Name: שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: חקור שיטות לניתוח יציאת פתוגנים מתאי מארח באמצעות מבחני זיהום בתרבית ובעכברים. טכניקות אלו מאפשרות הערכת יעילות היציאה ואפיון הפתוגנים לאחריה לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עכברים טופלו בצורה אנושית לפי כל ההנחיות המתאימות לטיפול ולא להשתמש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים ואת השימוש בהם אושרה במחקר זה כולו על ידי אוניברסיטת מיאמי. טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדת שימוש (פרוטוקול 16-053).
1. מכינים את התאים לדלקת
<ol><li>הפץ שורת התאים מקרופאג דמוי העכבר 264.7 גלם בתקשורת תרביות רקמה DMEM, בתוספת 10% עגל עוברית סרום (המכונה מעתה ואילך DMEM/FCS) באמצעות בקבוקון 125 מ ל וחממה של תרביות רקמה ומתוחזק על 37 °C/5% CO2.</li>
	<li>יום לפני הזיהום, להשתמש במגרדת התא כדי להסיר תאים מן הבקבוק הרחבה לאסוף צינור חרוטי בורג מכסה 15 מ"ל. צנטריפוגה תאים ב 800 x גרם במשך 10 דקות, decant תגובת שיקוע להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של DMEM/FCS (ללא אנטיביוטיקה) ולקבוע את כייל נוגדנים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.</li>
	<li>
להתאים כייל נוגדנים ל 2 x 106 תאים למ"ל ולהוסיף 0.10 מ"ל (2 x 105 תאים) בארות של תבשיל תרביות רקמה 48-. טוב. ודא כי התליה תא מכסה את כל פני השטח של הבאר.
	<ol>
<li>צלחת תאים בבארות נוספים עבור מקור מאוחר יותר של מדיה ממוזגים. גם מקום מ 0.10 ל DMEM/FCS משלוש בארות נוספות כדי לשמש 'אין תא פקד'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה בין לילה בחממה תרביות רקמה-37 °C/5% CO2. למחרת, מסירה החממה עד inoculum החיידק יהיה זמין ומוכן לשימוש.</li>
</ol>2. הכנת ליסטריה (Lm) זיהום
<ol><li>לחסן 2 מ של המוח ללב אינפוזיה (BHI) עם מושבה בודדת מתוך צלחת אגר טריות קווצות שער (< 2 ימים) של Lm דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס שריפה-סבבים 130/min.</li>
	<li>למחרת, להוסיף מ 0.10 ל תרבות של 2 מ ל לילה מראש חימם BHI ולהמשיך המקננת ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות עד הצפיפות האופטית (OD600) הוא בין 0.4 ל- 0.6.</li>
	<li>לקבוע בקירוב כייל חיידקי שימוש בנוסחת ההמרה נגזר מדעית. במעבדה שלנו, תרבות Lm גדל אקספוננציאלית ב- BHI הוא כ- 1.3 x 109 המושבה ויוצרים /OD יחידות (CFU)600. למזער את כמות הזמן תרבויות חיידקי נחשפים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בדיוק לפני זיהום להתאים את כייל נוגדנים ל- 5 x 107 CFU/mL באמצעות DMEM מראש ומחוממת/FCS כמו diluent.</li>
</ol>3. זיהום
<ol><li>עובדת במהירות ובדייקנות, להוסיף 20 µL (1 x 106 CFU; ריבוי של זיהום, MOI = 5) של טריות Lm inoculum (שלב 2.4 לעיל) כדי בארות על ידי הטיית מעט את המנה והצבת בקפידה את הטיפ pipet בתקשורת שמעליה; הערה: להימנע מלגעת בקירות של הבאר עם קצה pipet.</li>
	<li>בעדינות pipet התוכן של כל טוב על מנת להבטיח להשלים ערבוב; לא ללחוץ או באופן משמעותי להטות את הצלחת כמו זה יתפשט Lm את החומות של הבאר. לחזור תא תרבות מנה 37 °C/5% CO2 מיכלים.</li>
	<li>להכין פתרון גנטמיצין 10 µg/mL באמצעות מדיה ממוזגים מבארות נגוע כמו diluent.</li>
	<li>ב 30 דקות לפרסם זיהום (mpi), בזהירות להוסיף 30 µL של גנטמיצין פתרון (הריכוז הסופי 2.5 µg/mL), בעדינות pipet התכנים גם לפני ו תא החזרה תרבות מנה 37 °C/5% CO2 מיכלים.</li>
	<li>ב 60 mpi, לקצור ולס המתאימות CFU assay (נקודת זמן mpi 60) או את כרטיס FCM ניתוח (כפי שמתואר להלן בסעיפים 4 ו-5 בהתאמה).</li>
	<li>וולס הנותרים, בזמנים שונים לאחר מכן גם לקצור תאי כמו בעבר, עבור או Lm הופעתה וזמינותו, לחלוטין להסיר מדיה מן הבאר ולהחליף עם 150 µL של גנטמיצין ללא מדיה ממוזגים.</li>
</ol>4. דגימה עיבוד וניתוח של תאיים, מתהווים Lm מאת CFU Assay
<ol><li>הקציר, מעט להטות את המנה, הסר בזהירות את התקשורת כולה מן הבאר. להוסיף 0.50 מ ל מים מזוקקים סטריליים (dsH2O) הבאר. לאחר 30 s, להעביר את המים וכתוצאה מכך lysate (100) צינור microcentrifuge 1.5 mL ו מערבולת נמרצות במשך 10 s.</li>
	<li>להכין 10-1 ו-2 10 דילולים על-ידי הוספת 4.5 µL או µL 50 של המים lysate כדי µL 450 של dsH2O או בקצרה מערבולת כדי להבטיח ערבוב יסודי.</li>
	<li>מורחים 50 µL של 100, 10-1 ו/או 10-2 דוגמאות על גבי פלטות אגר מרק (ליברות) lysogeny.</li>
	<li>Assay עבור מתהווים Lm (שלב 3.6 לעיל), להסיר 10 µL של התקשורת על-ידי כיסוי, מחלקים אותו 5 שני µL aliquots: כדי aliquot אחד להוסיף 5 µL של DMEM/FCS וכדי את aliquot השני להוסיף 5 µL של DMEM/FCS המכיל 5 גנטמיצין µg/mL. הפקד האחרון מבדיל בין חוץ-תאית Lm (גנטמיצין רגיש) ואת וזמינותו תאיים Lm (גנטמיצין עמיד) ב CFU עוקבות.</li>
	<li>לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, להוסיף 90 µL של dsH2O, מערבולת נמרצות עבור 10 s, התפשטות 50 µL על פלטות אגר ליברות.</li>
	<li>ספירת מושבות Lm על פלטות אגר LB לאחר 2 ימי דגירה ב 37 º C.</li>
</ol>5. דגימה עיבוד וניתוח של תאיים, מתהווים Lm מאת Cytometry זרימה (FCM)
<ol><li>להכין RAW 264.7 תאים כמתואר בצעדים 1.1-4. להתאים לתאים עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל ולהוסיף 1 מ"ל (1 x 106 תאים) בארות של תבשיל תרביות רקמה 6-. טוב.</li>
