Name: מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: למדו פרוטוקולים למדידת קצב צמיחה ספציפי ויכולת איגוד תאים של רוטה-וירוס באמצעות מבחני פלק ו-RT-qPCR. שיטות אלו מאפשרות הערכת הבדלים פנוטיפיים בין זני הווירוס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרוייקט "תברואה שרשרת: עיצוב תברואה מערכות כמו קהילה אקולוגית ערך מערכת ערכים", ResearchInstitute עבור האנושות והטבע (RIHN, Project No.14200107).

1. הכנה בינונית
<ol><li>כדי להפוך את מדיום התרבות התא (סרום המכיל בינוני), להוסיף 4.7 g של הנשר MEM אבקת 500 מ ל מים מזוקקים. אוטוקלב ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולתת הקריר בינוני לטמפרטורת החדר. להוסיף סרום שור עוברית (הריכוז הסופי: 10%),-גלוטמין (2 מ מ), סטרפטומיצין פניצילין (1%), סודיום ביקרבונט (1.125 g/L). לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.</li>
	<li>היכונו המדיום ללא סרום התפשטות וירוס כפי שמתואר בשלב 1.1, אך ללא שור הסרום העובר. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.</li>
	<li>עבור וזמינותו פלאק, לעקר 100 מ של MEM בינוני הנשר (שאינם המכילות פנול אדום) על ידי autoclaving. תן המדיום להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 2% FBS, 2% פניצילין סטרפטומיצין, 4 מ מגלוטמין, ו 2.25 g/L NaHCO3. חנות ב 4 º C.</li>
	<li>עבור וזמינותו פלאק, לעקר 100 מ של 2.5% ג'ל agarose על ידי תא לחץ. הכינו את הג'ל באותו יום שוזמינותו פלאק מתנהל. אחסן את הג'ל ב 47 ° C בתוך אמבט מים.</li>
</ol>2. תרבית תאים
<ol><li>להסיר cryotube המכיל שורות תאים MA104 מהגורם המכיל חנקן נוזלי. מניחים את cryotube באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C כדי להפשיר את התאים. להוסיף 1 מ"ל של התליה תא 20 מ"ל של המדיום המכיל סרום בבקבוקון T75. תקופת דגירה. הבקבוק באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2 של 2-3 ימים. הערה: הריכוז הסופי תא ההשעיה היא כ- 106 תאים למ"ל.</li>
	<li>ברגע טפט התא מגיע 80% confluency, להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ של 1 x של Dulbecco PBS (buffered פוספט תמיסת מלח).</li>
	<li>להוסיף 4 מ של 0.05% טריפסין-EDTA הבקבוק, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לנתק את התאים מן הבקבוק. העברת התליה תא צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 190 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי pelleted (106 תאים) 1 מ"ל של סרום המכיל 1.1 מוכן בבינוני. לדלל את התאים resuspended ב 100-fold עם המדיום.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של התליה תא מדולל כל טוב של 6-טוב (של וזמינותו פלאק) או 24-ובכן לוחות (עבור התא-איגוד וזמינותו), בהתאמה. תקופת דגירה הלוחות באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2 תחת רווי האדים של 2-3 ימים. הערה: בקבוקון T75 מתאימה לאסוף דגימות זמן-קורס כי היקף המדגם תגובת שיקוע (1 מ"ל) ניתן להתעלם בהשוואה לאמצעי האחסון supernatant סה כ (30 מ ל). בינתיים, כייל זיהומיות של הנגיף בתוך כל תגובת שיקוע נמדד על ידי וזמינותו פלאק, אשר מתבצע בדרך כלל באמצעות צלחת 6-. טוב. צלחת 24-ובכן מנוצל עבור התא-איגוד וזמינותו.</li>
</ol>3. קצב הגידול הספציפי בנגיף
הערה: רזוס בנגיף (RRV, גנוטיפ: G3P[3]) הוא מנוצל ב פרוטוקול זה בגלל RRV יכולים במהירות ובקלות ליצור לוחות עם תאים MA104.
<ol><li>המקום שפופרת המכילה 1 מ"ל של וירוסים ההשעיה (107 pfu/mL) במדיום נטול סרום המאוחסנים ב- 80 ° C באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C כדי להפשיר. להוסיף 1 µg/µL טריפסין מן הלבלב חזירי 1 מ"ל של וירוסים ההשעיה (ריכוז טריפסין הסופי הוא 4 µg/mL) ולאחר מכן מערבולת. דגירה ההשעיה וירוס-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 תחת רווי האדים למשך 30 דקות. הערה: טריפסין ממקורות אחרים יכול לשמש, אבל ההשפעה על infectivity בנגיף צריך להבדק מראש.</li>
	<li>לדלל את המתלים וירוס מופעל עם מדיום ללא סרום כדי להתאים את הריבוי של זיהום (MOI) pfu 0.1/תא.</li>
	<li>הוספת 1 מ"ל של וירוס מדולל השעיה שורות תאים MA104 (80% confluent) בבקבוקון T75 3 ימים לאחר התא ציפוי (2.1), דגירה ב 37 ° C עבור 1 h, לנער בעדינות את הבקבוק כל 15 דקות.</li>
	<li>לאחר מכן, להוסיף 30 מ של מדיום ללא סרום המכיל µg/mL 0.13 של טריפסין מ לבלב חזירי הבקבוקון. דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 תחת רווי האדים.</li>
	<li>לאסוף 1 מ"ל של תגובת שיקוע של הבקבוק-0, 6, 12, 18, 24, 36 (או 48) h לאחר הפגיעה (מדד מחירי הבתים. של) ולהחליף את תגובת שיקוע צינורות 1.5 mL באמצעות פיפטה.</li>
