Name: האבחון של מחלת הירשפרונג על-ידי חיסוני שאיבה רקטלי ביופסיות עבור Calretinin, S100 חלבון וחלבון מוצר גן 9.5 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: למד פרוטוקול חיסון לביופסיות שאיבה רקטליות לאבחון מחלת הירשפרונג. השיטה מאתרת תאי גנגליון באמצעות calretinin, S100 ו-PGP9.5 בתוצאות בעלות רגישות וספציפיות גבוהות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לweibing טאנג על עזרתו הגדולה במתן מעבדת הצילום. מאמר זה נתמך על ידי מחקר הרווחה הציבורית, וקרנות מיוחדות התקבלו מן הבריאות הלאומית ותכנון המשפחה של סין (גרנט No. 201402007).

פרוטוקול זה אושר על ידי מועצת האתיקה המחקר של בית החולים האיחוד של האוניברסיטה של Huazhong המדע והטכנולוגיה.
1. שאיבה רקטלית ביופסיה
<ol><li>בצע את ביופסיה שאיבה פי הטבעת על ידי מנתח ילדים מיומן היטב עוזר באמצעות מערכת Rbi2 יניקה ביופסיה רקטלית לאחר קבלת הסכמה מושכלת מהשומר.<ol>
<li>לבצע RSB על חולים שיש להם את הסימנים הבאים: חוסר יכולת לעבור meconium אצל תינוקות או נפיחות ארוכת טווח עם או בלי עצירות אצל ילדים; ילדים עם עצירות ארוכת טווח הזקוקים שמן פרפין כדי להשלים את הצרכים; חסימת מעיים או ניקוב מעיים בעלי סיבות לא ידועות אצל ילדים העוברים בידור. הערה: התוויות RSB הן כדלקמן: ילדים שיש להם תסמינים חמורים, אשר נמצאים במצב פיזי עני, או מי לא יכול לסובלנית RSB; ילדים עם כניסה חריפה לבמה; ילדים העוברים השקה מעיים ללא החלמה מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע חוקן החזקה מלוחים רגילה כמו הכנת המעיים 36 h לפני ההליך כדי למנוע שרפרפים רופפים בצקת מוגזמת של רירית. הוסף פתרון מגנזיום גופרתי אם לילד יש עצירות חמורה. מנהל ויטמין K (1 מ"ג/ק"ג) כדי neonates. הערה: אין לבצע בדיקות דם לפני הניתוח או טיפול באנטיביוטיקה, מאחר שהן אינן נדרשות.</li>
	<li>. שים חולה בתנוחת הלייטוטומיה מעילים את המשטח של הצינור עם שמן פרפין. הכנס את הצינור בוטה הסתיימה 4-7 ס מ לתוך הרקטום עם החור הצדדי מול הקירות האחוריים או הצדדיים.</li>
	<li>הפעילו לחץ עדין על הצינורית כדי להקל על הדבקה מספקת של החור הצדדי לקיר הרקטלי. לחץ על ההדק ומלא את הכלי באופן מיידי.</li>
	<li>השתמש בכלי ביופסיה כדי לקבל 4 שאיבה ביופסיות עם קוטר של 2 מ"מ ב 3 ס"מ ו 6 ס מ מעל קו השיניים, בהמתנה ופוסטיות. השתמש במחט כדי לשים את הדגימה. על גזה הלחלח בתמיסת מלח</li>
	<li>שימו לב למטופל עד השעה 14:00 לאחר ההליך לשלול דימום רקטלי. הימנע מניפולציות רקטאליים ואנאלי יותר ב -24 שעות הראשונות לאחר RSB.</li>
</ol>2. הכנת מקטעי RSB
<ol><li>מניחים את ביופסיות היניקה פי הטבעת ב 4% פאראפורמלדהיד עבור 6 h כדי לתקן את הרקמה. השתמש בכרך הקבע 5 פעמים יותר מנפח הרקמה.</li>
	<li>מייבשים את הרקמה בעזרת מייבש. הרקמות הפתולוגי במשך 11 שעות התהליך המתוכנת כולו מורכב מ -5 השלבים הבאים:<ol>
<li>מניחים את רקמת פורמלדהיד ולתקן עבור 1 h.</li>
		<li>הניחו את הרקמה ב-75% אתנול במשך 4 שעות.</li>
		<li>מניחים את הרקמה באתנול מוחלט (שני שינויים, 1 h כל אחד).</li>
		<li>מניחים את הרקמה באתנול מוחלט (שני שינויים, 30 דקות כל אחד).</li>
		<li>מניחים את הרקמה ב קסילן (שלושה שינויים, 1 h כל אחד).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מניחים את הרקמה בשעווה פרפין (58-60 ° c) (שלושה שינויים, 1 h כל אחד). להטביע את רקמות RSB בגושי פרפין.</li>
	<li>לקצץ את גושי פרפין באמצעות מיקרוטומה עד הרקמה חשופה לחלוטין עם מטוס בסעיף שלם.</li>
	<li>חותכים את גושי לתוך 0.4 יקרומטר סעיפים עם מיקרוטומה.</li>
	<li>מניחים את הסעיפים לתוך 45-50 מעלות צלזיוס במשך כמה שניות כדי לאפשר לקטעים להתפשט לתוך צלחת שטוחה.</li>
	<li>העבר את מקטעי הפרפין אל שקופיות.</li>
	<li>אופים את השקופיות בתנור של 60 ° c עבור 3-5 h. הימנע אפייה במשך זמן רב מדי, אשר עשוי להוביל לאובדן של אנטיגנים.</li>
	<li>מניחים את השקופיות היחידות לתוך קסילן (2 שינויים, 15 דקות כל אחד).</li>