	<li>להכין את חיידק inoculum כפי שמתואר בשלב 2.1-2.3, להדביק תאים עם נפח של inoculum המתאימים MOI של 50 (5 x 107 CFU).</li>
	<li>1.5 שעות פוסט זיהום. מדד מחירי הבתים (. של), לאסוף את המדיה מן הסט הראשון של וולס, הכנס צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 500 µL 4% paraformaldehyde (PFA) ומקום על הקרח עד שיסתיים העיבוד של כל בארות.</li>
	<li>כדי לאסוף תאיים Lm, להוסיף 1 מ"ל של dsH2O הבאר ואחרי 60 s, להעביר את המים וכתוצאה מכך lysate צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 500 µL של 4% מחברים. מערבולת נמרצות עבור 10 s ומקום על הקרח עד שיסתיים העיבוד של כל בארות. (דוגמת עיבוד מתואר בשלב 5.8 להלן).</li>
	<li>וולס הנותרים, להסיר מדיה והחלף 1 מ"ל של DMEM/FCS עם גנטמיצין 5 µg/mL כדי להרוג חוץ-תאית Lm ולחזור מיד תאים חממה.</li>
	<li>לאחר 30 דקות (2 מדד מחירי הבתים של) להסיר מדיה והחלף DMEM/FCS ללא גנטמיצין.</li>
	<li>לאחר 2 ו 4 h (4 ו- 6 מדד מחירי הבתים של) לקחת את השנייה, פעם שלישית נקודות על ידי איסוף lysates ומדיה צעדים 5.3 ו- 5.4.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות ב x 10,000 g עבור 7 מינימלית הסר תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה.</li>
	<li>להשעות כל גלולה ב מכתים קוקטייל של 50 µL של 4% כדורגלן ו 15 µL של phalloidin. דגירה צינורות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
	<li>לאחר דגירה להוסיף 1 מ"ל FACS מאגר כל שפופרת של פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.</li>
	<li>ספין צינורות ב x 10,000 g עבור 7 מינימלית הסר תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה.</li>
	<li>להשעות כל גלולה µL 400 FACS מאגר לשימוש מיידי, או 200 µL מאגר FACS, 200 µL של 4% מחברים אם מאחסן לניתוח בשלב מאוחר יותר.</li>
	<li>להפעיל דגימות cytometry זרימה וניתוח הנתונים שנאספו.</li>
</ol>6. דגימה עיבוד וניתוח של Lm קולוניזציה ותגובות מארח בכבד
<ol><li>להכין Lm זיהום כפי שמתואר בשלב 2.1-2.3.</li>
	<li>לחשב את הסכום הדרוש של תת-תרבות עבור כייל הרצוי של 3 x 106 CFU/mL.</li>
	<li>בדיוק לפני זיהום לדלל את כמות החיידקים מחושב מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק מראש ומחוממת), נפח סופי של 1 מ"ל. . זה inoculum קלט זה מוזרק לתוך העכבר...</li>
	<li>באמצעות מזרק אינסולין 28 G½ 100U, לצייר µL 100 (3 x 105 CFU) של inoculum קלט ולהסיר את כל בועות האוויר גלוי.</li>
	<li>למקם את העכבר (זן C57BL/6; גברים בין 6 ל- 12 שבועות) הריסון אחזקות, השתמש מים חמים (לא יותר מ 45 ° C) להתרחב את הווריד הזנב, ואז להזריק את inoculum קלט לתוך הווריד.</li>
	<li>צלחת 10-2 ו- 10-3 דילולים של inoculum קלט על גבי לוחות 10bcm אגר ליברות, דגירה בין לילה ב 37 ° C כדי לקבוע את המינון קלט בפועל.</li>
	<li>ב. מדד מחירי הבתים, של 18 בצורה הומאנית המתת חסד העכבר (CO2 חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם) ושימוש צפק העכבר פתוח לחתוך במספריים סטרילי כדי לאסוף את האונה הקדמית של הכבד באמצעות זוגות נפרדים של פינצטה ומספריים עבור מבחוץ פנימה של העכבר. מקם את הכבד 6 ס מ פטרי על קרח.</li>
	<li>חותכים את הכבד לקוביות קטנות ומניחים לתוך בקבוקון זכוכית עם פס מגנטי מערבבים. להוסיף 2 מ של 2 מ"ג/מ"ל collagenase D מחדש DMEM ללא FCS. דגירה הבקבוקונים-37 מעלות צלזיוס על פגים 30−45 דקות. ברגע הרקמה הוא הומוגני, להוסיף 3 מ"ל של DMEM/FCS כדי להשבית את collagenase.</li>
	<li>לסנן את התאים דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי, הוספת יותר DMEM/FCS במידת הצורך.</li>
	<li>צנטריפוגה תאים ב x 800 גרם הצניפה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, להשעות את התא גלולה ב 500 µL ACK המאגר כדי lyse כדוריות דם אדומות.</li>
	<li>דגירה תאים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות במאגר ACK. להשעות תאים 1 מ"ל של DMEM/FCS.</li>
	<li>צנטריפוגה תאים ב x 800 גרם הצניפה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, להשעות ב 1 מ"ל של DMEM/FCS. אז לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.</li>
	<li>להעביר עונה 1 פרק 106 תאים צינור microcentrifuge 1.5 mL ו spin כדי גלולה. ואז להשעות ב 1 מ"ל של dsH2O ו מערבולת כדי lyse התאים. צלחת µL 50 על צלחות LB-מדולל ו-2 10 דילולים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, לספור Lm לניתוח CFU.</li>
	<li>להעביר עונה 1 פרק 106 תאים לתוך צינורות FACS עבור כל דגימה רקמה על פי הסעיפים תא, לשטוף עם 1 מ"ל של מאגר FACS.</li>
	<li>צנטריפוגה תאים ב x 800 גרם הצניפה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהסיר תגובת שיקוע.</li>
	<li>להכין מקוקטייל נוגדן המכיל את הנוגדנים עניין בהתבסס על הריכוז המומלץ עבור כל נוגדן ומאגר FACS. ראה טבלה של החומרים הכמויות המומלצות ניתוח.</li>
	<li>להשעות גלולה ב 100 µL של נוגדן קוקטייל, דגירה צינורות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>לאחר דגירה, להוסיף 2 מ"ל FACS מאגר כל שפופרת, להשעות את התאים.</li>
	<li>צנטריפוגה תאים ב x 800 גרם כדי הצניפה ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע. ואז להשעות בגדר µL 400 FACS מאגר לשימוש מיידי, או 200 µL מאגר FACS, 200 µL של 4% מחברים אם אחסון עבור מאוחר יותר.</li>
	<li>לנתח תאים ידי cytometry זרימה (ראה שלב 5.13).</li>
</ol>

