Name: Assaying עבור הפוליפוספאט אורגניים של חיידקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: למד שיטה מהירה ורגישה לכימות פוליפוספט אנאורגני בחיידקים שונים, כולל Gram-negative ו-Gram-positive. שיטה זו מפשטת את מדידת polyP בתגובות ללחץ תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי אוניברסיטת אלבמה-קרנות אתחול המחלקה למיקרוביולוגיה של ברמינגהאם NIH מענק R35GM124590 (MJG) ואת NIH מענק R01AI121364 (FW).

1. טיהור שמרים Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>להפוך את המתח ביטוי חלבון e. coli BL21(DE3)31 עם פלסמיד pScPPX26 על-ידי אלקטרופורציה32 או שינוי כימי33.</li>
	<li>לחסן 1 ליטר מרק lysogeny (LB) המכיל 100 מ ל µg-1 אמפיצילין בבקבוקון unbaffled 2 ל' עם מושבה בודדת של BL21(DE3) המכיל pScPPX2, דגירה בין לילה ב 37 ° C ללא רועדת ספיגת על 600 nm (600) של 0.3, כפי שנמדד בספקטרופוטומטר.</li>
	<li>להתחיל את התרבות רועד (180 סל ד), תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, אשר במהלכו התאים יגדלו A600 של 0.4 - 0.5.</li>
	<li>להוסיף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ריכוז סופי של 1 מ מ, נוספת 100 µg מ ל-1 אמפיצילין, ולאחר מכן תקופת דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-180 סל ד. הערה: פרוטוקול ביטוי זה מייצר כמות גדולה של ScPPX מסיסים. עם זאת, ביטוי ScPPX הוא מאוד סלחני, במגוון של פרוטוקולים ביטוי חלבון נפוצים אחרים השתמשו לטהר בהצלחה ScPPX.</li>
	<li>להעביר את התאים בקבוק 1 ליטר צנטריפוגה ולקצור אותם על ידי צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב 5000 g x-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע ולהעביר בגדר תא ל צינור חרוטי 50 מ. הערה: תא כדורי ניתן לאחסן באופן בלתי מוגבל ב- 80 ° c</li>
	<li>הפשרת בגדר על קרח, אז resuspend זה ב 9 מ של 50 מ מ HEPES, 0.5 M NaCl ו 5 מ מ imidazole (pH 8) עבור אמצעי אחסון סך של-10 מ"ל.</li>
	<li>להוסיף (ריכוזים הסופי) 1 מ ג מ ל-1 ליזוזים, 2 מ מ MgCl2ו- 50 יחידות מ ל-1 של endonuclease משפיל RNA ו- DNA (ראה טבלה של חומרים) דגירה במשך 30 דקות על קרח. הערה: ScPPX נקשר חומצות גרעין (נתונים לא מוצג), אז נוקלאז טיפול חיוני במהלך טיהור.</li>
	<li>באמצעות sonicator microtip (ראה טבלה של חומרים), lyse התאים על ידי 2 מחזורים של sonication על הקרח ב- 50% חשמל, הפועמים 5 s s על ו- 5, עם מנוחה 2 דקות בין מחזורי. הערה: השתמש הגנת השמיעה המתאים במהלך sonication. באופן דומה למקרה עם ביטוי, מגוון שיטות פירוק התא מקובלים לטיהור ScPPX.</li>
	<li>הסרת לכלוך לא מסיסים על ידי צריך שתוציאו את lysate למשך 20 דקות ב 20,000 g x-4 מעלות צלזיוס. לסנן את תגובת שיקוע וכתוצאה מכך (כ- 10 מ"ל) דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.8 אצטט תאית גודל הנקבוביות.</li>
	<li>טען את lysate על גבי טעונה ניקל mL 5 chelating עמודה (ראה טבלה של חומרים) באמצעות משאבה סחרור או מזרק גדול.</li>
	<li>יש לשטוף את העמודה עם 50 מ של 50 מ מ HEPES, 0.5 M NaCl, 5 מ מ imidazole (pH 8).</li>
	<li>יש לשטוף את העמודה עם 50 מ של 50 מ מ HEPES, 0.5 M NaCl, 20 מ מ imidazole (pH 8).</li>
	<li>Elute ScPPX עם 50 מ"מ HEPES, 0.5 M NaCl ו 0.5 M imidazole (pH 8), איסוף השברים 1-mL 15. מבחן אלה שברים • תנאי החלבונים תוכן עם ברדפורד assay חלבון, או34 (ראה טבלה של חומרים) ולהפעיל של ג'ל מרחביות-עמוד35 כדי לאשר שברים אשר מכילים ScPPX מטוהרים (משקל מולקולרי = 45 kDa).</li>
	<li>בריכה שברים המכיל ScPPX טהור ולהתאים את הריכוז של חלבון במאגר על mL 2 מ ג-1 עם 50 מ מ HEPES ו 0.5 M NaCl. ריכוז חלבון גבוה עלול לזרז בשלב הבא.</li>