	<li>מימה את השקופיות באתנול מוחלט, 95%, 80%, ו 75% אתנול עבור 5 דקות כל אחד. ואז, לשטוף אותם אוסמוזה הפוכה (RO)-מים מטוהרים לעוד 5 דקות.</li>
</ol>3. שליפת אנטיגן
<ol><li>להפוך את העבודה לדילול עבור calretinin אחזור על ידי ערבוב 4 מ ל של מאגר האחזור אנטיגן EDTA עם 200 mL של מים RO-מטוהרים. הפוך את העבודה לדילול עבור S100 ו PGP 9.5 אחזור על ידי ערבוב 1 מ ל של חומצת לימון מאגר ציטראט של נתרן (100x) עם 99 mL של מים RO-מטוהרים. הערה: ניתן לאחזר את Calretinin באמצעות פתרון האחזור EDTA. עם זאת, חומצת המלח נתרן ציטראט מאגר מתאים יותר לשליפה של S100 ו PGP 9.5.</li>
	<li>הצב את השקופיות בצנצנת המכתימה של הcoplin. ממלאים את הצנצנת בתמיסת האחזור ומניחים אותו לאמבט מים רותחים מחומם. לאחר הרתיחה של 20 דקות, להסיר את הצנצנת מאמבט מים ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר. תהליך הקירור נמשך כ-10 דקות. הסר את השקופיות ושטוף אותם בעדינות פעם אחת עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS).</li>
	<li>ציירו עיגול עם עט סמן סביב הרקמה והכינו קופסה רטובה להליכים הבאים.</li>
</ol>4. חסימות
<ol><li>הפוך את העבודה לדילול על ידי ערבוב 3 מ ל של 30% H2O2 עם 27 מ ל של המים RO-מטוהרים.</li>
	<li>הוסף שתיים או שלוש טיפות של 3% H2O 2 הפתרון dropwise על הרקמה כדי לחסום את הפרמוקסיתמרים. הוסף את הפתרון H2O2 בהקדם כדי לוודא שהפתרון לא גולש מהמעגל. לבצע חסימה של הפרמוקסיתמרים בחממה 37 ° c עבור 20 דקות.</li>
	<li>שטפו את השקופיות בעדינות עם ה-PBS (שלוש שטיפות, 5 דקות כל אחת).</li>
	<li>לחסום את השקופיות עבור 20 דקות ב 37 ° צ' עם 5% בסרום שור (BSA, שהוכנו על ידי ערבוב 1.5 g של אבקת BSA עם 30 מ ל של מים RO-מטוהרים). הערה: חסימת עם 3% H2O 2 יכול למנוע 95% של כתמים לא ספציפיים חסימה עם 5% bsa יכול למנוע את 5% אחרים של כתמים לא ספציפיים. שלב את שתי השיטות כדי לקבל תוצאה אמינה.</li>
</ol>5. אנטיגן-התגובה הנוגדן
<ol><li>הסר את 5% BSA ולהוסיף 50 μL של הנוגדן העיקרי (calretinin, S100, או PGP 9.5) לשקופית. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.</li>
	<li>שטוף את השקופית עם PBS (שלוש פעמים, 3 דקות לכל אחד).</li>
	<li>הוסף 50 μL של פולימר משפר (מגיב A; ראה טבלה של חומרים) לסעיף ו מודקות אותו 20 דקות בחממה 37 ° c. לאחר מכן, שטוף את השקופית עם ה-PBS (שלוש פעמים, 3 דקות לכל אחד).</li>
	<li>הוסף 50 μL של נוגדן משני B (עז אנטי ארנב/עכבר IgG נוגדן משני) לסעיף ו דגירה עבור 30 דקות בחממה 37 ° c. שטוף את הקטע עם PBS (שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד).</li>
</ol>6.3, 3-diaminobenzidine ו המטאוקסילין כתמים
<ol><li>להוסיף 850 μL של המים RO-מטוהרים ל שפופרת 1.5 mL ולהוסיף את ריאגנטים מכתים (לראות את הטבלה של חומרים) בסדר a, B, ו-C. Add 50 μl של כל מגיב כדי לקבל סכום כולל של 1 מ"ל של 3, 3-diaminobenzidine (בתוך) פתרון העבודה. אם יש מאיצים, השתמש בפתרון לאחר סינון.</li>
	<li>הוסף טיפה של הפתרון לעבוד לחלק את הרקמה ואת הכתם עבור 3-10 דקות. מודקות את השקופיות בטמפרטורת החדר עד שמתגלה כתמים חומים. הצג בזהירות על ידי שימוש במיקרוסקופ שדה ברייטאני. השאר את הפתרון העובד בקלות הרחק מהאור. לאחר מכן, שטוף את השקופית עם ה-PBS למשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסיפו טיפה של המטאוקסילין כדי להכתים את הגרעינים במשך כ-1 דקות. ואז, להחזיק את הצנצנת הcoplin ולשטוף אותו תחת זרזיף של מים עבור כ 30-40 s עד עודף הצבע מוסר. להיזהר לא לפגוע בסעיפים הרקמה.</li>
	<li>לטבול את שקופיות RSB בצנצנת coplin המכילה PBS עבור 25-30 s. ואז, להבדיל ב 1% חומצה הידרוכלורית-אתנול עבור 10 ס. לשטוף את השקופיות עם PBS עבור 1 דקות.</li>
	<li>מייבשים את השקופיות בסדר הפוך של לחות: 75%, 80%, 95%, ו אתנול מוחלט (5 דקות כל אחד).</li>
	<li>לחשוף את השקופיות כדי קסילן (2 שינויים, 5 דקות כל אחד).</li>
	<li>הר את הכיסויים באמצעות הרכבה ultraclean. אפשר לשקופיות להתייבש לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופ.</li>
</ol>