<ol><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
<li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li>
<li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li>
<li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li>
<li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085(2018).</li>
<li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li>
<li>Blériot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut%2C+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li>
<li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li>
<li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li>
<li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+%28HRI%29+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754(2013).</li>
<li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2%CE%B1+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707(2018).</li>
<li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).</li>
<li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505(2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בשל תוכנית תהליכית וברכבות זיהום הסלולר שלה, Lm הוא פתוגן אידיאלי כדי לחקור את פעילות הסלולר להשפיע זיהום. זוהו מספר גורמים המארח, המשפיעות באופן חיובי או שלילי Lm זיהום הסלולר11,12,13,14. לארח שתיים כאלה גורמים מאופיין במעבדה שלנו, Perforin-2 ו- Heme מווסת המדכא (P2, שלום), לווסת את תכונות שונות של תהליך זיהום Lm . כפי שמוצג באיור3, תאים...

זיהום מבוססי מודלים ניסיוניים הם מאתגר מיסודו בשל תלותם התנאים מדינת המוצא של המארח הפתוגן, את האסטרטגיות זיהום שונים של הפתוגן, ואת הקושי של ייחוס הפתוגן, המארח-מונחי תהליכים בהתבסס על תוצאות. החיידק ליסטריה (Lm) הפך פתוגן אידיאלי כדי לחקור את המארח ההגנה תגובות בגלל שלה גנטי, מיקרוביולוגי ללקוחות שלנו את האסטרטגיה מהיר ולא תהליכית זיהום הסלולר שלה, צלולים יחסית קשר בין פנוטיפים זיהום סלולרי-אורגניזם-ורמת שלה. זיהום הסלולר של Lm ממשיך דרך ארבעה שלבים ברורים1: (i) הפלישה הסלולר אשר מסכם עם Lm סגירות בתוך חלולית; (ii) Lm-בבימויו של התפרקות של קרום חלולית שחרורו של Lm לתוך ציטוזול; (iii) שכפול intracytosolic; חדירה פיזית (iv) של קרום פלזמה כי התוצאות גם זיהום של תאים סמוכים ישירות (כמו למשל גיליון אפיתל) או, בכל תאי בידוד, שחרורו של Lm לתוך חצרו חוץ-תאית. כל אחד משלבים אלה מקודמים על ידי ספציפי Lm-מקודד גורמים (המכונה 'הגורמים התקפה אלימה'), נמחק, לגרום למומים זיהום במודלים הסלולר והן בבעלי חיים. אסטרטגיה זו זיהום כללי התפתח באופן עצמאי על-ידי מספר של פתוגנים 'cytosolic' כביכול2.
המושבה יוצרי מבחני יחידה (CFU) מועסקים באופן נרחב כדי להעריך את שניהם במבחנה (קרי, סלולר) כמו גם ויוו (קרי, אורגניזם) תוצאות הזיהום. בנוסף את רגישותם גבוהה, במיוחד עבור זיהומים ויוו, מבחני CFU מספקים readout ברורה וחד משמעית של פתוגן פלישה והתפשטות תאיים הישרדות /. CFU מבחני היו בשימוש נרחב כדי לנתח גורמים תא באימות Lm ומארח, שמשפיעים על זיהום. מחקרים קודמים אלה להיות לנתח הפלישה הסלולר ושכפול intracytosolic אינפורמטיבי, CFU מבחני. לא, לפי מיטב ידיעתנו, השתמשו כדי לעקוב אחר השלב הרביעי של תהליך זיהום Lm : הבריחה הסלולר. כאן, אנו מתארים פשוטה יחסית ניתן לנטר אמצעי לבריחה איך הסלולר (ןלהל 'הופעתה') על ידי CFU assay (כמו גם על ידי cytometry זרימה), הצג דוגמאות איך שני גורמים הפתוגן, המארח-מקודד לווסת את השלב הזה של Lm מחזור זיהום. הניתוח של השלב מסוף של מחזור הסלולר של זיהום Lm עלולה להפוך את זה ניתן לזהות הפתוגן נוספים, גורמים ספציפיים זיהום תא מארח ופעילויות.

<table><tbody><tr><td>מאגר ליזינג ACK</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>ArC אמין חרוזי פיצוי תגובתי&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>BHI (עירוי לב למוח) מרק</td><td>EMD Milipore</td><td>מסננת תאים 110493</td><td></td></tr><tr><td>, 70 ומיקרו; m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM media&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FACS&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS - מנוטרל בחום&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>הנקס תמיסת מלח מאוזנת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>תאי גידול MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>LIVE / DEAD ערכת כתמי תאים מתים צהובים לתיקון&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>רודמין פלואידין&nbsp;</td><td>תרמו פישר</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800 מנתח ספקטרלי</td> מזרק <td>סוני</td><td></td><td></td></tr><tr><td>28 גרם 1/2 אינץ' 1 סמ"ק</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP תרבית רקמות 48 צלחות&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>TPP תרבית רקמות 6 צלחות באר&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp</td><td>eAds eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אנטיגן</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE Cy5, דילול = 1/100, Clone = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = AF 647, דילול = 1/100, Clone = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = APC Cy7, דילול = 1/100, Clone = 30-F11</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE, דילול = 1/100, Clone = BM8</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>פלורוכרום = AmCyN, דילול = 1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PacBlue, דילול = 1/200, שיבוט = HK1.4</td></tr><tr><td>MHC II</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = AF 700, דילול = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK 1.1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = BV 605, דילול = 1/100, Clone = PK136</td></tr></tbody></table>

