זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

החלפת אזורים של חלבונים דומים מבחינה מבנית כדי ליצור קימראס מאפשרת לנו לחקור את החשיבות של אזורים האחראים על תפקודים ביולוגיים של המולקולה להיחקר. חילופי אזורים קדם למבנה המשני הכללי של החלבון כך שניתן יהיה להבדיל בין המבנה הכללי של האזור לבין התפקודים הביולוגיים התיווכו ישירות. ניתן להפוך אותו לבחירת האזורים המדויקים שיש להחליף.

החל מחילופים גדולים יותר הוא בדרך כלל מועיל לזהות את הפונקציונליות העיקרית של החלבון. כדי להתחיל את ההליך, בחר חלבון מתאים כתורם כדי להחליף אזורים עם חלבון העניין כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להשיג את רצפי חומצות האמינו חלבון של הנמען וחלבונים התורם מתוך מסד הנתונים רצף התייחסות על ידי גישה ראשונה סעיף הגן בדף האינטרנט seq ref.

הקלד את שם החלבון המעניין בתיבת החיפוש ולחץ על חיפוש. לחץ על שם הגן עבור המין הרצוי ברשימה וכתוצאה מכך. גלול מטה אל מקטע seq של ref כדי לראות את כל צורות ה- isoform המתועדות.

לחץ על מזהה הרצף עבור isoform של עניין. גלול מטה ולחץ על תקליטורים כדי להדגיש את אזור קידוד החלבון של הגן. בפינה השמאלית התחתונה של המסך, לחץ על FAFSDA והעתק את רצף הגנים.

שמור את רצף הדנ"א באמצעות תוכנת עריכת דנ"א מתאימה. בעת שימוש ב- APE הזמין בחופשיות, פתח את התוכנית, הדבק את הרצף המועתק בתיבה הריקה, בחר את שם הרצף ולחץ על שמור. עכשיו, לבחור את אזורי החלבון להיות מוחלף במבני קימריק שונים על ידי חלוקת תחילה את רצף החלבון של עניין באזורים מבניים שונים.

כדי לעשות זאת, להוריד את הנתונים המבניים של החלבון של עניין מאתר האינטרנט של PDBe. גש לדף PDBe עבור החלבון והורד את קובץ ה- PDBe על-ידי לחיצה על הורדה בצד ימין של המסך. פתח את קובץ PDBe במערכת הדמיה מולקולרית, כמו פימול.

בפימול, הצג את רצף הנוקלאוטיד, הסתר את הנתונים המבניים המוגדרים כברירת מחדל ובחר את התצוגה המצוירת כדי לדמיין בבירור את התכונות המבניות של החלבון. לחץ על רצף הנוקלאוטיד בחלק העליון של המסך כדי להדגיש חלקים שונים של המולקולה, וציין את חומצות האמינו המתאימות לכל תכונה מבנית ייחודית. עכשיו, להוסיף ביאורים לאזורים מבניים נפרדים על רצף ה- DNA ב- APE על ידי פתיחת רצף ה- DNA, בחירתו, ולחיצה על ORFs לתרגם, ולאחר מכן לחץ על חומצת האמינו האחרונה של האזור הראשון כדי להדגיש את מיקומו ברצף ה- DNA ולבחור את הקידוד של הנוקלאוטיד עבור אזור זה.

לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הבחירה ובחר תכונה חדשה כדי לתת לה שם וצבע. חזור על התהליך עבור כל אזור מבני שזוהה בשלב הקודם. כדי ליישר את רצפי השאריות של שני החלבונים, ראשית, להשיג את רצפי חומצות האמינו המלאים של חלבונים תורמים וקולטנים ב- APE.

כמו קודם, פתח את רצף הדנ"א של התורם, בחר אותו ולחץ על ORFs לתרגם. לאחר מכן, לגשת לדף האינטרנט של אומגה Clustal ולאחר מכן לשים את רצפי חומצות האמינו של שני חלבונים. כל רצף צריך להמשיך על ידי שורת טקסט עם שם חלבון להיות מזוהה כראוי.

גלול מטה ולחץ על שלח. אחזר את קובץ היישור על-ידי לחיצה על כרטיסיית קובץ יישור ההורדה ושמור אותו. כל תוכנית לעריכת טקסט יכולה לפתוח קובץ זה.

באמצעות קובץ היישור כהפניה, ביאור האזורים המבניים המתאימים של חלבון התורם ברצף ה- DNA שלהם. צור עותק של רצף הדנ"א המבאר של חלבון הקולטן ושנה את שמו לחלבון קימרי. פתח את רצף הדנ"א ששמו שונה ב- APE.

בחר את האזור שיש להחליף בחלבון התורם, ולאחר מכן בחר את האזור המתאים בחלבון הקולטן ששמו שונה. הדבק את רצף הדנ"א של חלבון התורם ולאחר מכן שמור את השינויים. עצב את פריימרים הטרמינל באמצעות עורך DNA כגון APE.

צור קובץ DNA חדש, ליזום את פריימר מסוף הקצה עם רצף מנהיג. ואחריו אתר ההגבלה הראשון שנבחר בווקטורים MCS והמרחב האופציונלי ב-18 עד 27 זוגות הבסיס הראשונים של גן העניין. בקובץ הדנ"א החדש, תכנן את רצף פריימר מסוף C כך שיתחיל עם 18 עד 27 זוגות הבסיס הסופיים של גן העניין ואחריו רווח אופציונלי, אתר ההגבלה השני שנבחר ורצף המנהיגים.