<ol><li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung%27s+disease%3A+A+bridge+for+science+and+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung%27s+disease%3A+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).</li>
<li>Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+hematoxylin+and+eosin+staining+in+patients+with+suspected+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Surgery%22%5BJournal%5D)">The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease.</a> BMC Surgery. 17 (1), 71(2017).</li>
<li>Agrawal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+histochemistry+%28AChE%29+-+A+helpful+technique+in+the+diagnosis+and+in+aiding+the+operative+procedures+of+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease.</a> Diagnostic Pathology. 10 (1), 208(2015).</li>
<li>Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry+in+Hirschsprung%27s+disease%3A+An+adjunct+to+formalin-based+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Turkish+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis.</a> The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+and+protein+gene+product+9.5+immunostaining+of+rectal+suction+biopsies+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease.</a> American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159(2016).</li>
<li>Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+procedures+update+on+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+%26+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Laboratory procedures update on Hirschsprung disease.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598(2015).</li>
<li>Meier-Ruge, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+activity+in+suction+biopsies+of+the+rectum+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).</li>
<li>Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+calretinin+expression+indicates+aganglionosis+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease.</a> Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).</li>
<li>Kapur, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Stop+Looking%3F+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry%3A+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li>
<li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li>
<li>Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+submucosal+nerve+trunk+caliber+in+aganglionosis%3A+a+%26%2334%3Bpositive%26%2334%3B+and+objective+finding+in+suction+biopsies+and+segmental+resections+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a &#34;positive&#34; and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55(1992).</li>
<li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303(2011).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן תיארנו הליך באמצעות שלושה נוגדנים אימונוהיסטוכימיה שונים כדי להכתים סעיפים RBS לאבחון של HD. הרגישות של פרוטוקול האבחון שלנו היה 96.49% (95% CI, 0.88-0.99), והספציפיות היתה 100% (95% CI, 0.97-1.00).
הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם התגובה RSB ונוגדן אנטיגן. גודל הביופסיה קובע את הדיוק של ההכתמים. ביופסיה קטנה לא תספק מספיק רקמות כדי לבצע אבחנה מדויקת, בעוד ביופסיה גדולה מובילה לסיכון גבוה יותר של דימום. כעניין של ניסיון, ביופסיות עם קוטר של 2 מ"מ הם הגודל האופטימלי. עבור התגובה אנטיגן...

