברת כל התולעים חי צלחת NGM החדש מוכן עם חיידקים, לספור המספרים של לחיות, מת, חיישן תולעים כל יום עד התולעת האחרון מת. הערה: להעביר תולעים צלחת NGM מוכן טרי כל יום לשם קיום זיהום, גם אם באמצעות תולעים סטרילי (לדוגמהglp-4, או עם FudR).</li>
	<li>להתוות את עקומות הישרדות מבוסס על חישוב נתונים יומי.</li>
</ol>4. C. elegans Assay רעילות נוזלי עם Aeromonas7
הערה: כדי למנוע זיהום, צעדים צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
<ol><li>יום לאחר זריעה התולעים L1 על הצלחת ENGM פזורים OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas ו- e. coli OP50, והתרבות 5 מ ל ציר ליברות כל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. הערה: בפרוטוקול, זני חיידקים הבאים שימשו: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג.</li>
	<li>למדוד את ספיגת600 OD ציר חיידקים.</li>
	<li>Centrifuge שהמרק בקטריאלי ב x 3,500 g למשך 15 דקות להסיר שהמרק ליברות. Resuspend החיידק ולהתאים שהמרק בקטריאלי כדי OD600 = 3.0 S בינונית. להוסיף µL 195 מרק חיידקי S בינוני לפחות 8 בארות של צלחת 96-ובכן. הערה: ראה שלב 1.6 על ההרכב של S בינוני.</li>
	<li>לשטוף את התולעים L4 בצלחת ENGM עם e. coli OP5 באמצעות M9 בינוני. להתאים את הפתרון תולעת ריכוז של תולעים 5 לכל µL ולהוסיף 5 µL של הפתרון תולעת מכל קידוח של צלחת 96-ובכן. ודא כי ישנם כ 25 תולעים לכל טוב.</li>
	<li>דגירה על הלוחית 96-ובכן מטרף-200 סל ד ב 25 º C.</li>
	<li>לספור את מספר בשידור חי תולעים, תולעים מתים לאחר 24, 48, 72 ח' חשב שיעורי ההישרדות של כל טוב עם הנוסחה הבאה: (תולעים תולעים בשידור חי/סה כ) × 100%.</li>
	<li>צייר גרף פיזור מגרש עם החישוב נתונים יומי.</li>
</ol>5. C. elegans שריר נמק Assay עם Aeromonas6
הערה: כדי למנוע זיהום, שלבים אלה צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
<ol><li>ביום שהתולעים L1 הם נזרע על ENGM להתפשט עם OP50 e. coli , לבחור מושבה בודדת של כל אחד של ארבעה זנים Aeromonas ו- e. coli OP50 והתרבות עם 2 מ ל LB מרק כל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. הערה: כאן, שימשו את זני חיידקים הבאים: e. coli OP50, המקור אוכל רגיל של C. elegans. Dhakensis א AAK1, לבודד הראשון וסודרו באופן מלא פתוגניים קלינית dhakensis א . א hydrophila A2-066 veronii א A2-007, caviae א A2-9307121 הם מבודד representatively קלינית של בית חולים האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג.</li>
	<li>למדוד את ספיגת600 OD ציר חיידקים ולהתאים שהמרק חיידקים כדי OD600 = 2.0 עם מרק ליברות. לזהות ולהפיץ 30 µL מרק חיידקי על צלחות NGM 6 ס מ. תרבות הלוחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.</li>
	<li>ביום לגדל התולעים L1 לבמה L4, תולעים 50 העברת כל צלחת NGM עם אחד של ארבעה זנים Aeromonas או OP50 e. coli . דגירה הלוחות NGM ב 20 º C. להעביר תולעים כל 24 שעות החדש מוכן NGM צלחות עם חיידקים.</li>
	<li>קח תמונות שריר באמצעות מיקרוסקופ זריחה.<ol>
<li>נבחר באקראי 10 תולעים על 2% agarose ג'ל מדיום M9 בשקופית. לשתק את התולעים באמצעות 2 µL של אזיד הנתרן 1% במדיום M9 על agarose עבור פחות מ 5 דקות לפני לקיחת תמונות.</li>