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

ישנם מגוון רחב של אסטרטגיות פתוגנים חיידקיים להעסיק כדי לשרוד להתרבות פעם אחת בתוך התא האיקריוטים. מה שנקרא 'cytosolic' פתוגנים (ליסטריה, שיגלה flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisו ריקטסיה spp.) לקבל גישה ציטוזול תא נגוע על-ידי enzymatically ופיזית משפילים קרום vacuolar הראשי. פעם אחת ציטוזול, פתוגנים אלה הן להתרבות כמו גם ליצור כוחות מספיקים מכני לחדור קרום פלזמה של התא המארח כדי להדביק תאים חדשים. . הנה, אנחנו מראים כיצד מסוף שלב של מחזור הסלולר זיהום של ל' monocytogenes (Lm) ניתן לכמת על ידי המושבה יוצרי יחידת מבחני והן cytometry זרימה, לתת דוגמאות איך שני השפעת גורמים הפתוגן, המארח-בקידוד זה תהליך. אנו גם מראים התכתבות קרוב של Lm הדינמיקה זיהום של תאים בתרבית נגוע במבחנה, אלה בתאי הכבד נגזר עכברים נגועים ויוו. אלה מבחני מבוססי פונקציה פשוטה יחסית, ניתן בקלות לשנות-מבוססות-גילוי מסכי תפוקה גבוהה עבור מאפננים של תפקוד התאים האיקריוטים.

הערכת תפקידה של פתוגן וגורמים מקודד מארח להשפיע על זיהום הסלולר שימוש בתנאים זיהום המתוארים לעיל, 0.15% פראי-סוג הקלט Lm הוא התאושש לאחר h 1.5 של דגירה שיתוף עם תרבותי מקרופאגים (איור 1א'). ב ה 1.5 עוקבות של שיתוף דגירה (3 h פוסט זיהום, מדד מחירי הבתים של), הייתה עלייה 4-fold בחדר התאוששות של קיימא Lm והיה בין 3 ל 6 מדד מחירי הבתים של עלייה 7.5-fold נוספים ההתאוששות של קיימא Lm. מאז גנטמיצין לאנט...