מחלת הירשפרונג (HD) היא הפרעת מעיים שכיחה בבטן מולדת המאופיינת בהעדר תאים גנגליון בחלקים שונים של מערכת העיכול1. מערכת העצבים האנושית נוצר כאשר הפלישה של התאים העצביים העובריים הושלמה. אם יש הפרעה של התהליך ואת הפלישה נכשל להשלים, המעי המרוחק של היילוד הופך aganglionic2. המצב הקטלני הזה נקרא מחלת הירשפרונג. התפשטות, תנועתיות וגידול במעיים הם שלושת המרכיבים העיקריים של הקולוניזציה המוצלחת.
המטאוקסילין מסורתית ו אאוזין (H & E) כתמים של ביופסיה מוגבלת submucosal לא יכול להגיע כגורם משביע רצון של התוצאה כמו H & E כתמים של רקמה בעובי מלא שהתקבלו מהניתוח. בנוסף, אצטילכולין אסטראז (כאב) כתמים של רקמת שאיבה רקטלית הוא מאתגר תיאורטית בשל הרגישות שלה מספיק, שהוא 91%, ועיבוד מורכב של סעיפים קפואים3,4. מספר סמנים אימונוהיסטוכימיה אחרים של תאים גנגליון וסיבי עצב שניתן לוכתם ב-formalin קבוע ו פרפין מוטבע דגימות בהדרגה להפוך את האבחון המיינסטרים HD. Calretinin הוא ויטמין D תלויי-חלבון מחייב סידן שאינו מתבטא במיקלעת myenteric ו submucosal של מקטעים מושפעים HD5. חלבון S100 מתבטא בתאים הנגזרים מהרכס העצבי, כגון סיבי עצב ותאי גליה, אשר לעתים קרובות מציגים היפרפרס עצביים ברקמת המשנה של מקטעים מושפעים של HD6. גן חלבון מוצר 9.5 (PGP 9.5) כתמים באופן אמין סיבי עצב ו גנגליון תאים; PGP 9.5 כתמים מעשים כתוספת calretinin כתמים, במיוחד במקרים של היפוגנגלארי מבודדים. מכתים כפול עם S100 ו PGP 9.5 יכול להקטין את שיעור שלילי שלילית ולהגדיל את הרגישות. כתנאי מוקדם, המחקר הנוכחי שואפת להבטיח ספציפיות הולם רגישות גבוהה של שיטה זו אבחון הרומן. הפרוטוקול הרומן שלנו השתמש בכל שלושת הסמנים לאפליה של aganglionic מעי וסיבי עצב יפרטרופית. מחקר פוטנציאלי של 318 ילדים בוצע על ידי המעבדה שלנו ופורסם בעבר ללא פרוטוקול מפורט7. הפרוטוקול המפורט ואמצעי הזהירות נדונים במאמר זה. כל neonates שסבלו מבעיית הצואה חמור מאז הלידה או הילדים עם עצירות כרונית למעט מחלות נפוצות אחרות הם מועמדים פוטנציאליים ביופסיה שאיבה רקטלית (RSB). הפרוטוקול הרומן שלנו מתאים לצביעת לא רק RSBs אלא גם ביופסיות בעובי מלא או דגימות כירורגי כדי לבצע אבחנה סופית.

<table><tbody><tr><td>נוגדן קלרטינין</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MAB-0716 170416405c</td><td>נוגדן: נוגדן</td></tr><tr><td>ראשוני S-100 נוגדן</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>Kit-0007</td><td>נוגדן: נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>PGP9.5 נוגדן</td><td>שנחאי לונג איילנד נוגדן בע"מ</td><td>R-0457-03</td><td>נוגדן:</td></tr><tr><td>מגיב משפר נוגדנים</td> ראשוני <td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-A 170416405a</td><td>נוגדן: נוגדן משני A</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב/עכבר IgG נוגדן משני</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-B</td><td>נוגדן: נוגדן משני B</td></tr><tr><td>ערכת צביעה DAB (המכילה מגיב A B ו-C)</td> <td>MXB Biotechnologies</td><td>DAB-0031</td><td>ערכת צביעה</td></tr><tr><td>חממת חום</td><td>שנחאי yiheng מכשיר ושות 'בע"מ</td><td>DHP-9082</td><td>מכשיר</td></tr><tr><td>Rbi2 יניקה ביופסיה רקטלית מערכת</td><td>Aus Systems Pty Ltd, דרום אוסטרליה, אוסטרליה</td><td>CP1200 HP1000 SS1000</td><td>מכשיר</td></tr><tr><td>מיקרוטום</td><td>Leica</td><td>leica RM2016</td><td>מכשיר</td></tr><tr><td>חומצת לימון נתרן ציטראט מאגר (100X)</td> <td>MXB Biotechnologies</td><td>MVS-0101</td><td>אנטיגן אחזור</td></tr><tr><td>מאגר רקמות פתולוגי מייבש</td><td>ווהאן ג'ונג'י אלקטרונית ושות' בע"מ</td><td>JT-12F</td><td>מכשיר</td></tr></tbody></table>

האבחון של מחלת הירשפרונג על-ידי חיסוני שאיבה רקטלי ביופסיות עבור calretinin, s100 חלבון וחלבון מוצר גן 9.5

Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

מחלת הירשפרונג (HD) היא מחלת מעיים מולדת אשר מתבטאת קלינית כחוסר יכולת לעבור meconium בתינוקות או עצירות לטווח ארוך אצל ילדים. ביופסיה שאיבה רקטלית (RSB) כדי לקבוע את העדר של תאים גנגליון והיפרפרס עצביים הוא המבחן המדויק ביותר עבור האבחנה של HD כיום. המטאוקסילין המסורתי-אאוזין מכתים חסר רגישות וספציפיות. כתמים אצטילכולין אסטראז לא ניתן להשתמש באופן נרחב עקב התהליך המורכב שלה. הפרוטוקול הרומן שלנו של כתמים עבור calretinin, חלבון S100, וחלבון מוצר גן 9.5 (PGP 9.5), אשר אנו מתנהלים על RSBs, תצוגות רגישות גבוהה ושיעורי ספציפיות של 96.49% (95% מרווח ביטחון, 0.88-0.99) ו 100% (95% ביטחון מרווח, 0.97-1.00), בהתאמה. מקטעים מושפעים HD לעתים קרובות להציג כהעדר הביטוי של calretinin, S100 חלבון, ו PGP 9.5, אשר הם סמנים של היפרפרס עצבי ברקמת submucosal. פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההפעלה המפורט של שיטת אבחון חדשה זו.

בסך הכל, 318 חולים נרשמו במחקר שלנו. כל החולים עברו RSB, ואת הרקמות היו מוכתם calretinin, S100, ו PGP 9.5. האבחנה המבוססת על הפרוטוקול הרומן שלנו היה HD ב 97 מקרים, non-HD במקרים 213, וחשד HD ב 8 מקרים. בין 132 חולים כירורגי, 99 חולים אובחנו עם HD על ידי כתמים חיסוני של דגימות מלאות בעובי לאחר הניתוח. S100 ו PGP 9.5 צביעת הראו כי 92% ו 93% מהחולים 99, בהתאמה, היו מכנסי עצב היפרטרופיקים. 83 אחרים של החולים 186 עברו ביופסיות בעובי מלא והראו תאים גנגליון. סך של 103 חולים נרפא קלינית על ידי ט...

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העיבוד החיסוני שאיבה רקטלית ביופסיה עבור calretinin, S100 חלבון, חלבון מוצר גן 9.5. שיטת האבחון החדשנית של מחלת הירשפרונג מעדיפה רגישות ותעריפים מסוימים.

האבחון של מחלת הירשפרונג על-ידי חיסוני שאיבה רקטלי ביופסיות עבור Calretinin, S100 חלבון וחלבון מוצר גן 9.5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות באבחון מחלת הירשפרונג. השיטה והפונקציות של טכניקה זו, אם אתה עוקב אחר הפרוטוקול, מפגין רגישות גבוהה ואת שיעורי הספציפיות אשר מעבדים בו זמנית. הדגמת ההליך תהיה מייז'ינג פאנג, טכנאי מהמעבדה שלי.התחל על ידי תיקון ביופסיות יניקה רקטלית בחמש פעמים את נפח הרקמה ב 4% paraformaldehyde במשך שש שעות בטמפרטורת החדר. לייבש את הרקמות הקבועות במייבש רקמה פתולוגי במשך 11 שעות ולהטמיע את רקמות ביופסיה יניקה רקטלי מעובד בלוקים פרפין. חותכים את הבלוקים על microtome עד מישור קטע שלם של הרקמה נחשפת.לאחר מכן השתמש במיקרוטום כדי להשיג 0.4 מקטעי מיקרומטר של הרקמה המוטבעת. מניחים במים של 45 עד 50 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחלקים להתפשט לתוכנית שטוחה. מעבירים את החלקים השטוחים על מגלשות זכוכית ואופים אותם בתנור של 60 מעלות במשך שלוש עד חמש שעות.מניחים את השקופיות deparaffinized לתוך שני שינויים של 15 דקות של קצילן ואחריו הידרציה שלהם ברצף חמש דקות אתנול טבילות. לאחר מכן לשטוף את המגלשות במים מטוהרים אוסמוזה הפוכה במשך חמש דקות נוספות. לאחזור אנטיגן, מניחים את המגלשות בצנצנת מכתים קופלין של פתרון אחזור ומ מניחים את הצנצנת באמבטיה שחומם מראש של מים רותחים.לאחר 20 דקות, אפשר לצנצנת להתקרר לטמפרטורת החדר במשך כ -10 דקות ולשטוף בעדינות את השקופיות עם PBS. לאחר מכן השתמשו בסמן הידרופובי כדי להקיף כל קטע רקמה ולהמקם את השקופיות בקופסה רטובה. כדי לחסום את כל peroxidates, להוסיף שתיים או שלוש טיפות של 3% פתרון מי חמצן על כל רקמה ולמקום את השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות עם שלוש שטיפות PBS חמש דקות ואחריו חסימה עם אלבומין סרום 5% bovine במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השלך את אלבומין סרום השד העודף ותייג את התאים עם 50 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של עניין ב 4 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לשטוף את השקופיות עם שלוש דקות לשטוף PBS ולהוסיף 50 microliters של משפר פולימר לכל שקופית.לאחר 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים PBS ולהוסיף 50 microliters של נוגדן משני B לכל קטע רקמה. לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את החלקים עם שלוש שטיפות חמש דקות PBS ולהוסיף טיפה של פתרון עבודה DAB מוכן טרי לכל שקופית. כאשר הרמה המתאימה של כתמים חומים מזוהה על ידי מיקרוסקופיה קלה, לשטוף את השקופיות PBS במשך חמש דקות וכתם מונה הגרעינים עם טיפה אחת של hematoxylin במשך דקה אחת.הסר את הכתם העודף תחת טפטוף של מים במשך כ 30 עד 40 שניות ואחריו לשטוף 25 עד 30 השני PBS טרי. להבדיל את הרקמות 1% אתנול חומצה הידרוכלורית במשך 10 שניות ואחריו לשטוף PBS דקה אחת. ייבשו את השקופיות עם טבילות של חמש דקות בסדר ההפוך של הידרציה וחשפו את השקופיות לשני שינויים של חמש דקות של קצילן.לאחר מכן תן את החלקת המכסה באמצעות הרכבה נקייה במיוחד ואפשר לשקופיות להתייבש לפני ההדמיה שלהן במיקרוסקופ קל. במחקר מייצג זה של 318 חולי ביופסיה סעיף רקטלי, 99 חולים אובחנו בתחילה על ידי ביופסיה סעיף רקטלי. תאי גנגליון רבים המבטאים קלרטינין נצפו בביופסיות רקמות תקינות.עם זאת, לא זוהו תאי גנגליון בשום אזור של הרקמה ממקטעי המחלה של הירשפרונג. S-100 ו PGP9.5 immunostaining גילה גזעי עצבים היפרטרופיים בתת-מוזה של הרקמה המחלה עם כתמים פרטניים בלבד של כמה זרדים עצביים קטנים שנצפו במעי הפנימי בדרך כלל. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשים לב לפרטים כמו גודל ביופסיות יניקה רקטלי ועובי של חלקים.לאחר איחוי, טכניקה זו תסלול את הדרך למחקרים בתחום ניתוחי ילדים לתמיכה באבחון מחלת הירשפרונג.