		<li>המקום מכסה, ללכוד את התמונות שריר באמצעות ירוקה חלבון פלואורסצנטי (GFP) לסנן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם תשלום מצמידים מכשיר המצלמה. ללכוד את התמונות שריר בגיל 24, 48, 72 h פוסט על הבמה L4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התנהגות הכנה לניתוח ודמות תמונה עם תמונה בתוכנת עיבוד. הערה: ציוני לבין רמות נזק השריר המיובאים והקיימים מוצגות באיור 3, שעבורם הקריטריון מפורטים כדלקמן: 3 נקודות על סיבי השריר חסר; 2 נקודות עבור סיבי שריר קרוע או שבורים; 1 נקודה עבור סיבי השריר מכופף; 0 נקודות עבור סיבי שריר בריא.</li>
</ol>6. ניתוחים סטטיסטיים
<ol><li>לבצע ניסויים כל מינימום של שלוש פעמים באופן עצמאי.</li>
	<li>השתמש בשיטת קפלן-מאייר כדי להעריך את מבחני הישרדות של C. elegans , והשתמש לבדוק את יומן-דרגה ניתוח הישרדות הבדלים. להגדיר מובהקות סטטיסטית 0.05.</li>
	<li>השתמש בשם מבחן t של סטודנט כדי לנתח את התוצאות הסטטיסטיות של מבחני רעילות נוזלי C. elegans עבור שתי הקבוצות השונות. השתמש במבחן חד-כיווני אנובה בניתוח הבדלים בין שלושה ערכים או יותר אחד המשתנה הבלתי תלוי. להגדיר מובהקות סטטיסטית 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>Parker, J. L., Shaw, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas+spp.+clinical+microbiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aeromonas spp. clinical microbiology and disease.</a> Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft-tissue+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tract+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biliary tract infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).</li>
<li>Chuang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+clinical+characteristics+among+Aeromonas+hydrophila%2C+Aeromonas+veronii+biovar+sobria+and+Aeromonas+caviae+monomicrobial+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia.</a> Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft+tissue+infection+caused+by+Aeromonas+species+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Disease+Model+of+Muscle+necrosis+caused+by+Aeromonas+dhakensis+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 2058(2016).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+diversity+among+bacteremic+Aeromonas+isolates%3A+ex+vivo%2C+animal%2C+and+clinical+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences.</a> PLoS One. 9 (11), 111213(2014).</li>
<li>Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+infection+models+in+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29+to+study+the+pathogenesis+of+Aeromonas+hydrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1219(2016).</li>
<li>Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIOK-1+Is+a+Suppressor+of+the+p38+MAPK+Innate+Immune+Pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Immunology. 9, 774(2018).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Caenorhabditis+elegans+infection+by+bacterial+and+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens.</a> Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Engelmann, I., Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in C. elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).</li>
<li>Feinbaum, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Pseudomonas+aeruginosa+virulence-related+genes+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813(2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