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

פתוגנים מיקרוביאליים המשכפלים תאית חייבים בסופו של דבר לצאת מהתא הנגוע. אשר, בהשוואה להיבטים אחרים של אינטראקציות פתוגן המארח הוא understudied יחסית. כאן, אנו מתארים טכניקות לניתוח שפעת פתוגן.אנו מראים כיצד ניתן להשתמש ב- assays פשוט יחסית כדי להעריך יעילות efflux או לאפיין פתוגנים שלאחר efflux הטכניקות הכלליות המתוארות כאן ישימות באופן נרחב למרות מודלים ספציפיים תא מארח פתוגן עשויים להיות שונים קינטיקה, המינונים ואולי לקרוא החוצה. כמו בהקמת כל מערכת ניסיונית, חיוני שיקבעו בקרות ברורות שיבטיחו שתהליכים ביולוגיים אמיתיים ינצפיו בדגימות ניסיוניות או בקובות. הפגנת ההליך תהיה פטריה גייל, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בניסוי הזיהום, השתמשו ב-pipette כדי להוסיף 20 מיקרוליטרים של Lm inoculum שהוכן טרי ל הבאר, כאשר המנה מוטה מעט וקץ הפיפטי ממוקם בקפידה במדיה המוזלת. הימנע מנגיעה בקירות של באר עם קצה פיפטה. בעדינות pipette את התוכן של כל באר כדי להבטיח ערבוב מלא.אין לנער או להטות באופן משמעותי את הצלחת כדי למנוע הפצת LM על קירות הבירה. להחזיר את צלחת תרבות התא ל 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזים פחמן דו חמצני אינקובטור. השתמש במדיה מותנה מתאים לא מודבקים כמו diluent להכין 10 מיקרוגרם לכל פתרון ג'נטמיצין מיליליטר.ב 30 דקות לאחר ההדבקה, בזהירות להוסיף 30 microliters של פתרון ג'נטמיצין

using-bacterial-pathogen-to-probe-for-cellular-organismic-level-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול כללית לחקר פלישה של תאים לארח על ידי פתוגן חיידקי, תוך...

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

סרטון זה מדגים טכניקת כימות חוץ גופית לקביעת זיהום ליסטריה מונוציטוגנים של מקרופאגים על ידי בדיקת היחידה יוצרת-המושבה. מושבות החיידקים על צלחת האגר מייצגות את אוכלוסיית החיידקים התוך-תאיים הנמלטת ממנגנון ההגנה של המאכסן ושורדת בתוך המקרופאגים.

כימות זיהום חיידקי בתאים מארחים על ידי בדיקת היחידה יוצרת-המושבה

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת היכולת של Porphyromonas gingivalis, חיידק פתוגני אנאירובי, להיצמד ולפלוש לתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). לאחר הדבקת תאי המאכסן בחיידק, התאים המארחים עוברים ליזה כדי לשחרר חיידקים דבוקים ומופנמים. כאשר הליזט מצופה בתווך מתאים, נוכחות מושבות מעידה על אינטראקציות מוצלחות בין חיידקים לתאים מארחים.

בדיקת זיהום חיידקי לחקר אינטראקציות אנאירוביות בין חיידקים לתאים מארחים

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

חיידקי ליסטריה הוא פתוגן חיידקים גראם חיובי משמש לעתים קרובות כמודל עיקרי לחקר טפילות תאית. הדמיה מאוחר L. חיידקי לשלבי זיהום בהקשר של מסכי RNA התערבות קטנים מאפשר למחקר העולמי של מסלולים הסלולר נדרשים לזיהום חיידקים של תאי מארח יעד.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

פיתחנו פרוטוקול מהיר, רגיש וניתן לשחזור לפרופיל ביטוי גנים פתוגני במהלך זיהום.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

מתוארות שתי בדיקות לבדיקת תפוקה גבוהה מבוססת מיקרוסקופיה של גורמי מארח המעורבים בזיהום ברוצלה. בדיקת הכניסה מזהה גורמי מארח הנדרשים לכניסת ברוצלה ובדיקת נקודת הקצה הנדרשים לשכפול תוך תאי. בעוד שרלוונטי לגישות חלופיות, בדיקת siRNA בתאי HeLa משמשת להמחשת הפרוטוקולים.

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

חקור שיטות לניתוח יציאת פתוגנים מתאי מארח באמצעות מבחני זיהום בתרבית ובעכברים. טכניקות אלו מאפשרות הערכת יעילות היציאה ואפיון הפתוגנים לאחריה לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

גלה סרטונים נוספים