	<li>להחליף את ScPPX מטוהרים לתוך מאגר אחסון (20 מ"מ טריס-HCl [pH 7.5], 50 מ מ. אשלגן כלורי, 10% [וי/v] גליצרול) על-ידי דיאליזה. למקם שברים ScPPX במאגר באורך אטום של 12,000-14,000 Da משקל מולקולרי דיאליזה הקיצוץ ממברנה אבובים (ראה טבלה של חומרים), להשעות ב- 1 ליטר של מאגר אחסון עם ערבוב רציף ב 4 ° C לפחות 4 h. חזור על שלב זה טריים מאגר אחסון עבור סכום כולל של שינויי מאגר 3.</li>
	<li>להעביר את חלבון מטוהרים, דיאליזה שפופרת צנטרפוגה או צינורות, צנטריפוגה כעשרים דקות ב 20,000 g x ב 4 ° C כדי להסיר כל אגרגטים קשי תמס. להעביר בזהירות את תגובת שיקוע צינור חרוטי נקי 15 מ"ל.</li>
	<li>התאם את ריכוז ScPPX מטוהרים כ 1 מ ג מ ל-1 עם מאגר אחסון, להוסיף 0.1% (w/v) אלבומין ללא פרוטאז שור (BSA; הריכוז הסופי), החנות עד 6 חודשים ב 4 º C. הערה: ScPPX מאבד יותר מ- 90% של פעילותה כשזה קפוא13.</li>
</ol>2. אקצור את דגימות לחילוץ הפוליפוספאט
<ol><li>לגדול חיידקים תחת התנאים של עניין לקביעת תוכן פוליפ. עבור פרוטוקול זה, לצמוח לקטובצילוס reuteri36 ללון ב- 37 מעלות צלזיוס בלי רועדת מפחד אנזים חטיפים אינדוקציה (מיי) בינוני37 בלי ציסטאין (מיי-C).</li>
	<li>הקציר מספיק תאים על ידי צנטריפוגה בצינור microcentrifuge 1.5 mL לסך 50 – 100 µg של חלבון תאית (ראה שלב 3 להלן). E. coli, זה 1 מ"ל של תרבות שלב יומן על A600 של 0.2 - 0.4. עבור ל' reuteri, זו 1 מ"ל של תרבות בין לילה. להתאים ככל הדרוש עבור מינים אחרים של ריבית.</li>
	<li>להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע של כדורי תא.</li>
	<li>Resuspend תא כדורי ב- µL 250 GITC מאגר פירוק (4 מ guanidine isothiocyanate, 50 מ מ טריס-HCl, pH 7) ואת lyse על ידי דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בחנות lysates ב-80 מעלות צלזיוס. הערה: להיות עקבי עם הזמן פירוק, מאז דגירה ממושכת בטמפרטורה גבוהה עלולה לגרום השפלה של פוליפ על ידי הידרוליזה38. ניתן לאחסן Lysates ללא הגבלה ב- 80 ° c התראה: Guanidine isothiocyanate מלח chaotropic צריכים להיות מטופלים עם כפפות ואני מסולק כפסולת מסוכנת.</li>
</ol>3. מדידה את תכולת חלבון תא Lysates
<ol><li>הכנת תקנים BSA המכיל 0, 0.1, 0.2 ו- 0.4 מ ג מ ל-1 של BSA במאגר פירוק GITC. הערה: חשוב להפוך את הסטנדרטים BSA GITC, מאז GITC משפיעה על התפתחות הצבע וזמינותו ברדפורד. ניתן לאחסן BSA סטנדרטים ללא הגבלת זמן ב-20 ° C.</li>
	<li>Aliquot µL 5 של המופשרים, מעורבב היטב תא lysates ושל סטנדרטים BSA כדי להפריד בארות בצלחת ברור 96-ובכן.</li>
	<li>להוסיף µL 195 של ברדפורד ריאגנט34 מכל קידוח ולמדוד את ספיגת-595 nm (595), קורא צלחת (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לחשב את כמות החלבונים היטב כל על ידי השוואה עיקול רגיל BSA, באמצעות נוסחה y = mx + b, שבו y הוא595, x הוא µg של BSA, m הוא השיפוע של העקומה רגיל, ו b החיתוך-y של העקומה סטנדרטי. הכפל את הערך שהתקבל ב- 0.05 כדי לקבוע את סה כ מ ג חלבון בכל מדגם.</li>
</ol>4. חילוץ הפוליפוספאט
<ol><li>להוסיף 250 µL של אתנול 95% כל מדגם GITC-lysed של מערבולת לערבב.</li>
	<li>החל את התערובת על סיליקה ממברנה ספין עמודה צנטריפוגה ב-30 s-16,100 x g.</li>
	<li>למחוק את הזרימה דרך, ואז מוסיפים 750 µL של 5 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 50 מ מ NaCl, 5 מ מ EDTA, 50% אתנול וביו -צנטריפוגה ב-30 s-16,100 x g.</li>
	<li>למחוק את זרימה דרך וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב 16,100 x g.</li>
	<li>למקם את העמודה צינור microfuge mL 1.5 נקי ולהוסיף 150 µL של 50 מ מ טריס-HCl (pH 8).</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ואז elute פוליפ על ידי צריך שתוציאו למשך 2 דקות ב 8000 g x. הערה: אם רצונך בכך, eluates ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס לפחות שבוע אחד.</li>
</ol>5. עיכול הפוליפוספאט
<ol><li>הכנת סטנדרטים המכיל 0, 5, 50 או 200 מיקרומטר אשלגן פוספט ב 50 מ מ טריס-HCl (pH 8). הערה: אשלגן פוספט תקנים ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>µL 100 aliquot של כל פוספט רגיל, של חילוץ פוליפ דגימות לתוך בארות נפרדים של צלחת ברור 96-ובכן.</li>
	<li>להכין מיקס מאסטר המכיל (לכל דגימה): 30 µL של 5 x ScPPX התגובה מאגר (100 מ מ טריס-HCl, 25 מ מ MgCl2, אצטט אמוניום 250 מ מ, pH 7.5)13, µL 19 של H2O ו- 1 µL של ScPPX מטוהרים (1 מ ג מ ל-1).</li>
	<li>להוסיף 50 µL של המיקס מאסטר כל טוב של צלחת 96-ובכן. תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C. הערה: אם רצונך בכך, הדגימות פוליפ מתעכל שניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.</li>
</ol>6. זיהוי פוספט חינם24
<ol><li>הכנת הבסיס לזיהוי פתרון על ידי המסת 0.185 גר' אנטימון אשלגן tartrate ב 200 מ של מים, להוסיף 150 מ ל N H 42אז4, ואז מוסיפה 1.49 גר' אמוניום heptamolybdate. מערבבים להמיס ולהביא ואז נפח סופי של 456 mL. לסנן את הפתרון להסיר חלקיקים ולאחסן מוגן מפני אור ב 4 ° C עד כחודש.</li>
	<li>להכין פתרון מניות של חומצה אסקורבית 1 מ'. חנות מוגן מפני אור ב 4 ° C עד כחודש.</li>
	<li>להכין מלאי עבודה טריים של זיהוי פתרון כל יום על ידי ערבוב 9.12 מ"ל של פתרון זיהוי הבסיס עם mL 0.88 של חומצה אסקורבית 1 מ'. לאפשר את הפתרון זיהוי לחזור לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של פתרון זיהוי כל דגימה של תקן בצלחת 96-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר למשך כ 2 דקות לאפשר פיתוח צבע.</li>
	<li>למדוד את ספיגת-882 nm בקורא צלחת לחשב ריכוז כל מדגם פוספט על ידי השוואה, אשלגן פוספט עיקול רגיל. התראה: הפתרון זיהוי מכיל מלחים רעילים וחומצות חזקות. יש ללבוש כפפות, להתייחס פתרון עודף כאל פסולת רעילה.</li>
</ol>7. חישוב תכנים סלולריים הפוליפוספאט
<ol><li>להמיר את ריכוזי פוספט שנקבע בשלב 6.5 כדי nanomoles של פוליפ-derived פוספט בכל תא כולו lysate לפי הנוסחה הבאה: פוליפ nmol = 1.5 x (מיקרומטר פוספט / 10) הערה: השיטה הרגילה המבוסס על עיקול בשלב 6 קובע את הריכוז של פוספט (ב מיקרומטר) בכל 100 µL פוליפ מדגם aliquoted בשלב 5.2. כדי להמיר את הריכוז מספר nmol, מחולק 100 µL ב- 106 כדי לתת נפח ב- L, להכפיל הריכוז (µmol L-1), ולאחר מכן מוכפל 1,000 (מספר nmol ב µmol). זה מפחית את חלוקת הריכוז על ידי 10. האחסון הכוללת תמצית מוכן בשלב 4 הוא 150 µL, ולכן יש צורך להכפיל את הערך המתקבל של 1.5 כדי לחשב את nmol של פוספט המצויים תמצית כל.</li>
	<li>לנרמל פוליפ הסלולר תוכן הכוללת חלבון תאית על ידי חלוקת nmol פוליפ על ידי החלבון הכולל מ"ג בכל מדגם שנקבע בשלב 3.4. פוליפ רמות באים לידי ביטוי במונחים של הריכוז של פוספט חינם פוליפ-derived בודדים. הערה: במקרים מסוימים, כמות פוליפ-derived פוספט הנוכח במדגם יפלו מחוץ לטווח ליניארי של העקומה סטנדרטי פוספט (שלב 6.5). אם הרמות של פוליפ גבוהה מאוד, eluate המכילים פוליפ עודף מ שלב 4.6 ניתן 1:10 מדולל או בטחונות, במקרה הצורך, ומדד ואז שוב כפי שמתואר שלבים 5 עד 7.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן מפשט ומאיץ כימות של פוליפ רמות חיידקים מגוונות, עם ערכה טיפוסית של דגימות 24 לוקח בערך 1.5 h לעבד באופן מלא. זה מאפשר מיון מהיר של דגימות וניתוח של ספריות מוטציה, מפשט את הניסויים קינטי מדידה ההצטברות של פוליפ לאורך זמן. הראו כי הפרוטוקול פועלת ביעילות על נציגי שלוש phyla שונים: פרוטאובקטריה, firmicutes, ו actinobacteria, אשר ידועים לשמצה שלהם גמיש, שקשה lyse קירות התא49.
זיהוי של פוליפ על ידי עיכול עם ScPPX ספציפי יותר ורגיש יותר מאשר זיהוי זריחה ע...

הפוליפוספאט אי-אורגנית (פוליפ) הוא ביופולימרים ליניארי של יחידות מקושרים phosphoanhydride פוספט המצויה בכל תחומי החיים-1,-2,-3. בחיידקים מגוונים, פוליפ הוא חיוני תגובת המתח, תנועתיות, ביופילמים, בקרה מחזור התא, עמידות לאנטיביוטיקה של התקפה אלימה4,5,6,7,8 ,9,10,11. מחקרים של פוליפ מטבוליזם של חיידקים לכן יש את הפוטנציאל להניב תובנות יסוד היכולת של החיידקים לגרום למחלות ולשגשג בסביבות מגוונות. עם זאת, במקרים רבים, השיטות הזמינות עבור לכימות פוליפ בתאי חיידקים הם גורם מגביל במחקרים אלה.
ישנן מספר שיטות בשימוש כיום כדי למדוד רמות פוליפ חומרים ביולוגיים. שיטות אלה כוללות בדרך כלל שני שלבים נפרדים: חילוץ פוליפ וכימות הפוליפ נוכח תמציות אלה. השיטה הנוכחית תקן הזהב, שפותחה עבור שמרים האפייה -ברו ועמיתיו12, תמציות פוליפ יחד עם ה-DNA ו- RNA באמצעות פנול, כלורופורם, ואחריו אתנול משקעים, טיפול עם deoxyribonuclease (DNase) ribonuclease (RNase), ואת מערכת העיכול של הפוליפ מטוהרים שנוצר עם cerevisiae ס משפיל-פוליפ אנזים exopolyphosphatase (ScPPX)13 תשואות פוספט חינם, אשר הוא אז לכמת באמצעות מלכיט מבוסס-ירוק ערכי צבע מוחלטים וזמינותו. ההליך זה מאוד כמותית אך עתירי עבודה, הגבלת מספר דוגמאות ניתן יהיה לעבד ניסוי יחיד, והוא אינו ממוטב עבור דגימות בקטריאליות. אחרים דיווחו על חילוץ פוליפ ממגוון רחב של תאים ורקמות חרוזים סיליקה ("glassmilk") או סיליקה ממברנה עמודות6,14,15,16,17, 18. שיטות אלה לא ביעילות לחלץ קצרות שרשרת פוליפ (פחות מ 60 יחידות פוספט)12,14,15, זה אמנם פחות לדאגה עבור חיידקים, אשר נחשבים בדרך כלל לסנתז בעיקר פוליפ ארוכי שרשרת3. שיטות בוגרים של פוליפ חילוץ באמצעות חומצות חזקות19,20 נמצאים בשימוש נרחב יותר, מאז פוליפ יציב תחת תנאים חומציים12.
יש גם מגוון רחב של שיטות דיווח פוליפ לכימות. בין הנפוצה ביותר היא 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), הפלורסנט יותר לרוב נעשה שימוש כדי להכתים את הדנ א. דאפי-פוליפ מתחמי maxima עירור, פליטת קרינה פלואורסצנטית שונה מאשר דאפי-DNA מתחמי21,22, אבל יש הפרעה ניכרת של רכיבים אחרים התאית, כולל ה-RNA, נוקלאוטידים ואינוזיטול פוספטים12,15,16,23, הפחתת רגישות של פוליפ מדידות שנעשו באמצעות שיטה זו של ירידה לפרטים. לחלופין, פוליפ, אדנוזין diphosphate (ADP) יכולים להיות מומרים אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות מטוהרים Escherichia coli פוליפ קינאז (ממ ק), וכתוצאה מכך מ- ATP לכמת באמצעות לוציפראז14,17 ,18. זה מאפשר הגילוי של כמויות קטנות מאוד של פוליפ, אך דורש שני צעדים התגובה אנזימטיות, luciferin והן ADP טהור, אשר ריאגנטים יקר. ScPPX במיוחד מעכל פוליפ לתוך פוספט חינם6,12,13,24, אשר ניתן לאתרם באמצעות שיטות פשוטות יותר, אבל ScPPX מעוכבת על ידי DNA ו- RNA12, המחייב DNase RNase וטיפול של פוליפ המכילים תמציות. ממ ק וגם ScPPX הם זמינים מסחרית, טיהור ממ ק מורכבות יחסית25,26.
פוליפ תא lysates או תמציות גם להיות visualized על ג'לים לזיהוי מאת דאפי שלילי מכתים27,28,29,30, שיטה לאפשר הערכה של אורך שרשרת, אך תפוקה נמוכה, לקוי כמותית.
כעת מדווחים על assay פוליפ מהיר, זול, תפוקה בינונית המאפשר כימות מהירה של פוליפ רמות מגוונת מיני החיידקים. שיטה זו מתחיל lysing תאים חיידקיים ב 95 ° C 4 מ- guanidine-isothiocyanate (GITC)-14 כדי להשבית phosphatases הסלולר, ואחריו סיליקה ממברנה טור החילוץ אופטימיזציה עבור עיבוד מהיר של דגימות מרובים. התמצית המתקבלת המכילות פוליפ מתעכלת ואז עם עודף גדול של ScPPX, ביטול הצורך DNase וטיפול RNase. אנו כוללים פרוטוקול לטיהור זיקה ניקל פשוטה של כמויות מ ג של ScPPX. לבסוף, פוליפ-derived פוספט חינם לכמתו פשוט, רגיש, המבוסס על חומצה אסקורבית assay ערכי צבע מוחלטים24 , מנורמל לחלבון סלולרי הכולל. שיטה זו מייעלת את המדידה של פוליפ תאים חיידקיים, נדגים את השימוש עם נציג מינים של חיידקים גראם שליליים, חיידקים גראם חיוביים mycobacteria.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד pScPPX2</td><td>Addgene</td><td>112877</td><td>זמין למוסדות אקדמיים ואחרים ללא מטרות רווח</td></tr><tr><td>מרק LB Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP1427-2</td><td>E. coli גידול בינוני</td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176025</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל &בטא;-D-1-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td></td></tr><tr><td>מאגר HEPES</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-400-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250500</td><td>להתאמת ה-pH של תמיסות חוצץ HEPES</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196500</td><td></td></tr><tr><td>lysozyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6070106</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Universal Nuclease</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88700</td><td>Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) הוא תחליף מקובל</td></tr><tr><td>דגם 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-120</td><td>שיטות אחרות לליזיס תאים (למשל French Press) יכולות להיות יעילות</td></tr><tr><td>גם 5 מ"ל HiTrap כלאטינג עמודת HP</td><td>GE Life Sciences</td><td>17040901</td><td>כל עמוד כרומטוגרפיה או שרף בעל זיקה ניקל ניתן להחליף</td></tr><tr><td>ניקל (II) סולפט הקסהידרט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AC415611000</td><td>לטעינת עמודת HiTrap</td></tr><tr><td>0.8 ומיקרו; מסנני מזרק אצטט תאית בגודל נקבוביות</td><td>m פישר סיינטיפיק</td><td>09-302-168</td><td></td></tr><tr><td>מגיב ברדפורד</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרום&nbsp; Spectra/Por 4 RC צינורות ממברנת דיאליזה 12,000 עד 14,000 Dalton MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667B</td><td>ממברנות דיאליזה אחרות עם MWCO < 30,000 Da צריך לעבוד גם</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>להתאמת ה-pH של תמיסות Tris-buffered</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>P217500</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2294</td><td></td></tr><tr><td>תערובת בינונית 10x MOPS</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td>E. coli גלוקוז בינוני גידול</td></tr><tr><td>פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>D161</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט חד-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים מיובשים</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי heptahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-50</td><td></td></tr><tr><td>מנגן גופרתי מונוהידראט</td><td>Fisher Scientific</td><td>M113-500</td><td></td></tr><tr><td>גואנידין איזותיוציאנט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP221-250</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (ללא פרוטאז)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>צלחות שקופות עם תחתית שטוחה 96 בארות</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M0812-100EA</td><td>כל צלחת שקופה של 96 בארות תעבוד</td></tr><tr><td>Tecan M1000 קורא צלחות אינסופי</td><td>Tecan, Inc.</td><td>לא ישים</td><td>כל קורא צלחות המסוגל למדוד ספיגה ב-595 ו-882 ננומטר יעבוד</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>עמודות ספין של קרום סיליקה</td><td>Epoch Life Science</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9580154</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>אנטימון אשלגן טרטרט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AAA1088922</td><td></td></tr><tr><td>4 N חומצה גופרתית (H<תת>2</תת>SO4)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>SA818-500</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום הפטמוליבדט</td><td>פישר Scientific</td><td>AAA1376630</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>פישר AC401471000</td><td></td><td></td> מדעי</tr></tbody></table>

assaying עבור הפוליפוספאט אורגניים של חיידקים

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

הפוליפוספאט אי-אורגנית (פוליפ) הוא פולימר הביולוגי נמצאו תאים בכל תחומי החיים, והוא נדרש עבור התקפה אלימה ותגובת דחק בחיידקים רבים. ישנם מגוון רחב של שיטות לכימות פוליפ בחומרים ביולוגיים, שרבים מהם הם עתירי עבודה או רגישות, הגבלת התועלת שלהם. אנו מציגים כאן שיטה יעילה על פוליפ כימות של חיידקים, באמצעות סיליקה ממברנה טור החילוץ אופטימיזציה עבור עיבוד מהיר של מספר דגימות, העיכול של פוליפ עם exopolyphosphatase ספציפיים פוליפ ScPPX זיהוי של פוספט חינם שנוצר עם רגיש מבוססי חומצה אסקורבית ערכי צבע מוחלטים וזמינותו. הליך זה היא פשוטה, זולה, מאפשרת כימות פוליפ אמין מגוונת מיני החיידקים. אנו מציגים כימות פוליפ מייצג חיידק גראם שליליים (Escherichia coli), חיידק גראם חיוביים חומצה לקטית (לקטובצילוס reuteri), המין mycobacterial (Mycobacterium smegmatis). אנו כוללים גם פרוטוקול פשוט לטיהור זיקה ניקל של כמויות מ ג של ScPPX, אשר אינה כיום זמינים מסחרית.

השלבים המפתח של הפרוטוקול נמצאים בדיאגרמה ובצורה פשוטה באיור1.
כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה עם חיידקים גראם שליליים, פראי-סוג e. coli MG165539 היה גדל לשלב יומן אמצע LB בינוני עשיר ב 37 ° C עם טלטול (200 סל ד), ואז לשטוף, מודגרות עבור h 2 נוספים ב באגירה morpholinopropanesulfonate (MOPS) מינימלי בינונית40 המכילה גלוקוז-1 4 g L ...

אנו מתארים שיטה פשוטה על כימות מהירה של אי-אורגנית הפוליפוספאט בחיידקים מגוונים, כולל זנים גראם שליליים, גראם חיובי ו- mycobacterial.

Assaying עבור הפוליפוספאט אורגניים של חיידקים

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

פוליפוספט אנאורגני הוא מרכיב מרכזי בתגובת מתח חיידקי. אבל שיטות ישנות יותר לחילוץ ומדידת polyP בחיידקים הן מורכבות ועתירי עבודה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות מהיר, רגיש וזול של רמות ה- polyP במגוון מינים חיידקיים שונים.ההליך יוכח על ידי אריה פוקרל, סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לגדל חיידקי לקטובצילוס reuteri במדיום אינדוקציה אנזימים מאליים ללא ציסטין ב 37 מעלות צלזיוס לילה בלי לרעוד. צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבות לילה זו בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר כדי לקצור מספיק תאים כדי להניב סך של 50 עד 100 מיקרוגרם של חלבון הסלולר.הסר את supernatant מן גלולת התא לחלוטין, ולאחר מכן להוסיף 250 microliters חיץ תזה GITC ו resuspend על ידי מערבולת. דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי ללטף את התאים. אחסן את הליסט ב-80 מעלות צלזיוס.תחילה, הכן תקני BSA המכילים אפס, 1, 2 ו- 4 מיליגרם למיליליטר של BSA במאגר תותבת GITC. Aliquot חמישה microliters של מופשר, lysates תא מעורב היטב וחמישה microliters של תקני BSA להפריד בארות בצלחת ברורה 96 באר. הוסף 195 מיקרוליטרים של ברדפורד reagent לכל באר ולמדוד ספיגה ב 595 ננומטרים קורא לוח.חשב את כמות החלבון בכל באר בהשוואה לעקומה הסטנדרטית של BSA כמתואר בכתב היד. כדי לקבוע את כמות החלבון הכוללת בכל דגימה, הכפל את הערך המתקבל ב- 05. כדי להתחיל מיצוי פוליפוספט, להוסיף 250 microliters של 95%אתנול לכל מדגם lysed GITC, ומערבולת לערבב.פיפטה תערובת זו לעמוד ספין קרום סיליקה ממוקם בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 16, 100 גרם במשך 30 שניות. השלך את הזרימה דרך ולהוסיף 750 microliters של טריס הידרוכלוריד, נתרן כלורי, EDTA, ותערובת אתנול.צנטריפוגה ב 16, 100 גרם במשך 30 שניות. השלך את הזרימה דרך צנטריפוגה עמוד ספין ב 16, 100 gs במשך שתי דקות. מניחים את העמוד בצינור מיקרופוג נקי של 1.5 מיליליטר.מוסיפים 150 מיקרוליטרים של 50 מילימולרים pH שמונה טריס-הידרוכלוריד, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. Elute polyP על ידי צנטריפוגה ב 8, 000 גרם במשך שתי דקות. התחל על ידי הכנת סטנדרטים המכילים אפס, חמש, 50, או 200 אשלגן מיקרומולארי פוספט ב 50 מילימולאר pH שמונה טריס הידרוכלוריד.Aliquot 100 microliters של כל תקן פוספט ו 100 microliters של דגימות polyP שחולצו לתוך בארות נפרדות של צלחת ברורה 96 באר. הכינו תערובת אב המכילה, לפי מדגם, 30 מיקרוליטרים של מאגר תגובה 5X ScPPX, 19 מיקרוליטר מים, ומיקרוליטר אחד של ScPPX מטוהר.ותגרה במשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. ביום הגילוי, הכינו מלאי עבודה טרי של פתרון איתור על ידי ערבוב של 9.12 מיליליטר של בסיס פתרון איתור עם 88 מיליליטר של חומצה אסקורבית טוחנת אחת, ואפשרו לה להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון זיהוי לכל מדגם ותקנים בצלחת 96 באר.כדי לאפשר התפתחות צבע, הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך כשתי דקות. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד ספיגה ב 882 ננומטר ולחשב את ריכוז הפוספט של כל מדגם בהשוואה לעקומה הסטנדרטית אשלגן פוספט. לאחר מכן להמיר את ריכוזי הפוספט ננומולים של פוליפ נגזר פוספט בכל מתא lysate ולנרמל תוכן polyP הסלולר לחלבון הסלולר הכולל, כמתואר בכתב היד.E.coli מסוג פראי, חיידק גרם שלילי, גדל LB מיוצר ללא פוליפ. אבל כאשר גדל ב- MOPS, מיוצר על 192 ננומולים polyP לכל מיליגרם של חלבון הכולל. מוטציה דלתא ppk E.coli, אשר חסר polyP קינאז, לא הפיק פוליפ באף אחד מהמדיום.מוטציית דלתא ppx, אשר חסר exopolyphosphatase, הפיק בערך את אותה כמות של polyP כמו סוג הבר. והמוטנט דלתא phoB, שהוא פגום בהובלת פוספט, הפיק באופן משמעותי פחות פוליפ מאשר סוג הבר. L.reuteri מסוג פראי, חיידק גרם חיובי גדל בן לילה במדיום MEIC צבר כ 51 ננומולים polyP למיליגרם של חלבון הכולל.מוטציה L.reuteri ppk1 null חסר קינאז polyP הכיל פחות ממחצית הסכום הזה. נוכחות זו של polyP במוטנט ppk1 null היא כנראה בשל L.reuteri המכיל קינאז polyP השני. Mycobacterium smegmatis זן SMR חמש, גדל במדיום Hartmans-de Bont בהיעדר אתנול צבר כ 141 ננומולים polyP למיליגרם של חלבון הכולל.בעוד טיפול אתנול הביא לעלייה משולשת. בעקבות הליך זה, אלקטרופורזה ג'ל אקרילאמיד יכול להתבצע כדי להעריך את ההבדלים באורך שרשרת polyP. בעת ניסיון הליך זה, הימנע מטעויות נפוצות.זכור להימנע מקבל בועות בארות צלחת microtiter, ולהיזהר להעביר את הדגימות שלך לצינור המתאים בעת מעבר מהעמודה לצינור microfuge. אל תשכח כי עבודה עם GITC וחומצות חזקות יכול להיות מסוכן, וציוד מגן הנכון תמיד צריך להיות משוחק בעת ביצוע הליך זה.

assaying-for-inorganic-polyphosphate-in-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מתאר שיטת תפוקה גבוהה של הידרוליזה אנזימטית אשר מנצל קורא microplate למדוד ולסווג זרחן אדמה כמו P monoesters, diesters P ו פ אורגניים עד 96 דגימות ניתן למדוד בו זמנית במעבדה סטנדרטית.

תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות

Pyrophosphates אינוסיטול לשחק תפקיד חשוב פתולוגיות אדם כגון סרטן, סוכרת, והשמנה, אך מנגנון הפעולה המדויק אינו עניין של מחלוקת. חוסר pyrophosphates אינוסיטול זמינים מסחרית הופכת מחקרים מפורטים בעייתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר ולבודד מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

מקור: Pokhrel, A., et al. בדיקת פוליפוספט אנאורגני בחיידקים. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים בדיקה קולורימטרית למדידת פוליפוספט אנאורגני (polyP) בדגימות חיידקים. ההליך כולל המרה אנזימטית של polyP לפוספט חופשי, אשר לאחר מכן מגיב עם מוליבדט וחומצה אסקורבית ליצירת קומפלקס בצבע כחול. על ידי השוואת הספיגה של קומפלקס זה לעקומה סטנדרטית של ריכוזי פוספט ידועים, ניתן לכמת במדויק את תכולת הפוליP בדגימות חיידקים.

בדיקה לכימות פוליפוספט אנאורגני בחיידקים

מקור: Vidilaseris, K., et al. הקרנה למעכבי פירופוספאטאז הקשורים לממברנה של Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקה קולורימטרית לסינון מעכבים של פירופוספאטאז הקשור לממברנה חיידקית (mPPase) על ידי כימות שחרור אורתופוספט. השיטה מאפשרת זיהוי תרכובות המעכבות mPPase מ-Thermotoga maritima, מטרה פוטנציאלית לתרופה אנטי-מיקרוביאלית.

סינון מעכבים של פירופוסטאז הקשור לממברנה חיידקית באמצעות בדיקה קולורימטרית 

מאמר זה מציג את הליך לחקור את ספיחה של phosphonates על גבי חומרי הסינון המכילים ברזל הידרוקסיד ferric פרטנית במיוחד, עם קצת מאמץ ואמינות גבוהה. בפתרון במאגר, פוספונאט הוא הביא במגע עם adsorbent באמצעות מסובב ולאחר מכן נותחו באמצעות שיטה נחישות זרחן ולמחקר.

אופטימיזציה הליך לקביעת ספיחה של Phosphonates על גבי הידרוקסיד Ferric פרטנית באמצעות שיטה נחישות זרחן מיניאטורי

כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור מתויג היסטידין pyrophosphokinase אנזימים וניצול כרומטוגרפיה שכבה דקה של סובסטרטים radiolabelled ומוצרים כדי assay עבור פעילות אנזימטי בתוך חוץ גופית. וזמינותו פעילות האנזים ישימה בהרחבה על כל קינאז, נוקלאוטיד cyclase או התגובה פוספור-העברת מנגנון אשר כולל נוקלאוטיד טריפוספט הידרוליזה.

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

כתב יד זה, הקמנו שיטה תפוקה גבוהה לכמת פעילות פוספטאז אלקליין בתרבות biofilm S. aureus באמצעות גלופה תרביות רקמה...

ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

התפתחותם של התרבויות החיידקי רדיויניום בצלחות microtiter מאפשר דגימת תפוקה גבוהה המאפשרת שכפול טכני וביולוגי מרובים מספר השפע של הבריכה נוקלאוטיד, כולל זה של (p) ppGpp. ההשפעות של מעברים צמיחה שעוררה מקורות של לחץ פיזיולוגי, כמו גם התאוששות מהלחץ ניתן לפקח.

באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה

כאן אנו מציגים שיטת ההקרנה עבור פירופוספאז ממברנה הממברנה (מתוך מעכבי התרמוטוגה) על בסיס מוליבדן תגובה כחולה בפורמט 96 צלחת היטב.

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

מתואר הליך לאלקטרופורזה נימית אלקטרופורזה ספקטרומטריית מסת יינון עבור הכמות המוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים מתמציות תאי יונקים.

כמות מוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים על ידי אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי ספקטרומטריית מסה יינון

למד שיטה מהירה ורגישה לכימות פוליפוספט אנאורגני בחיידקים שונים, כולל Gram-negative ו-Gram-positive. שיטה זו מפשטת את מדידת polyP בתגובות ללחץ תאי.

Assaying עבור הפוליפוספאט אורגניים של חיידקים

גלה סרטונים נוספים