מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

באמצעות התשנים המוצגים כאן, ניתן להעריך את ההבדל בפנוטיפ בין זנים rotavirus, שבו זנים ייחודיים מבודדים. באופן ספציפי, השינוי הפנוטיפי של זנים עמידים לחיטוי של rotavirus נחקר. כדי להשיג תפוקות כמותיות ברורות באמצעות מראי פלאק, זה קריטי כדי לבחור שילוב מתאים של זן rotavirus וסרום, שבו rotavirus מותאם היטב לסרום.

הדגמת ההליך תהיה סון-סוקה קדויה, דוקטורנט מהמעבדה שלי. הסר CryoTube המכיל קווי תא MA104 ממיכל החנקן הנוזלי. מניחים את CryoTube באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפשיר את התאים.

הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה התא ל 20 מיליליטר של המדיום המכיל סרום בבקבוק T75. חגר את הבקבוק באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס וב-5%CO2 למשך יומיים-שלושה. ברגע שהמונוליאר של התא מגיע ל-80%, הסר את העל-טבעי ושטף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS של 1X Dulbecco.

מוסיפים ארבעה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוקון, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לנתק את התאים מן הבקבוק. מעבירים את ההשעיה התאית לצינור 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 190 גרם במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים המהודרים במיליליטר אחד של מדיום המכיל סרום.

לאחר מכן לדלל את התאים המתווים 100-פי עם המדיום. הוסף שלושה מיליליטר של ההשעיה התא מדולל לכל באר של צלחת שש באר עבור המראה פלאק. הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה התא מדולל לכל באר של צלחת 24 באר עבור הראיה מחייב התא.

אין לאחסן את הצלחות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס וב-5%CO2 אדים לא רוויים למשך יומיים או שלושה. מעבירים צינור המכיל מיליליטר אחד של מתלי הנגיף במדיום נטול סרום מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להפשרה. הוסף מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר של טריפסין מן הלבלב פורצ'ין למיליליטר אחד של ההשעיה וירוס ולאחר מכן מערבולת.

דגירה ההשעיה וירוס ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 אדים בלתי רוויים במשך 30 דקות. לדלל את ההשעיה וירוס פעיל עם מדיום ללא סרום כדי להתאים את ריבוי הזיהום, או MOI, ל 0.1 pfu לכל תא. הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה וירוס מדולל לתאי MA104 בבקבוק T75 שלושה ימים לאחר ציפוי התא.

דגירה התאים עם וירוס ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, בעדינות לנער את הבקבוק כל 15 דקות. לאחר מכן הוסיפו 30 מיליליטר של מדיום נטול סרום המכיל ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של טריפסין מלבלב החזירי לבקבוקון. הדגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 אדים רוויים.

לאסוף מיליליטר אחד של supernatant בבקבוקון באפס, שש, 12, 18, 24, ו 36 שעות לאחר זיהום, ולהחליף את supernatant בסוגים 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה. לנהל מחזור הפשרה בהקפאה בתוך 15 דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס ואחריו להמיס 15 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. ואז צנטריפוגה הצינורות ב 12, 600 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאסוף את העל-טבעי. סנן את העל-טבעי באמצעות מסנן 0.2 מיקרון מזוקק כדי להסיר את שבר התא. יש לאחסן את העל-טבעי במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להחלתו על המוצנת פלאק למדידת טיטר הנגיף.

כאשר מוכנים לבצע את בדיקת הפלאק, מניחים את הצינורות המכילים את העל-טבעי שנאסף באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס. מוסיפים טריפסין למיליליטר אחד של דגימה מדוללת פי 10, ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך הדגירה הזו של 30 דקות, שטפו בזהירות את תאי ה-MA104 בצלחת של שש בארות עם שני מיליליטר של 1X PBS לאחר הסרת המדיום המכיל סרום.

מדללים באופן סדרתי את הדגימות המודגרות במדיום נטול סרום ומחסן מיליליטר אחד של המדגם המדולל לתוך כל באר. דוגרים את הצלחת במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 אדים רוויים, בעדינות לנער את הצלחת כל 15 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את inoculum מהצלחת שש באר.

הוסף ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של טריפסין למדיום המוכן. בעדינות אך מיד להוסיף שלושה מיליליטר של המדיום מעורבב עם ג'ל אגרוז לכל באר. אפשרו לג'ל אגרוז להתגבש בטמפרטורת החדר במשך יותר מ-10 דקות.

לאחר מכן הדגירה את הצלחת במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 אדים רוויים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 0.015%פתרון אדום ניטרלי מדולל עם PBS 1X לכל באר, ודגירה עם אותם תנאים. מוציאים את הצבע לאחר שלוש שעות וממשיכים להתהגר במשך יום אחד.