C. elegans הוא תולעים נימיות bacterivorous זה טבעי intakes חיידקים כמזון, פיתחה חיסון מולדת מסובך חיידקים במהלך התהליך האבולוציוני שלו. שני האיברים החיוניים לתחזוקה ותמיכה החסינות הן האפידרמיס והמעי9,13. האפידרמיס ואת להקות של שריר של C. elegans דומים המבנים ברקמות הרכות יונקים ו בני6. בשל מאפיינים אלו, C. elegans ישימה כאורגניזם מודל לימוד בפתוגנזה של זיהום Aeromonas .
כאן, א...

פתוגניות, Aeromonas, הוכח קלינית לגרום דלקת הקבה והמעים, הפצע, ספטיסמיה דלקות בדרכי השתן בזיהומים1,2. ביותר הקשורים מחלות האדם דווחו להיות מזוהה עם ארבעת המינים חיידקי: 2, Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Aeromonas caviae 3 , 4 , 5. בין מחלות זיהומיות Aeromonas , דלקות ברקמות הרכות עלולה לגרום לזיהום חמור בבני אדם. ראוי לציין, נמק שריר היא הצורה החמורה ביותר של זיהום רקמות רכות6. תצפית של הישרדות, נמק שריר של Caenorhabditis elegans לאחר ההדבקה היא שיטה נוחה שלפיו לשער הרעילות של Aeromonas.
מדענים פיתחו כבר אורגניזמים רבים דגם ללמוד זיהומים חיידקיים. במחקרים קודמים, עכברים zebrafishes, נמטודות שימשו כמודלים חיים ללמוד הפתוגנזה של התקפה אלימה של7,6, Aeromonas8. כל המודל החייתי יש שלה "יתרונות ויישומים. האורגניזם מודל, Caenorhabditis elegans, היא תולעים נימיות bacterivorous אילו חיידקים intakes כמו foodnaturally. C. elegansפיתחה מערכת חיסונית מולדת מסובך נגד זיהום חיידקי במהלך האבולוציה שלה. תחת הלחץ של זיהום חיידקי, C. elegans הוכח להיות מודל זיהום מצוינת ללמוד חיידקי בפתוגנזה של Aeromonas6,7,9 , פתוגנים אחרים כמו פטריה10 ו- enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H711. עם זאת, יש עדיין אין פרסום המתמקד המתודולוגיה בשימוש C. elegans כמודל ללימוד של התקפה אלימה של Aeromonas.
. כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד Aeromonas זיהום באמצעות C. elegans כמו במודל חיה: מבחני הישרדות, רעילות נוזלי של נמק שריר. שיטות אלה הן דרך נוחה להעריך הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas , לשפר את ההבנה של הפתוגנזה של Aeromonas.

<table><tbody><tr><td>חממת שייקר</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>דגירה של חיידקים</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td></td><td>תרבית MP021519455 הכנת מדיום&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-05</td><td>הכנת מדיום תרבית&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021914405</td><td>תרבית הכנת מדיום&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>31434</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SIGMA</td><td>M7506</td><td>תרבית תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>אגר</td><td>Difco</td><td>214530</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>SIGMA</td><td>C8503</td><td>תרבית תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>SIGMA</td><td>32205</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>SIGMA</td><td>P5958</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 6 ס"מ</td><td>ALPHA PLUS</td><td>46</td><td>הכנת צלחת אגר</td></tr><tr><td>96 בארות</td><td>FALCON</td><td>353072</td><td>בדיקה נוזלית</td></tr><tr><td>פפטון חיידקי</td><td>Affymetrix/USB</td><td></td><td>AAJ20048P2 תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>SIGMA</td><td>92144</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצת לימון ושור; H2O</td><td>SIGMA</td><td>C1909</td><td>תרבית בינונית הכנה&nbsp;</td></tr><tr><td>תלת-אשלגן ציטראט ושור; H2O</td><td>SIGMA</td><td>תרבית 104956</td><td>הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>FudR&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>1271008</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>דיסודיום EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E1644</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>215422</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>MnCl2&bull; 4 H2O</td><td>SIGMA</td><td>תרבית 221279</td><td>הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>תרבית 204986</td><td>הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5 H2O</td><td>SIGMA</td><td>C8027</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>SIGMA</td><td>16922</td><td>תרבית הכנה בינונית&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת מיקרוסקופ</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>ליקוי Ti הפוך&nbsp;</td><td>הדמיית מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מצלמת CCD מדעית</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>Retiga-2000R מהיר 1394&nbsp;</td><td>הדמיית מיקרוסקופ</td></tr></tbody></table>

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום aeromonas במודל caenorhabditis elegans

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

פתוגניות Aeromonas הוכח קלינית לגרום דלקת הקבה והמעים, הפצע, ספטיסמיה דלקות בדרכי השתן. רוב המחלות האנושיות דווחו להיות מזוהה עם ארבעה מינים של חיידקים: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Aeromonas caviae. האורגניזם דגם Caenorhabditis elegans הוא bacterivore זה מספק מודל הידבקות מעולה שבו ללמוד חיידקי בפתוגנזה של Aeromonas. כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד זיהום Aeromonas באמצעות מודל של C. elegans , כולל הישרדות, רעילות נוזלי של מבחני נמק שריר. התוצאות של שלוש שיטות לקביעת של התקפה אלימה של Aeromonas היו עקביים. Dhakensis א הוצגה רעיל ביותר בין הגדולות Aeromonas מינים גרימת זיהומים קליניים. שיטות אלה מוצגים להיות דרך נוחה כדי להעריך את הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas ולתרום להבנת בפתוגנזה של זיהום Aeromonas .