	<li>לנהל מדיניות ההקפאה (-80 מעלות צלזיוס), להמיס בתוך אמבט המים-מחזור 37 ° C שלוש פעמים. ואז centrifuge הצינורות ב x 12,600 g 10 דקות ב 4 º C. לאסוף את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לסנן את תגובת שיקוע עם מסנן מזוקקים 0.2 µm כדי להסיר את השבר תאים. לאחסן את supernatant-80 ° C במקרר עד החלתו על וזמינותו פלאק למדידת כייל את הוירוס.</li>
	<li>מקום הצינורות המכילים את שנאספו תגובת שיקוע (שלב 3.5) באמבט מים בטמפרטורה 37 º c להוסיף 4 µg/mL טריפסין 1 מ ל 10-fold מדגם מדולל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>במהלך 30 דקות ב- 3.8, כדי להתחיל וזמינותו פלאק למדידת כייל את וירוס המתקבל בזמן הקורס דגימות (שלב 3.5), לשטוף את התאים MA104 פעמיים בצלחת 6-ובכן עם 2 מ של 1 x PBS לאחר הסרת המדיום המכיל סרום.</li>
	<li>באופן סדרתי לדלל את הדגימות incubated עם מדיום ללא סרום, לחסן 1 מ"ל של המדגם מדולל כל טוב. דגירה את הצלחת במשך 90 דקות ב 37 ° C ו- 5% CO2 תחת רווי האדים, ומנערים בעדינות את הצלחת כל 15 דקות.</li>
	<li>לאחר דגירה, הסר את inoculum הצלחת 6-. טוב. להוסיף 4 µg/mL טריפסין המדיום המבושלות (שלב 1.3). בעדינות אך מיד להוסיף 3 מ"ל של המדיום מעורבב עם ג'ל agarose (היחס הוא 1:1) כל טוב.</li>
	<li>לשמור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך יותר מ 10 דקות (עד agarose הג'ל הופך מוצק), תקופת דגירה של 2 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 תחת רווי האדים. הערה: שופכים את המדיום מעורבב עם אגר מהקצה של הבאר.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של 0.015% נייטרלי אדום הפתרון מדולל עם PBS 1 x כדי מכל קידוח, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 תחת רווי האדים. הסר לצבוע לאחר 3 שעות ולאחר תקופת דגירה של יום 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 תחת רווי האדים.</li>
	<li>למחרת, לספור את מספר לוחות מכל קידוח ולחשב pfu/mL. בדוק המפגש תא לפני וזמינותו פלאק כדי להבטיח את המספרים פלאק.</li>
</ol>4. תא-איגוד וזמינותו
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על הדו ח של Gilling13.
<ol><li>להוסיף 1 טריפסין µg/µL מ לבלב חזירי 1 מ"ל של וירוסים ההשעיה (ריכוז טריפסין הסופי הוא 4 µg/mL) ולאחר מכן מערבולת (באופן זהה כמו 2.1). לדלל את המתלים וירוס עם מדיום ללא סרום כדי להתאים למשרד הפנים של pfu 1/תא.</li>
	<li>לאחר מכן, לשטוף את התאים MA104 פעמיים על צלחת 24-ובכן עם 1 מ ל תמיסת באגירה טריס (TBS; 2.53 g/L טריס לבסס, 6.54 g/L NaCl, 0.3 g/L, אשלגן כלורי 0.046 g/l נה2HPO4 להגיע 1 ליטר עם מים מזוקקים).</li>
	<li>לחסן µL 100 של וירוס מדולל השעיה על כל טוב של צלחת 24-ובכן עם תאים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, עם עדין רועדות מדי 15 דקות.</li>
	<li>להסיר את inoculum וירוס. ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של TBS. כדי לחלץ את הכפול גדילי (ds) RNA של בנגיף, להוסיף µL 140 1 x PBS ו µL 560 המאגר החילוץ RNA (ראה טבלה של חומרים) כדי מכל קידוח. מערבבים בצורה הולמת עם פיפטה (על 10 x או עד ערפל או מזהם של תאים במאגר לא ראיתי).</li>
	<li>לאחר שהתאושש RNA נטושים כפול (dsRNA) על פי הפרוטוקול של היצרן, מקום הצינורות 1.5 mL בתמצית dsRNA על גוש חום ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי denature את dsRNA, ואז מיד במקום הצינורות על קרח, תקופת דגירה של יותר מ 2 min.</li>
	<li>לסנתז את cDNA באמצעות תיעוד הפוכה קיט (ראה טבלה של חומרים). להוסיף 4 µL של שפגע בסימני פתרון ה-RNA נגיפי צינור PCR המכיל 16 µl של תערובת (טבלה 1) ולערבב בזהירות עם פיפטה כדי לא ליצור בועות. ספין לטמיון.</li>
	<li>לבצע את שעתוק במהופך עם הצנטרפוגה תרמי תחת התנאי שמוצג בטבלה 2. אם cDNA אינו בשימוש מיד, אחסן את הצינור PCR המכיל את cDNA ב-20 ° C עד 1 שנה.</li>
	<li>לשימוש תחל את ה-PCR כמותי (קדמי; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', הפוך; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 ובדיקה הוספה של כ'חטיף (qPCR הגששים; 5'- / אחי/ATGAGCACA/כ'חטיף/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/טמרה/3 "), מיקוד 963 – 1049 אזור של NSP3 קטע הגנום של בנגיף (ST3 זן, GenBank: X81436). הערה: כ'חטיף מוכנס לתוך המכשיר עוצב על ידי Zeng ואח14
</li>
	<li>לדלל את פלסמיד רגיל באופן סדרתי (101 עד 106 עותקים/mL) עם ה-PCR כיתה מים לתערובת qPCR (טבלה 3) ולהפוך את תערובת הבסיס (20 µL לדוגמה) עבור qPCR בעקבות בטבלה 4.</li>
	<li>להוסיף 20 µL של המיקס אב אל הבאר של צלחת PCR 96-ובכן, ואז לערבב µL 5 דוגמאות cDNA או µL 5 של פלסמיד סטנדרטי על ידי pipetting 10 פעמים. להתחיל את התגובה של המערכת qPCR בהתאם לתנאים המוצגים בטבלה4.</li>
	<li>כדי לחשב את הגנום בנגיף שמאוגד אל פני השטח תא MA104, לבצע רגרסיה ליניארית בין ערכים Ct מספר הגנום הידועים פלסמיד רגיל ולאחר הערכת מספר הגנום של המדגם. ואז לחשב את היחס שבין איגוד virion מספרים על תאים (Gt) לאלו inoculum הראשונית (G0).</li>
</ol>