diagnosis-hirschsprung-s-disease-immunostaining-rectal-suction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את ההערכה של קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית של רקמת המעי הגס של עכבר. בקטע רקמה מוכתמת, נוכחותם של מספר רב של תאים המגיבים למערכת החיסון ברקמה הפגועה מייצגת את חדירת תאי החיסון במהלך קוליטיס.

הערכה של קוליטיס הנגרמת על ידי כימיקלים באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי של קטעי רקמת המעי הגס

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית של חלבון S-100 בקטעי ביופסיה של יניקה רקטלית. חלקים שנאספו על ידי אנטיגן נחסמים ומטופלים בנוגדנים ראשוניים, ואחריהם נוגדנים משניים נגד S-100, סמן למחלת הירשפרונג. מצע כרומוגני מתווסף כדי לצבוע את התאים הממוקדים. הדגימות מיובשות ומורכבות לפני ההדמיה מתחת למיקרוסקופ.

צביעה אימונוהיסטוכימית של חלבון S-100 בקטעי ביופסיית יניקה רקטלית אנושית

מקור: Ear, P. H., et. al. הקמה ואפיון של ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק. הספרואידים מקובעים, חדירים ונחסמים ולאחר מכן מודגרים בנוגדנים ראשוניים ומשניים. צבע מתווסף לגרעיני צביעה לפני הרכבתם והדמתם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אפיון ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק באמצעות אימונופלואורסצנציה

אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.

Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric

מערכת העצבים המעי נוצרת על ידי תאי פסגה עצבית שמתרבים, נודדים ומתיישבים במעיים. תאי פסגה עצבית מתמיינים לנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ המוליך העצבי שלהם. פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח, קיבוע וצביעה חיסונית של מערכת העיכול העוברית של העכברים כדי להמחיש ביטוי נוירוטרנסמיטר של מערכת העצבים המעי.

Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים

אנו מדווחים על שיפורים משמעותיים במדידה הניתנת לשחזור של מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס לאחר חשיפה של עכברים לגורמים פוטנציאליים המזיקים ל-DNA.

כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

פרוטוקול זה מתאר את השיטה להקמת מודל חולדה של pouchitis. מודל השקית האיליאלית נוצר על ידי ביצוע ניתוח אנסטומוזה אנאלי (IPAA) באמצעות טכניקות מיקרוכירורגיות. לאחר הניתוח, החולדה טופלה ב-4% דקסטרן סולפט נתרן (DSS) במשך 4 ימים.

מודל חולדה של פאוצ'יטיס לאחר כריתת פרוקטוקולקטומיה ואנסטומוזה אנאלי של כיס איליאלי באמצעות דקסטרן סולפט נתרן

Aptamers הם ribo-/deoxyribo-oligonucleotides קצר נבחר על...

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

הפגנה של ייצור ושימוש אלקטרודה יניקה תאיים המשמשת למדידת אלקטרו הקלטות של מיתרי מכרסם השדרה...

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

כאן אנו מתארים את שיטת ישירות לדמיין היפוקסיה ברקמות microregional של קליפת המוח...

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

למד פרוטוקול חיסון לביופסיות שאיבה רקטליות לאבחון מחלת הירשפרונג. השיטה מאתרת תאי גנגליון באמצעות calretinin, S100 ו-PGP9.5 בתוצאות בעלות רגישות וספציפיות גבוהות.

האבחון של מחלת הירשפרונג על-ידי חיסוני שאיבה רקטלי ביופסיות עבור Calretinin, S100 חלבון וחלבון מוצר גן 9.5

גלה סרטונים נוספים