למחרת, לספור את מספר הלוחות בכל באר ולחשב את pfu למיליליטר. בדוק בזהירות את התכנסות התא לפני בדיקת הפלאק כדי להבטיח את מספרי הפלאק. לצורך בדיקה מחייבת תאים, יש להוסיף מיקרוגרם אחד למיקרוליטר של טריפסין מלבלב פורצ'ין למיליליטר אחד של ההשעיה של הנגיף, ולאחר מכן מערבולת.

לדלל את ההשעיה וירוס עם מדיום ללא סרום כדי להתאים את MOI ל pfu אחד לכל תא. לשטוף את תאי MA104 פעמיים בצלחת 24 באר עם מיליליטר אחד של מלוחים טריס-buffered. עכשיו לחסן את התאים עם 100 microliters של השעיית וירוס מדולל לתוך כל באר של צלחת 24 באר.

דגירה הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות עם טלטול עדין כל 15 דקות. הסר את אינוקולום הנגיף, ולשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של מלוחים טריס-buffered. כדי לחלץ את ה-RNA התקוע הכפול של הרוטבירוס, הוסיפו 140 מיקרוליטרים של 1X PBS ו-560 מיקרוליטרים של מאגר החילוץ של ה-RNA לכל באר.

מערבבים כראוי עם פיפטה עד אובך של תאים במאגר לא נראה. לאחר שחזור RNA כפול תקוע, על פי פרוטוקול היצרן, למקם את צינורות 1.5 מיליליטר, המכיל את תמצית RNA כפול תקוע, על בלוק חום ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי denature RNA. ואז מיד מניחים את הצינורות על קרח ודגירה במשך יותר משתי דקות.

לסנתז את cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוכה. הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של תווי RNA נגיפיים מנוכרים לצינור PCR המכיל 16 מיקרוליטרים של תערובת תגובה, וערבבו אותו בזהירות עם פיפטה כדי לא ליצור בועות. לאחר סיבוב במורד הצינורות, בצע את התמלול ההפוך עם תרמוסיקלר.

עבור PCR כמותי, השתמש בבדיקה המכניסה quencher מיקוד 963 כדי 1, 049 אזור של קטע הגנום NSP3 של rotavirus. לדלל באופן סדרתי את הפלסמיד הסטנדרטי עם מים בדרגת PCR, ולהמשיך לעשות את התמהיל הראשי עבור PCR כמותי. הוסף 20 מיקרוליטרים של תערובת האב ל בארות של צלחת PCR 96 היטב.

ואז לערבב חמישה microliters של דגימות cDNA או חמישה microliters של פלסמיד סטנדרטי על ידי pipetting 10 פעמים. בצע PCR כמותי בהתאם לתנאים בפרוטוקול הטקסט. לבסוף, לחשב את הגנום rotavirus מאוגד למשטח התא MA104 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מוצג כאן הוא עקומת צמיחה של rotavirus. על ידי החלת השיטה הכי פחות מרובעת על מודל גומפרץ שונה, קצב הצמיחה הספציפי מוערך ב-0.197, ותו תקופת ההשהיה מוערכת ב-6.61 שעות. טיטר הנגיף היחסי בשלב נייח לטיטר הראשוני הוא 3.15.

מתוך ששת שיבוטי הרוטבירוס שנבדקו, הערכים המשוערים של קצב הצמיחה הספציפי נעו בין 0.19 ל-0.27. ערכים משונים אלה אמינים מכיוון שמקדם ערכי הקביעות במודל ההתאמה הוא יותר מ- 0.98. התוצאה של הראיה מחייבת התא מוצגת כיעילות מחייבת, שהיא היחס בין חלקיקים נגיפיים קשורים לאלה הקיימים ב inoculum.

נגיף הקרוואנים שלנו המחייב משטחי תאים הוא כ-10,000 עותקים למיליליטר עם יעילות מחייבת של כ-1% בעת שימוש בצלחת של 24 באר לצורך ההתרכך על איגוד התאים. מכיוון שתאים מעובדים רגישים ללחצים פיזיים, יש לדאוג לשפוך את החיץ והאגר בעדינות אך במהירות. בעיקרו של דבר, מערכת חדשה עבור וירוסים כבר הציג.

באמצעות מערכת זו, אנו יכולים להעריך את היכולת האמיתית מחייב תאים וקצב צמיחה ספציפי עם מכשירים. הפרוטוקול שלנו הוא יתרון במדידת התכונה הפנוטיפית. על ידי בדיקת זנים שונים שזה עתה צצו, אתה יכול לעזור להעריך את החיסונים החדשים שלה עבור וירוסים.

הנגיפים מוגדרים כפתוגנים BSL-2, כך תצטרך להכין BSL-2 חדרי ניסויים כדי לבצע הליך זה.