<ol><li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna+Virus+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+rotavirus+a+population+of+reassortants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Is rotavirus a population of reassortants?</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li>
<li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li>
<li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li>
<li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li>
<li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li>
<li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+rotavirus+serotypes%2F+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li>
<li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li>
<li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li>
<li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li>
<li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li>
<li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li>
<li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li>
<li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions%3A+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li>
<li>Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li>
<li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+B+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li>
<li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li>
<li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול שלנו למדידת קצב צמיחה ספציפיים יותר קל מאשר הקודמים, יכול להיות מותאם וירוסים אחרים, אלא אם כן מערכת התרבות התא שלהם עדיין לא הוקם. במחקר זה, השתמשנו RRV (G3P[3]). כי זה זן שכשיש הפלאק קל יותר rotaviruses האנושי באמצעות שורות תאים MA104. כמה זנים בנגיף האנושי לא יכול ליצור רובד בשורה זו תא. לכן, במקום וזמינותו פלאק, המוקד ויוצרים יחידת (ffu ב) assay15 או החציון תרביות רקמה זיהומיות מינון (TCID50) assay יכול להיות מיושם עבור רבים בנגיף זנים16. פרוטוקול הציג עבור קביעת שיעור צמיחה ספציפיים יכול לשמש עבור סוגי וירוסים אחרים, אך אינה מתאימה לאיתור וירוסים אשר מוקמת אין מערכת התרבות התא הוקמה. לפני תחילת הניסוי עבור שיעור צמיחה ספציפיים, זה עדיף לדעת מראש מתי כייל זיהומיות וירוס מתחיל לגדול, מגיע השלב נייח בבדיקה ראשונית. אם קיימות הפלאק מדי, וזמינותו פלאק וצריך להתנהל שוב לאחר שינוי קצב דילול של הדגימות וירוס. זיהום שלאחר שעות. מדד מחירי הבתים (. של) לאסוף דגימות חשובים גם בגלל השיפוע של שלב הגידול המעריכי יכול לזלזל אם נקודת הזמן הנכון להגיע לשלב נייח הוא החמיץ. קירוב על ידי מודל Gompertz שונה, מקדם הדטרמינציה צריך תמיד להיות מחושב, בדקתי. אם בחדר הכושר על הדגם Gompertz ששונה נמוכה, דגמים צמיחה אחרים כגון מודל לוגיסטי שונה12 עשוי להיות עדיף.
בטיפול תאים, בעת הסרת את מדיום או וירוס inoculum, טוב, מגניב עבור ג'ל כביסה או agarose assay פלאק מיד להתווסף לכל אחד טוב של צלחת התרבות התא כדי למנוע את התאים מפני יובש. באותו זמן, אתה חייב למזוג בעדינות PBS או agarose על תאים לא לנתק מבארות. שלב זה הוא החשוב ביותר, בשני מבחני (שלב ציונים של 3.11). אם וזמינותו רובד יש דוגמאות רבות מדי, אנו ממליצים על סוגייה משפטית את הג'ל agarose (100 מ"ל כל מקסימום מומלץ) לתוך בקבוקים בינוני, שומרת על הבקבוקים חם עד לפני שימוש מאז agarose ג'ל הוא פני השטח למוצק בתוך כ- 10 דקות בחדר טמפרטורה. מאחר טריפסין לפגיע בפני טמפרטורות גבוהות17, יש להוסיף פתרון טריפסין בינוני ו agarose עבור וזמינותו פלאק לאחר שלמאחה לצנן.
ב תא-איגוד וזמינותו, הדגירה לכריכה וירוס לתאי חייב להתבצע ב 4 ° C כדי למנוע פלישה של התאים. על פי השיטה של Gilling13, התאים נוטים ייבוש בטמפרטורות נמוכות, כך טלטול עדין הוא הכרחי בכל 15 דקות במהלך הדגירה. ערכת חילוץ RNA מנוצל כאן הרבה מכדי קיטים אחרים. השיפוע של העקומה סטנדרטי ב- RT-qPCR צריך להיות כ 3.3, מקדם הדטרמינציה צריכה להיות יותר 0.98. וזמינותו לעומת המיקרוסקופ פלורסצנטיות להמחיש הלוקליזציה של וירוסים בתאים, הוא מהיר יותר, קל יותר להשתמש כי הכריכה של חומרים פלורסנט וירוסים אינה נחוצה.
לאחרונה, enteroid האנושי מעיים (HIE), בתערוכה של הרכב הסלולר דומים ותפקוד כמו האפיתל אנוש במערכת העיכול, הפך זמין עבור הפצת בנגיף18. השימוש HIE עשוי לאפשר לנו להעריך את קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא מחייב של זנים שאינם culturable של בנגיף. כמו כן, בשני הניסויים המתוארים כאן שאפשר למרוח את הערכת ההשפעות התרופות שני פנוטיפים19. הפרוטוקולים המובאת כאן מאפשרים לדון באופן כמותי את השינויים בפנוטיפ ערכי הפרמטרים של זנים בנגיף בתנאים מגוונים.