לפי הפרוטוקולים שתוארו לעיל, קל להבחין בין רעילות של זנים Aeromonas 4. וזמינותו להישרדות של C. elegans מוצג באיור1. שיעורי ההישרדות של C. elegans נגוע Aeromonas מינים, שמוצג צו מגבוה לנמוך היו: א caviae, veronii א, א hydrophila, ו dhakensis א. למרות שיש גיוון מבחינת רעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas , שיעורי ההישרדות של C. elegans, הראה בממוצע, התמותה הגבוהה ביותר בין התולעים נגוע d...

כאן, אנחנו מציגים 3 ניסויים שונים כדי ללמוד זיהום Aeromonas C. elegans. באמצעות שיטות אלה נוח, קל להעריך את הרעילות בין מיני ותוך מיני Aeromonas .

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה המארח-פתוגן כגון פתוגניות וארסיות של זיהום חיידקי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להעריך את הרעילות בין ובתוך מינים אירומונים ולתרום להבנתנו את הפתוגנזה של זיהום אירומונים. כדי להתחיל לשטוף כ 2,000 תולעים בוגרות gravid עם מים סטריליים deionized.חזור על לשטוף שלוש פעמים שמירה על התולעים בתחתית הצינור. לאחר צנטריפוגה התולעים להסיר את supernatant ולשמור את התולעים 3.5 מיליליטר של מים deionized. הוסף מיליליטר אחד של hypochlorite נתרן ו 0.5 מיליליטר של אשלגן הידרוקסידי לצינור.ואז לנער את הצינור במשך שש דקות כדי lyse גופות התולעת. לאחר הביצים משתחררות, מוסיפים 10 מיליליטר של מים deionized כדי לעצור את התסיסה. ואז צנטריפוגה הצינור כדי למשוך את הביצים ולהסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר.לשטוף את הביצים עם 15 מיליליטר של M9 בינוני לפחות שלוש פעמים. מעבירים את הביצים לתבשיל באורך 3.5 ס"מ, ומטגנים אותן ב-20 מעלות צלזיוס ללילה אחד. לאחר מכן להסיר 10 microliters של תולעים L1 ו M9 בינוני מהצלחת.לספור את התולעים ולקבל את הריכוז של תולעי L1 במדיום M9. באמצעות פיפטה לקחת 0.5 מיליליטר של מרק E.coli OP50 LB ולהפיץ אותו על צלחת ENGM. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 18 שעות.מצננים את ה-ENGM לטמפרטורת החדר. ואז זרעים דגירה תולעי L1 על צלחת ENGM עם E.coli OP50. דגירה התולעים ב 20 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב L4.ראשית, בחר מושבה אחת של כל אחד מארבעת הזנים אירומונס ותרבות אותם על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן למדוד את ספיגת OD 600 של מרק חיידקי ולהתאים אותו עד הספיגה שווה 2.0. הנקודה הבאה ולהפיץ 30 microliters של מרק חיידקים מכל זן לתוך צלחות NGM.בחר והעבר באופן אקראי את תולעי L4 שהוכנו בעבר לצלחות NGM עם זני אירומונים. ואז לה הדגירה את הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס עד ההתזה הושלמה. כל יום להעביר את כל התולעים החיים לצלחת NGM חדשה עם חיידקים.לספור את המספרים של תולעים חיות, מתות וחיישנים בכל יום עד שהתולעת האחרונה מתה. לאחר culturing זני אירומונים ומדידת ספיגתם כפי שתואר קודם לכן, צנטריפוגה מרק חיידקי ב 3, 500 גרם של במשך 15 דקות. התאימו את מרק החיידקים עם S Medium.ומוסיפים 195 מיקרוליטרים של מרק חיידקים במדיום S לשמונה בארות של צלחת 96 בארות. לשטוף את התולעים את צלחת ENGM איתם M9 בינוני. ואז להתאים את הריכוז של פתרון התולעת לחמש תולעים לכל microliter.הוסף חמישה מיקרוליטרים של פתרון התולעת לכל אחת מה בארות של צלחת 96 בארות. דגירה הצלחת על שייקר, ולספר את מספר התולעים חיות ב 24, 48 ו 72 שעות. לאחר culturing זני Aeromonas והתאמת הספיגה על פי נקודת פרוטוקול הטקסט ולהפיץ את המרק החיידקי על צלחות NGM.לאחר מכן, להעביר 50 תולעים L4 לכל צלחת NGM. כל 24 שעות מעבירים את התולעים לצלחות NGM טריות. בחר באופן אקראי 10 תולעים והעבר אותן לג'ל 2%agarose במדיום M9 בשקופית.לבסוף למקם כיסוי על הג'ל וללכוד תמונות שרירים עם מסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה. בפרוטוקול זה הוערכו הרעילות של ארבעה זני אירומונים. שיעור ההישרדות של C.elegans נגועים במין אירומונים היה הגבוה ביותר ב- assays באמצעות A.caviae, והנמוך ביותר ב- assays באמצעות A.dhakensis.בהישרדות רעילות נוזלית של C.elegans ירד באופן משמעותי כאשר נגוע A.dhakensis או A.hydrophilia. בשריר נמק דרגות של נזק לשרירים השתנו בין המינים Aeromonas. A.caviae גרם לנזק השרירי לפחות, בעוד A.dhakensis הפיק את הנזק השרירי ביותר.השיטות המתוארות בסרטון זה מציעות דרך נוחה להבדיל בין מגוון ארסיות בין המינים אירומונים ובתוךם. בנוסף, זהו גם מודל אמין שבו ללמוד את האינטראקציה בין פתוגן ומארח.