סמן את הרצף כולו, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר מחמאה הפוכה כדי להשיג את פריימר הפוך. עכשיו, תכנן פריימרים לכל אחד מאזורי הגבול במבנונים הקימורים. ברצף הדנ"א של קימרה, סמן אזור זוג בסיס 30 באזור שבו הרצפים המקוריים והכניסו נמצאים במגע.

זה מורכב מ-15 זוגות בסיסים בכל רצף. העתק את האזור והדבק אותו בקובץ דנ"א חדש. רצף זה יהיה פריימר קדימה.

הפוך עותק של פריימר קדימה שנוצר בשלב הקודם, ושנה את שמו לתווים ההפוך. סמן את רצף פריימר, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר מחמאה הפוכה כדי ליצור את רצף פריימר הפוך. חזור על שלבים אלה עבור כל אזור מגע ברצף הדנ"א ה קימריק.

בדרך כלל, שתי קבוצות של פריימרים הפוכים קדימה נדרשים כדי ליצור קימרה אחת, אלא אם כן ההחלפה מתרחשת באזורי מסוף N או מסוף C. הכינו תערובת תגובת PCR אישית לכל אחד מהשברים שמלחינים את החלבון הקמרתי. ראשית להגדיר נקודה אחת חמש צינור microfuse mililiter על קרח צינור reagents שונים של תערובות PCR בסדר המפורטים בפרוטוקול הטקסט.

ודא שהתבניות והתבניות הנכונות מועסקות עבור כל תגובת PCR. תווית שתי נקודות אפס דק מוקף חומה שני צינורות PCR mililiter עבור כל תגובה ולהעביר 20 microliters של תערובת PCR המתאימה בכל צינור. העבר את צינורות PCR לתוך תרמוצ'יקלר PCR וליזום את הפרוטוקול כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

לאחר השלמת תגובת PCR, להוסיף ארבעה microliters של שישה x מאגר טעינת DNA בכל צינור. הכנס את ג'ל אגרוס אחוז אחד ביחידת אלקטרופורזה ולכסות עם חיץ TAE. בזהירות לטעון את הדגימות לתוך הג'ל יחד עם משקל מולקולרי האחרון.

לאחר הפעלת הג'ל ב 80 עד 120 וולט במשך 20 עד 45 דקות, לכבות את יחידת אלקטרופורזה ולהסיר את ג'ל אגורוס. דמיינו את רצועות הדנ"א המוגברות תחת אור UV. בעזרת סכין גילוח, חותכים את שברי הדנ"א הבודדים מהג'ל ומעבירים אותם לשני צינורות מיקרו-פיוז'ן מיליטריים.

לאחר שימוש בערכת ניקוי PCR לטיהור שברי הדנ"א, כימת את כמות הדנ"א שנמצאה על ידי מדידת ספיגת הדגימות ב-260 ננומטר ו-340 ננומטר בספקטרופטומטר. עכשיו, לבצע הגברה PCR כדי ליצור את רצף ה-DNA קימרית. ראשית, להגדיר 50 microliters של תגובת PCR כדי להתיך את המרכיבים הנפרדים של קימרה כמו קודם.

השתמשו בפרימרים של מסוף N ו-C יחד עם 10 ננוגרם של כל אחד מרסיסי הדנ"א המוגברים. לשחזר ולכומת את שבר ה-DNA מטוהר כמו קודם, ב 30 microliters של מים ללא גרעין. קטע זה מכיל את רצף הדנ"א הקימרי מוקף באתרי ההגבלה הכלולים בפרימרים של הטרמינל.

דור של חלבון קימריק בא לידי ביטוי עם שני בני משפחת האינטר לוק ושישה סיטוקין. אונקוסטטין M בגורם מעכב לוקמיה. הרמת OSM קימרה נובעת מהחלפת אזור לולאת BC של OSM עם רצף הרמה מתאים.

שלב ההגברה הראשון של PCR כלל שלוש תגובות נפרדות. קטע OSM N-מסוף, אשר נדרש N-מסוף OSM קדימה ו- BC להתחיל פריימרים הפוכים השתמשו OSM כתבנית. לולאת LIF BC הושגה באמצעות BC התחל קדימה ו- BC N פריימרים הפוכים באמצעות LIF כתבנית.

קטע OSM של מסוף C השתמש בפריימים אחוריים של קצה BC קדימה ו- C מסוף OSM וכן ב- OSM כתבנית. קטעים מטוהרים אלה שימשו אז כתבנית בתגובת PCR השנייה יחד עם OSM מסוף N קדימה ו- C-מסוף OSM פריימרים הפוכים כדי להגביר את רצף הגנים המתאימים OSM LIF BC לולאה. לאחר טיהור וטרנספורמציה ל- e-coli, פלסמידים בודדים היו מבודדים והוקרנו על ידי הגבלת עיכול אנזימים להכנסה נכונה של שבר ה- DNA.

אלקטרופורזה של ג'ל חשפה להיטים חיוביים שנשלחו לאחר מכן לאימות רצף. יש לייצר חלבונים קימריים ואת הפעילות הנמדדת במערכות סיעתיות מושלמות. על מנת לקבוע את החשיבות של האזורים המוחלף עבור אותה סיעה מסוימת.

טכניקה זו הייתה שימושית מאוד מיושם לעתים קרובות, הפרעה של קולטנים אות על מנת לזהות תחומים פונקציה מפתח ואתרי זיהוי קולטן. יש לטפל במספר בו אני משתמש לאלקטרופורזה של דנ"א באמצעות כפפות חד פעמיות, מעיל מעבדה ומשעפי מגן.