וירוסי RNA טופס אוכלוסייה מגוונת מבחינה גנטית, המכונה קווסי-זנים1, בגלל קצב מוטציה שלהם,2 אשר הוא גבוה מזה של אורגניזמים מבוסס DNA. מבנה האוכלוסייה קווסי-זנים מושפע על ידי גורמים גנטיים האוכלוסייה, כולל המוטציה, לחץ לבחירה של סחף גנטי. זנים בתוך שושלת גנטי יחיד עשוי להראות פנוטיפים שונים בגלל המגוון הגנטי. לדוגמה, Rachmadi et al. הראה כי רגישות כלור חופשי היה שונה בין זנים norovirus מאתר כי מקורם זן טהור-פלאק S7-PP33.
Rotaviruses (סוג בנגיף במשפחה reoviridae) הם וירוסים ds שאינו אפוף RNA ויוצרים קווסי-זנים2. בנוסף האוכלוסייה גורמים גנטיים שתוארו לעיל, הגנום reassortment משפיע המגוון הגנטי של בנגיף כי וירוס זה יש הגנום מקוטע 114. Rotaviruses לגרום לשלשולים בעיקר בקרב תינוקות, פטירות בשנת 2013 הוערך על 250,0005. שני חיסונים נמצאים בשימוש בכמה מדינות, הוכחו כיעילים בהפחתת הנטל של זיהום בנגיף, אבל יש חוקרים דנים עכשיו הנוכחות של חיסון-לברוח מוטציות6,7,8, 9. אפיון המוטנטים האלה חשוב להבין את מנגנוני החיסון-לברוח.
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור שני מבחני להעריך את קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף כדי להבין את ההבדלים פנוטיפי בין זנים/מוטציות. עקומת הגדילה של rotaviruses הוצגו בדוחות קודמים10, אך הצמיחה פרמטרים כגון קצב צמיחה ספציפיים לא נמדדים בדרך כלל. וזמינותו מחייב תא שנערכו בעבר כרוך טכניקת צביעת immunofluorescent11. אנו מראים כאן קל יותר שיטות של שימוש assay פלאק ו RT-qPCR, אשר מאפשרים לנו לדון באופן כמותי את ההבדל בין פנוטיפים ויראלי. שיטות אלה מתאימות אפיון פנוטיפים בנגיף, יכול לתרום בסופו של דבר לבנייה של חיסונים חדשים יעילים אחרים מרובים.