evaluating-virulence-pathogenesis-aeromonas-infection-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Anderson, Q. L., et al. C. elegans Pathosystem בעל תפוקה גבוהה, תכולה גבוהה, מבוסס נוזל. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים בדיקה מבוססת נוזל שבה זחלי C. elegans מהונדסים גנטית נחשפים לחיידקים פתוגניים במיקרו-צלחת. רעלנים חיידקיים המופרשים למדיום גורמים ללחץ ולמוות של המארח. צבע פלואורסצנטי מכתים תולעים מתות, ומאפשר כימות מבוסס הדמיה של התמותה כדי להעריך את הרגישות או העמידות הגנטית.

הערכת תמותה הנגרמת על ידי חיידקים פתוגניים בזחלי C. elegans

מקור: צ'ן, י. ואחרים. הערכת אלימות ופתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים בדיקת הישרדות באמצעות C. elegans למידול פתוגנזה של Aeromonas , שבה בליעת חיידק דרך הפה מובילה לזיהום במעי ולמוות, ומאפשרת הערכה כמותית של אלימות חיידקית במערכת מארחת חיה.

מידול פתוגנזה של Aeromonas ב-C. elegans באמצעות מבחן הישרדות

מקור: צ'ן, י. ואחרים. הערכת אלימות ופתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).הסרטון הזה מדגים את מבחן רעילות נוזלית של C. elegans עם Aeromonas, שיטה המשמשת להערכת אלימות חיידקית על ידי מדידת הישרדות תולעים בסביבה נוזלית מוגבלת חומרים מזינים. הבדיקה חושפת פתוגניות ייחודית לזן בהתבסס על היקף הנזק והתמותה שנגרמו על ידי רעלים ב-C. elegans.

הערכת אלימות חיידקית באמצעות בדיקת רעילות נוזלית של C. elegans

מקור: צ'ן, י. ואח', הערכת אלימות ופתוגנזה של זיהום אירומונאס במודל Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים בדיקת נמק שריר ב-C. elegans (Caenorhabditis elegans) באמצעות זני Aeromonas פתוגניים. על ידי הזנת תולעים מבטאות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על צלחות עם זרעי Aeromonas, הבדיקה מדמה זיהום חיידקי וחושפת נזק לרקמה באמצעות הדמיית פלואורסצנציה. אובדן הדרגתי של מבנה השריר ואות ה-GFP מצביע על תגובה נקרוטית שנגרמה על ידי Aeromonas.

בדיקת נמק שרירים ב-C. elegans שנגרמה על ידי זן פתוגני של Aeromonas

ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם...

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

חקור את פתוגנזת זיהום Aeromonas ב Caenorhabditis elegans. שיטות אלו מאפשרות הערכת רעילות בין ובתוך מיני Aeromonas ותורמות להבנת אינטראקציות מארח-פתוגן.

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים