חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה משתמש בכל התכונות העיקריות של AFM, שאינו נוח לטכניקות אחרות של מולקולה אחת. כתוצאה מכך, אנו מסוגלים לפתור מבנה של גרעין בקנה מידה ננו. חשוב לציין, הדמיה ישירה של נוקלאוזומים נעשתה בתנאים פיזיולוגיים.

באמצעות טכניקת AFM שלנו, חשפנו לאחרונה תכונות ייחודיות של גרעין centromere שיכול לשחק תפקיד על הפונקציה של centromere כולו. השיטה המוצגת מיושמת כיום במעבדה שלנו כדי לחקור הרכבה עצמית של חלבונים הקשורים להיווצרות אגרגטים עמילואיד. אגרגטים חלבון אלה לעורר את ההתפתחות של מחלות הרסניות כגון אלצהיימר ופרקינסון שם כמה.

שיטות ההכנה הפשוטות חלות גם על מתחמי חלבון-DNA אחרים, כולל מערכות גדולות כגון מכונות שכפול DNA. למרות שיש צורך בשינויים מסוימים. על מנת לאפיין חלקיקי גרעין ברמת המולקולה הבודדת באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי סטטי וזמן לשגות, להתחיל בטיהור, הרכבה ואימות של הנוקלאוזומים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לאחר מכן, הכינו את משטח הנציץ להדמיית AFM סטטית. כדי לעשות זאת, תחילה להכין פתרון מלאי APS חמישים מילימולר במים deionized. יש לאחסן מיליליטר אחד של פתרון זה בארבע מעלות צלזיוס, עד שיידרש.

מפתרון המלאי, הכינו פתרון APS עובד לשינוי נציץ על ידי המסת 50 מיקרוליטרים של מלאי APS 50 מיקרומולרים ב-15 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבבים את הפתרון ולאחר מכן למלא cuvette עם הפתרון. לאחר מכן, חותכים אחד על שלושה סנטימטרים רצועות של נציץ מסדינים נציץ באיכות גבוהה.

בדוק כי החתיכה מתאימה כאשר ממוקם באלכסון ב cuvette. לאחר מכן, לחשוף שכבות של נציץ עד שני הצדדים הם מחשוף טרי, ואת היצירה היא דקה כמו 0.1 מילימטר. מיד מניחים את חתיכת נציץ לתוך CUVETTE מלא APS ולה הדגירה נציץ במשך 30 דקות.

מעבירים את חתיכת הנציץ לקעקה מלאה במים מזוקקים ומשרים אותה במשך 30 שניות. לאחר מכן, השתמש בארגון כדי לייבש לחלוטין את שני הצדדים של רצועת נציץ APS. החל סרט דבק כפול פנים על כמה דיסקיות מגנטיות ולהמקם אותם בצד.

לאחר מכן, חותכים את מצע נציץ APS לס"מ אחד על ידי ריבועים של סנטימטר אחד, ומכסים אותם בצלחת פטרי נקייה. לאחר מכן, להכין שלושה דילולים של נוקלאוזומים התאספו באמצעות חיץ מסונן 0.22 מיקרון המכיל 10 קיפ מילימולר וארבעה מילימולר מגנזיום כלורי ב PH של 7.5. כדי להגביל את אובדן נוקלאוזומים, בריכוז הסופי הנמוך, הדילול צריך להיעשות אחד בכל פעם, מיד לפני התצהיר על נציץ APS.

להפקיד חמישה עד 10 microliters של כל דגימת גרעין במרכז חתיכת נציץ APS ולתת להם דגירה במשך שתי דקות. לאחר מכן, לשטוף בעדינות את המדגם עם שניים עד שלושה מיליליטר של מים מזוקקים deionized כדי להסיר את רכיבי החיץ. ולייבש את הדגימה שהופקדה תחת זרימת אור של ארגון.

כדי להתחיל, תן עצה על מחזיק הקצה של מערך AFM. לאחר מכן, לטעון את המדגם הראשון על שלב AFM, נזהר לא ליצור קשר עם פני השטח מדגם. מקם את הלייזר מעל cantilever עד הסכום שלה הוא לכל היותר ולהתאים את ערכי הסטה אנכית צדדית קרוב לאפס.

לאחר מכן, לכוון את החללית AFM כדי למצוא את התדר תהודה שלה, להתאים את משרעת הכונן, ולהגדיר את גודל התמונה ל 100 על ידי 100 ננומטר. לאחר הגדרתו, לחץ על לחצן המעורבות כדי להתחיל בגישה. כאשר הגישה הושלמה, בהדרגה לייעל את נקודת הגדרת משרעת עד פני השטח של המדגם נראה בבירור.

לאחר מכן, הגדל את גודל הסריקה למיקרון אחד במיקרון אחד ואת הרזולוציה ל- 512 על 512 פיקסלים. לבסוף, לחץ על לחצן הלכידה כדי להתחיל ברכישת תמונה. השתמש בדבק סורק מוט זכוכית כדי לחבר מוט זכוכית לשלב הסורק AFM.

אפשר לזה להתייבש לפחות 10 דקות. בינתיים, לעשות 0.1 מילימטר עבה חתיכות עגולות של נציץ עם קוטר 1.5 מילימטר על ידי אגרוף אותם מתוך גיליון נציץ גדול יותר. השתמש דבק מוט זכוכית AFM נציץ במהירות גבוהה כדי לחבר את חתיכת נציץ זה מוט זכוכית על AFM במהירות גבוהה, ולאפשר לו להישאר ללא פגע במשך מינימום של 10 דקות בזמן שהוא מתייבש.

לאחר מכן, לחשוף שכבות מן הנציצה באמצעות סרט רגיש ללחץ עד שכבה מחשוף היטב נראה על הקלטת. לאחר מכן, לדלל microliter אחד של 50 מילימולר מניית APS ב 99 microliters של מים מזוקקים deionized כדי להפוך את פתרון APS מיקרומולר 500. הפקידו 2.5 מיקרוליטרים של הפתרון על משטח הנציץ הטרי ותנו לפני השטח לתפקד במשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, לשטוף את נציץ מספר פעמים עם מים מזוקקים deionized על ידי החלת שלוש שטיפות microliters. הסר את המים לחלוטין בעקבות כל שטיפה על ידי הנחת לנגב לא ארוג בקצה הנציץ. לאחר שטיפה סופית, מניחים שלושה microliters של מים מזוקקים deionized על פני השטח, ולתת לו לשבת לפחות חמש דקות כדי להסיר כל APS שאינו קשור במיוחד.

לאחר מכן, מניחים את החללית במחזיק AFM במהירות גבוהה, וממקם את המחזיק על הבמה AFM עם הקצה פונה כלפי מעלה. לשטוף את המחזיק באמצעות 100 microliters של מים מזוקקים deionized, ואחריו שתי 100 שטיפות microliter של 0.22 מיקרון מסונן חיץ הדמיה גרעינים. עם שטיפות נעשה, למלא את התא עם 100 microliters של מאגר הדמיה נוקלאואז, שקוע את הקצה.

כוונן את המיקום cantilever עד שהוא נפגע עם הלייזר. לאחר מכן, לשטוף את נציץ APS חמש פעמים עם מאגר הדמיה נוקלאוזום מסונן, באמצעות ארבעה microliters לכל שטיפה. לדלל מיקרוליטר אחד של מלאי הרכבה נוקלאואז לתוך 250 microliters של מאגר הדמיה נוקליאום מסונן עבור ריכוז גרעין סופי של ננו-מולר אחד.

הפקד 2.5 microliters של דילול זה על פני השטח ולתת לו לשבת במשך שתי דקות. יש לשטוף את פני השטח פעמיים בארבעה מיקרוליטרים של חיץ הדמיה גרעיני כדי להימנע מצפיפות יתר. לאחר שטיפה הסופית, להשאיר את פני השטח מכוסים במאגר הדמיה.

הגדר את הסורק והדגימה מעל מחזיק הקצה כך שהדגימה תעמוד עם הפנים כלפי מטה. כדי להתחיל את הגישה, השתמש בפונקציית הגישה האוטומטית עם משרעת נקודתית קרובה משרעת תנודות חינם. התאם את נקודת הסט עד למעקב אחר פני השטח.

לאחר מכן, הגדר את אזור התמונה סביב 150 על ידי 150 ננומטר ל 200 על ידי 200 ננומטר עם קצב רכישת נתונים של סביב 300 אלפיות שנייה לכל מסגרת הדמיה. כפקד להרכבה ותצהיר, מונונוקלאומים H3 הוכנו ודמיין באמצעות AFM סטטי. תמונה זו מספקת תמונת מצב של אוכלוסיית הגרעין כפי שהייתה קיימת רגעים לפני התצהיר המאשר כי nucelosomes הורכבו בהצלחה.

עם הרכבת הבקרה H3 הצלחה, השיטות שהוצגו יושם הבא על המחקר של נוקלאוזומים CENP-A. הדמיית AFM סטטית של מדגם זה חשפה שהרכבתה הייתה הצלחה. מתוך תמונות AFM סטטיות, ניתן לאפיין את הגובה והתהפכות של מונונוקלאוזומים.

הן הזווית בין זרועות הדנ"א החופשיות והן אורך זרועות הדנ"א החופשיות משמשות לקביעת מספר פניות הדנ"א בגרעין הבודד. לעומת זאת, דימות AFM לשגות זמן של נוקלאוזומים ניתן להשתמש כדי לדמיין את ההתנהגות הכוללת ספונטנית unwrapping של נוקלאוזומים. ככל שמספר התור של הנוקלאומוזום פוחת, נצפית גם ירידה מקבילה בנפח הליבה של הגרעין.

בנוסף להדמיה לשגות זמן רגילה, ניתן להשתמש במהירות גבוהה לשגות AFM כדי לחקור את הדינמיקה נוקליאום מורכב יותר כי הוא החמיץ באמצעות הדמיה זמן לשגות זמן סטנדרטי. היכולת של טכניקה זו ללכוד את הדינמיקה על פני תקופה ארוכה של זמן היה חיוני להדמיה של טרנסלוקציה למרחקים ארוכים של ליבת גרעין CENP-A, אשר נתפס במהלך 1200 מסגרות. טכניקה זו הייתה גם קריטית בלכידת ההעברה הנדירה של ליבת גרעין CENP-A ממצע דנ"א אחד לאחר.

קצב לכידת התמונה המהיר הפך את ההדמיה של אירוע דינמי זה לאפשרית מכיוון שנדרשו רק מספר מסגרות להשלמתו. בתחום הכרומטין הרחב יש קבוצה של שאלות חשובות הנוגעות לתפקידי היסטונים של ליגר והגדלת היסטון של דינמיקת הכרומטין. כל השאלות האלה ניתן לענות באמצעות הטכניקה שלנו.