<table><tbody><tr><td>7500 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR Agar-EPI</td><td>Nakalai Tesque, Inc</td><td>01101-34</td><td>בדיקת פלאק</td></tr><tr><td>דיסודיום הידרוגנפוספט</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>194-02875</td><td>בדיקת קשירת תאים</td></tr><tr><td>MEM של נשר "Nissui" <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg"></td><td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>_05900</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>MEM של נשר "Nissui" <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg"></td><td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>_05901</td><td>בדיקת פלאק</td></tr><tr><td>EasYFlask 75 סמ"ר</td><td>תרמו מדעי</td><td>156499</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>סרים בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>תרבית תאים ובדיקת פלאק</td></tr><tr><td>פריימרים קדימה / הפוכה</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>L-Glutamine, תמיסה של 200 מ"מ</td><td>Gibco</td><td>2530081</td><td>תרבית תאים ובדיקת פלאק</td></tr><tr><td>ניטרלי אדום</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>140-00932</td><td>בדיקת פלאק</td></tr><tr><td>PBS (-) "Nissui"</td><td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>_05913</td><td>בדיקת תרבית תאים ורובד</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין, Liguid</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>תרבית תאים ובדיקת פלאק</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-03545</td><td>בדיקת קשירת תאים</td></tr><tr><td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td> <td>TAKARA Bio Inc.</td>ערכת ריאגנטים <td>RR039A</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>PrimeScriptTN RT (זמן אמת מושלם)</td><td>TAKARA Bio Inc.</td><td>RR037A</td><td>cDNA סינתזה</td></tr><tr><td>PrimeTime qPCR בדיקות</td><td>מעבדות רפואיות וביולוגיות ושות', בע"מ</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>QIAamp ערכת מיני RNA ויראלי</td><td>QIAGEN</td><td>52904</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>199-05985</td><td>בדיקת תרבית תאים ורובד</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>198-01675</td><td>בדיקת קשירת תאים</td></tr><tr><td>לוחות תרבית רקמות צלחת 24 בארות</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>בדיקת קשירת תאים</td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות צלחת 6 בארות</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>בדיקת פלאק</td></tr><tr><td>בסיס טריזמה</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T1503</td><td>בדיקת קשירת תאים</td></tr><tr><td>טריפסין מלבלב חזיר</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0303-1G</td><td>הפעלה עבור נגיף הרוטה</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>אנכית 96 בארות תרמית</td><td></td><td>סינתזת cDNA</td> של ביו-סיסטמס <td></td> יישומי</tr></tbody></table>

מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

בנגיף היא הגורם העיקרי etiological נגד שלשול אינפנטילי. וירוס RNA הכפול גדילי (ds), יוצרת אוכלוסיה מגוונת מבחינה גנטית, המכונה קווסי-זנים, בשל קצב מוטציה גבוהה שלהם. כאן, אנו נתאר כיצד למדוד את קצב צמיחה ספציפיים ועל יכולתה מחייב תא בנגיף כמו פנוטיפים שלה. בנגיף שטופלו טריפסין לזהות את קולטן תא, ואז מחוסן לתוך תרבית תאים MA104. תגובת שיקוע, כולל progenies ויראלי, נאסף לסירוגין. וזמינותו פלאק משמש כדי לאשר את כייל וירוס (יחידת להיוות פלאק: pfu) של כל תגובת שיקוע שנאספו. קצב צמיחה ספציפיים מוערך על-ידי קביעת נתוני זמן-קורס pfu/mL למודל Gompertz שונה. ב וזמינותו של התא מחייב, תאים MA104 צלחת 24-ובכן נגוע בנגיף, מודגרות במשך 90 דקות ב 4 ° C עבור בנגיף ספיחה לקולטנים בתא. טמפרטורה נמוכה ומרסן בנגיף מפני פולשים התא המארח. לאחר הכביסה כדי להסיר את virions לא מאוגד, RNA מופק virions מחובר קולטני התא ואחריו cDNA סינתזה, הפוכה-תמלול PCR כמותי (RT-qPCR). פרוטוקולים אלה יכול להיות מיושם עבור חוקרים את ההבדלים פנוטיפי בין זנים ויראלי.

סקירה כללית של שני פרוטוקולים עבור קצב צמיחה ספציפיים ותא-איגוד וזמינותו של פלאק-מטוהר RRV זנים מוצג איור 1A ו- 2A, בהתאמה.
ב וזמינותו עבור שיעור צמיחה ספציפיים, כייל וירוס הסופי מגיע ליותר מ-107 pfu/mL בעת הפצת על הבקבוק T75. אם הריכוז המרבי הוא נמוך יותר מאשר pfu7 10/mL, התא MA104 לא הפכה confluent או RRV לא הופעלה על ידי טריפסין. דגמים גדילה זמינים עבור הערכת קצב צמיחה ספציפיים באמצעות הנתונים יחידת זיהומיות. ב פרוטוקול זה, ששונה Gompertz דגם12 הוא מועסק בתור דוגמה; <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
איפה N0 (104 pfu/mL במחקר זה) ו- Nt (104 כדי8 10 pfu/mL) הן וירוסים זיהומיות כייל נוגדנים (pfu/mL)-0 ו- t (דוגמה: 0, 6, 12, 18, 24, 36) מדד מחירי הבתים של, בהתאמה, A הוא הערך אסימפטוטית [יומן (N∞/N0 )] (לדוגמה: 3-4) ממוצע הצמיחה מסוים [1/h], e הוא קבוע נפייר, λ הוא תקופת השהיה [h]. מודל פרמטרים מתקבלים על-ידי הפונקציה solver של תוכנת ניתוח, אשר מצמצם את הסכום של ריבועים של ההפרש בין הערכים שנמדדו ו מעוצבת. בדוגמה איור 1B, קצב צמיחה ספציפיים (ממוצע) מוערך 0.197 [1/h] ואת תקופת השהיה (λ) היא 6.61 [h] על-ידי החלת שיטת לפחות מרובע דגם Gompertz שונה, כייל את וירוס היחסי בשלב נייח כדי (כייל הראשונית סולם לוגריתמי) (א) הוא 3.15 [יומן (N∞/N0)]. בדקנו 6 שיבוטים בנגיף סה כ, הערכים המשוערים של קצב צמיחה ספציפיים נע מ 0.19 אל 0.27 [1/h]. אלה מעריכים ערכים אמינים כי המקדם של קביעת הערכים מודל ההתאמה היא יותר 0.98.
Virions RRV מחייב את התא משטחים היו כ- 103 עותקים/mL (מחייב יעילות היה בסביבות 1%) בעת השימוש צלחת 24-טוב עבור התא-איגוד וזמינותו (איור 2B). וזמינותו מתנהל בדרך כלל שלוש פעמים עבור כל דגימה, אם שונות גדולה במספר עותק נצפית במדגם, עלולות להתרחש בעיות כגון שטיפת יתר על המידה ובלתי מספקת הפעלה של RRV על ידי טריפסין. הערך Ct qPCR העולה על דעתך 36.0 לא עדיפה, נחשב להיות מתחת למגבלה זיהוי במצב שלנו qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>נפח / 1 תגובה</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 x PrimeScript מאגר</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>אנזים PrimeScript RT לערבב אני</td>
			<td>1.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT פריימר</td>
			<td>1.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>שהרובוט אקראי 6</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונים מים מזוקקים</td>
			<td>6.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ssRNA מדגם</td>
			<td>4.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה</td>
			<td>20.0 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מאסטר מערבבים הרכב של cDNA סינתזה של הגנום בנגיף.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>הטמפרטורה [° C]</td>
			<td>זמן</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: תגובת מצב של סינתזה cDNA של הגנום בנגיף.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>אמצעי אחסון/1 תגובה</td>
		</tr>
<tr>
<td>Premix Taq</td>
			<td>12.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר לפנים (10 מיקרומטר)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר הפוכה (10 מיקרומטר)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>בדיקה (10 מיקרומטר)</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>הפניה לצבוע II</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>יונים מים מזוקקים</td>
			<td>5.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>לדוגמה cDNA</td>
			<td>5.0 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה</td>
			<td>25 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: מאסטר מערבבים הרכב עבור ה-PCR כמותי של בנגיף הגנום.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>הטמפרטורה [° C]</td>
			<td>זמן</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">מחזור 45</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: תגובת מצב עבור ה-PCR כמותי של בנגיף הגנום.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> איור 1: סקירה סכמטי של הערכת צמיחת בנגיף, עקומת הגדילה של בנגיף. (א) יחידת זיהומיות בנגיף נמדד עם רובד וזמינותו. (B) העיקול (קו כחול) הייתה לקרב את ערכיהן על ידי מודל Gompertz שונה על סמך נתונים שנצפו במעבדה שלנו (עיגול לבן). קצב הגידול הספציפי [?]; 0.197 [h-1], השהיה נקודה (λ); 6.61 [h], כייל וירוס היחסי בשלב נייח כדי כייל נוגדנים הראשונית (יומן סולם) (א); 3.15 [יומן (N∞/N0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> איור 2: סקירה סכמטית והתוצאה נציג של התא-איגוד וזמינותו של חמישה זנים RRV מכל שלטי במעבדה שלנו. (א) A-תא-תרבות-הצלחת מחוסן עם בנגיף מודגרת ב 4 ° C עבור מעכבות את הפלישה וירוס לתוך תאים. לאחר דגירה, הסרת את חלקיקי נגיפי לא מאוגד לתאים, לכמת את המספר של הגנום שמקורם נגיפים מאוגד השטח תא עם RT-qPCR. (B) התוצאה של האיגוד התא assay היה להציג מחייב יעילות (%), אשר היה היחס של נגיפים מאוגדים אלה נוכח inoculum. נועז בר: חציון, סוף תיבות: סטיית הרביעון, הסופית: מינימלי ומקסימלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים, אחד למדידת קצב הגידול הספציפי והשני עבור היכולת מחייב תא של בנגיף שימוש assay פלאק ו- RT-qPCR. פרוטוקולים אלה זמינים עבור המאשר את ההבדלים פנוטיפים בין זנים בנגיף.

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

באמצעות התשנים המוצגים כאן, ניתן להעריך את ההבדל בפנוטיפ בין זנים rotavirus, שבו זנים ייחודיים מבודדים. באופן ספציפי, השינוי הפנוטיפי של זנים עמידים לחיטוי של rotavirus נחקר. כדי להשיג תפוקות כמותיות ברורות באמצעות מראי פלאק, זה קריטי כדי לבחור שילוב מתאים של זן rotavirus וסרום, שבו rotavirus מותאם היטב לסרום.הדגמת ההליך תהיה סון-סוקה קדויה, דוקטורנט מהמעבדה שלי. הסר CryoTube המכיל קווי תא MA104 ממיכל החנקן הנוזלי. מניחים את CryoTube באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפשיר את התאים.הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה התא ל 20 מיליליטר של המדיום המכיל סרום בבקבוק T75. חגר את הבקבוק באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס וב-5%CO2 למשך יומיים-שלושה. ברגע שהמונוליאר של התא מגיע ל-80%, הסר את העל-טבעי ושטף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS של 1X Dulbecco.מוסיפים ארבעה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוקון, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לנתק את התאים מן הבקבוק. מעבירים את ההשעיה התאית לצינור 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 190 גרם במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים המהודרים במיליליטר אחד של מדיום המכיל סרום.לאחר מכן לדלל את התאים המתווים 100-פי עם המדיום. הוסף שלושה מיליליטר של ההשעיה התא מדולל לכל באר של צלחת שש באר עבור המראה פלאק. הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה התא מדולל לכל באר של צלחת 24 באר עבור הראיה מחייב התא.אין לאחסן את הצלחות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס וב-5%CO2 אדים לא רוויים למשך יומיים או שלושה. מעבירים צינור המכיל מיליליטר אחד של מתלי הנגיף במדיום נטול סרום מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להפשרה. הוסף מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר של טריפסין מן הלבלב פורצ'ין למיליליטר אחד של ההשעיה וירוס ולאחר מכן מערבולת.דגירה ההשעיה וירוס ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 אדים בלתי רוויים במשך 30 דקות. לדלל את ההשעיה וירוס פעיל עם מדיום ללא סרום כדי להתאים את ריבוי הזיהום, או MOI, ל 0.1 pfu לכל תא. הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה וירוס מדולל לתאי MA104 בבקבוק T75 שלושה ימים לאחר ציפוי התא.דגירה התאים עם וירוס ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, בעדינות לנער את הבקבוק כל 15 דקות. לאחר מכן הוסיפו 30 מיליליטר של מדיום נטול סרום המכיל ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של טריפסין מלבלב החזירי לבקבוקון. הדגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 אדים רוויים.לאסוף מיליליטר אחד של supernatant בבקבוקון באפס, שש, 12, 18, 24, ו 36 שעות לאחר זיהום, ולהחליף את supernatant בסוגים 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה. לנהל מחזור הפשרה בהקפאה בתוך 15 דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס ואחריו להמיס 15 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. ואז צנטריפוגה הצינורות ב 12, 600 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאסוף את העל-טבעי. סנן את העל-טבעי באמצעות מסנן 0.2 מיקרון מזוקק כדי להסיר את שבר התא. יש לאחסן את העל-טבעי במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להחלתו על המוצנת פלאק למדידת טיטר הנגיף.כאשר מוכנים לבצע את בדיקת הפלאק, מניחים את הצינורות המכילים את העל-טבעי שנאסף באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס. מוסיפים טריפסין למיליליטר אחד של דגימה מדוללת פי 10, ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך הדגירה הזו של 30 דקות, שטפו בזהירות את תאי ה-MA104 בצלחת של שש בארות עם שני מיליליטר של 1X PBS לאחר הסרת המדיום המכיל סרום.מדללים באופן סדרתי את הדגימות המודגרות במדיום נטול סרום ומחסן מיליליטר אחד של המדגם המדולל לתוך כל באר. דוגרים את הצלחת במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 אדים רוויים, בעדינות לנער את הצלחת כל 15 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את inoculum מהצלחת שש באר.הוסף ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של טריפסין למדיום המוכן. בעדינות אך מיד להוסיף שלושה מיליליטר של המדיום מעורבב עם ג'ל אגרוז לכל באר. אפשרו לג'ל אגרוז להתגבש בטמפרטורת החדר במשך יותר מ-10 דקות.לאחר מכן הדגירה את הצלחת במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 אדים רוויים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 0.015%פתרון אדום ניטרלי מדולל עם PBS 1X לכל באר, ודגירה עם אותם תנאים. מוציאים את הצבע לאחר שלוש שעות וממשיכים להתהגר במשך יום אחד.למחרת, לספור את מספר הלוחות בכל באר ולחשב את pfu למיליליטר. בדוק בזהירות את התכנסות התא לפני בדיקת הפלאק כדי להבטיח את מספרי הפלאק. לצורך בדיקה מחייבת תאים, יש להוסיף מיקרוגרם אחד למיקרוליטר של טריפסין מלבלב פורצ'ין למיליליטר אחד של ההשעיה של הנגיף, ולאחר מכן מערבולת.לדלל את ההשעיה וירוס עם מדיום ללא סרום כדי להתאים את MOI ל pfu אחד לכל תא. לשטוף את תאי MA104 פעמיים בצלחת 24 באר עם מיליליטר אחד של מלוחים טריס-buffered. עכשיו לחסן את התאים עם 100 microliters של השעיית וירוס מדולל לתוך כל באר של צלחת 24 באר.דגירה הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 90 דקות עם טלטול עדין כל 15 דקות. הסר את אינוקולום הנגיף, ולשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של מלוחים טריס-buffered. כדי לחלץ את ה-RNA התקוע הכפול של הרוטבירוס, הוסיפו 140 מיקרוליטרים של 1X PBS ו-560 מיקרוליטרים של מאגר החילוץ של ה-RNA לכל באר.מערבבים כראוי עם פיפטה עד אובך של תאים במאגר לא נראה. לאחר שחזור RNA כפול תקוע, על פי פרוטוקול היצרן, למקם את צינורות 1.5 מיליליטר, המכיל את תמצית RNA כפול תקוע, על בלוק חום ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי denature RNA. ואז מיד מניחים את הצינורות על קרח ודגירה במשך יותר משתי דקות.לסנתז את cDNA באמצעות ערכת שעתוק הפוכה. הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של תווי RNA נגיפיים מנוכרים לצינור PCR המכיל 16 מיקרוליטרים של תערובת תגובה, וערבבו אותו בזהירות עם פיפטה כדי לא ליצור בועות. לאחר סיבוב במורד הצינורות, בצע את התמלול ההפוך עם תרמוסיקלר.עבור PCR כמותי, השתמש בבדיקה המכניסה quencher מיקוד 963 כדי 1, 049 אזור של קטע הגנום NSP3 של rotavirus. לדלל באופן סדרתי את הפלסמיד הסטנדרטי עם מים בדרגת PCR, ולהמשיך לעשות את התמהיל הראשי עבור PCR כמותי. הוסף 20 מיקרוליטרים של תערובת האב ל בארות של צלחת PCR 96 היטב.ואז לערבב חמישה microliters של דגימות cDNA או חמישה microliters של פלסמיד סטנדרטי על ידי pipetting 10 פעמים. בצע PCR כמותי בהתאם לתנאים בפרוטוקול הטקסט. לבסוף, לחשב את הגנום rotavirus מאוגד למשטח התא MA104 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.מוצג כאן הוא עקומת צמיחה של rotavirus. על ידי החלת השיטה הכי פחות מרובעת על מודל גומפרץ שונה, קצב הצמיחה הספציפי מוערך ב-0.197, ותו תקופת ההשהיה מוערכת ב-6.61 שעות. טיטר הנגיף היחסי בשלב נייח לטיטר הראשוני הוא 3.15.מתוך ששת שיבוטי הרוטבירוס שנבדקו, הערכים המשוערים של קצב הצמיחה הספציפי נעו בין 0.19 ל-0.27. ערכים משונים אלה אמינים מכיוון שמקדם ערכי הקביעות במודל ההתאמה הוא יותר מ- 0.98. התוצאה של הראיה מחייבת התא מוצגת כיעילות מחייבת, שהיא היחס בין חלקיקים נגיפיים קשורים לאלה הקיימים ב inoculum.נגיף הקרוואנים שלנו המחייב משטחי תאים הוא כ-10,000 עותקים למיליליטר עם יעילות מחייבת של כ-1% בעת שימוש בצלחת של 24 באר לצורך ההתרכך על איגוד התאים. מכיוון שתאים מעובדים רגישים ללחצים פיזיים, יש לדאוג לשפוך את החיץ והאגר בעדינות אך במהירות. בעיקרו של דבר, מערכת חדשה עבור וירוסים כבר הציג.באמצעות מערכת זו, אנו יכולים להעריך את היכולת האמיתית מחייב תאים וקצב צמיחה ספציפי עם מכשירים. הפרוטוקול שלנו הוא יתרון במדידת התכונה הפנוטיפית. על ידי בדיקת זנים שונים שזה עתה צצו, אתה יכול לעזור להעריך את החיסונים החדשים שלה עבור וירוסים.הנגיפים מוגדרים כפתוגנים BSL-2, כך תצטרך להכין BSL-2 חדרי ניסויים כדי לבצע הליך זה.

