ריבוב ממוקד אולטרסאונד גירוי עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח mechanobiology, כגון כיצד דגימות ביולוגיות להגיב כוחות מכניים המיוצרים על ידי גירוי אולטרסאונד בעוצמה נמוכה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לניסוי להחיל באופן לא פולשני כוחות מכניים על מדגם ולמדוד היקפים ביולוגיים שונים בזמן אמת. כדי להתחיל, לאט לקדוח חור 12 מילימטר בתחתית צלחת תרבות סטנדרטית 35 מילימטר באמצעות מקדחה לחץ אנכי.

לאחר קדח, להסיר חתיכות פלסטיק מחובר לתחתית המנה באמצעות להב, כדי ליצור משטח חלק בצד החיצוני. לאחר מכן, יש למרוח שכבה דקה של אפוקסי ברמה ימית או דבק על המשטח התחתון החיצוני של המנה. מעל ההיבק, מניחים סרט עבה של פוליאסטר בעובי שתי נקודות וחמישה מיקרון, לוחצים בחוזקה כדי לוודא שההיידוך מתפשט באופן שווה בין הסרט למשטח הפלסטיק העבה.

בעדינות למשוך את הסרט בצורה צנטריפוגלית עם האצבעות, כדי ליצור משטח שטוח. לאחר שההיבש התייבש, שטפו לזמן קצר את המנה התחתונה של הפוליאסטר עם 95% אתנול. לאחר מכן, UV לעקר את המנה על ידי הצבת אותו תחת מקור חזק 254 ננומטר UV העירור.

התאימו את משך הזמן והעוצמה כדי לספק מנה של UV של כ-330 מילי-ג'אול לס"מ מרובע. לאחר מכן, לדלל תערובת חלבון מטריצה חוץ תאית זמין מסחרית עם מדיום התרבות הרצוי ביחס של אחד עד 100. לעבוד על קרח כדי למנוע פילמור מטריצה, במהירות להחיל 100 microliters של תערובת בינונית על סרט פוליאסטר.

מניחים את המכסה בחזרה על המנה כדי לשמור על סטריליות. לאחר ההקפאה, חודרים את המנות התחתונות מצופות המטריצה והפוליאסטר בתרבות התאים, חממה עם מאגר פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך 6 עד 12 שעות. לאחר הדגירה, שאפו את המדיום העודף וזרעו ישירות את פני השטח בתאים בצפיפות הרצויה.

מניחים מיכל מים מתחת למטרה של מיקרוסקופ זקוף. לאחר מכן, באמצעות רכיבים אופטומכניים זמינים מסחרית, למקם את מחזיק המדגם בין המטרה לבין מתמר. ודא כי החלקים הנעים והנוקטים של שלבי התרגום נמצאים מחוץ למיכל או מעל קו המים כדי למנוע נזקי מים.

לאחר מכן, מלאו את המיכל במים דה-מיונים ומוזלים עד למישור האופקי של מחזיק הדגימה, לפני שימוש במתמר הטבילה. באמצעות רכיבים אופטומכניים שאינם קורוסיביים וזמינים מסחרית, ודא כי מתמר במצב אלכסוני ביחס לנתיב האופטי. זה יבטיח שכל הגלים המשתקפים יופנו הרחק מהדגימה.

התאם את תדירות מחולל הפונקציות לתדר השיא הנומינלי של מתמר. לאחר מכן, ליצור פולס מתח סינוזואידי של משך הרצוי ותדר החזרה, באמצעות מצב פרץ של מחולל הפונקציה. לאחר מכן, התאימו את מתח השיא לשיא לערך הרצוי.

ודא שמשך הדופק קצר יותר מהזמן שחלף בין שני פולסים רצופים. חבר את הפלט של מחולל הפונקציות לקלט של אוסצילוסקופ. השתמש באוצילוסקופ כדי לאשר כי צורת הגל תואמת את האות הרצוי.

לאחר מכן, חבר את הפלט של מחולל הפונקציות לקלט של כוח של מגבר RF בגודל תקין. באמצעות בדיקה הידרופון הפועלת עם טווח תדרים ועוצמה אקוסטית תואמת לזה של מתמר אולטרסאונד, בזהירות להביא את קצה החללית לפוקוס בתוך שדה המבט של המטרה במיקום המדגם. ודא כי הן בדיקה מתמר שקועים באמבט המים ולבצע יישור מראש ברוטו של המתמר על ידי מיקום חזותי הציר האקוסטי שלה לכיוון החללית הידרופון.

ודא שהמרחק בין השניים תואם לאורך המוקד של התמר. אין להקפיץ את קצה ההידרופון עם כל אובייקט פיזי מלבד מים, שכן זה ישנה את הציפוי שלו וישפיע על המדידה. לאחר מכן, חבר את פלט ההידרופון לאחד קלט האותות של האוסצילוסקופ.

לאחר מכן, חבר את גורם המפעיל של הסינכרון ממחולל הפונקציות לקלט אוסצילוסקופ אחר. דמיין את שני האותות בו זמנית על אוסצילוסקופ. לאחר מכן, כונן מתמר עם כמה מחזורי אולטרסאונד במחזור חובה נמוך משרעת נמוכה, כדי למנוע פגיעה בבדיקה.

בדוק עם היצרן של הידרופון תנאי פעולה בטוחים, כדי למנוע פגיעה בקצה הידרופון. התאימו את ידית ה-S-division בהתאם לזמן הנסיעה של האולטרסאונד מפני השטח של מתמר להידרופון. חפש אות הידרופון על אוסצילוסקופ לאחר הדק הסנכרון.

לאחר מכן, מפעילים באיטיות את המתמר באמצעות שלב XYZ ממונע או ידני. מקם את המתמר במצב המתאם עם אות ההידרופון המקסימלי. כאשר הקרן מיושרת כעת, למדוד את משרעת שיא לשיא של פלט הידרופון ב oscilloscope עבור מתחים שונים נהיגה המתמר.

הקפד לא לחרוג ממגבלת הלחץ של ההידרופון. החלף את מדיום התרבות של התא במאגר ההדמיה הרצוי המכיל חמישה מיקרומולרים של צבע רגיש לסידן, כגון Fluo-4 AM. לאחר מכן, להחגור את צלחת התרבות באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, לשטוף בזהירות תאים עם מאגר זהה ללא צבע.

לאחר מכן, מניחים את המנה במחזיק הדגימה. לרגש את התאים באמצעות תאורת אור כחול ב 490 ננומטר. כוונן את עוצמת העירור ואת החשיפה למצלמה כדי למנוע הלבנה מוגזמת או רוויית פיקסלים.

בצע הדמיית זמן באמצעות מטרת טבילה עם מרחק עבודה ארוך לקבלת איכות תמונה טובה יותר, ולצמצם השתקפויות לא רצויות. כאן, תאי גליובלסטומה מוצגים על סרט פוליאסטר מצופה מטריצה חוץ-תאית במדיום תרבות סטנדרטי. תאים אלה כבר דגירה עם כתב פלואורסצנטי רגיש לסידן.

בתמונה זו, הנקודות האדומות מייצגות תאים פלואורסצנטיים בודדים, המזוהים באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. לאחר גירוי במשך 10 שניות עם אולטרסאונד, הגבהות סידן חזק היו דמיינו באזורים רבים של עניין. מספר אזורי העניין המופעלים מוצגים כאן לאורך זמן.

לאחר ההפעלה 10 שניות עם אולטרסאונד, כ 70% מהאזורים נמצאו מעל ערכי סף המוגדרים על ידי המשתמש. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ליישר את קרן אולטרסאונד לפני ביצוע מדידת פלואורסצנטיות.