assays-for-specific-growth-rate-cell-binding-ability

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Source: Philip, A. A., et. al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a plaque assay technique to monitor rotavirus infection in epithelial cells. Trypsin activation enhances viral entry, and staining highlights viable cells, enabling visualization of infection-induced plaques.

Visualizing Trypsin-Activated Rotavirus Infection Using a Plaque Assay

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת נוגדנים מנטרלים כנגד נגיף סינסיטיאלי נשימתי (RSV). טרום דגירה עם סרום המכיל נוגדנים מנטרלי RSV מנטרל את חלקיקי הנגיף, מפחית זיהום תאי והיווצרות פלאק. תאים נגועים בנגיף עוברים לאחר מכן קיבוע, חסימה ותיוג נוגדנים מצומדים פלואורופורים להדמיית פלאק. תהליך זה מאפשר זיהוי של דילול הסרום הגבוה ביותר המנטרל חמישים אחוז של RSV, המייצג את טיטר הניטרול.

בדיקה למדידת נוגדן מנטרל titer ספציפי עבור וירוס סינסיטיאלי נשימתי

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות חלקיקים דמויי וירוס נורו-וירוס אנושי (VLPs) הנקשרים לחיידקי מעיים אנושיים. התרחיפים החיידקיים מעורבבים עם ה-VLPs ומודגרים כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של חיידקי VLP. לאחר מכן מסומנים הקומפלקסים בנוגדנים ספציפיים ל-VLP המתויגים כפלואורופורים, ולאחר מכן הדמיה וכימות מבוססי ציטומטריית זרימה כדי לזהות את אחוז החיידקים הקשורים ל-VLP.

בדיקה לכימות הקשר של VLPs נורו-וירוס אנושי לחיידקי מעיים

השלב הראשון במחזור החיים של וירוס הזירה הוא הצמדה של חלקיקים נגיפיים לתאים מארחים. אנו מדווחים על בדיקה כמותית מבוססת RT-PCR לזיהוי וכימות רגישים במיוחד של אירועי התקשרות ל-arenavirus.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.

Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)

אנו מתארים שיטה ליצירת, הגברה גנטית שונה וירוסים syncytial הנשימה (RSVs) ואת וזמינותו של פלאק ממוטב עבור RSVs. אנו ממחישים לפרוטוקול זה על-ידי יצירת שני וירוסים רקומביננטי בהתאמה לאפשר כימות של שכפול RSV ולחיות ניתוח של RSV הכללה וגופי בגרגרים הכללה גופים הקשורים דינמיקה.

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

למדו פרוטוקולים למדידת קצב צמיחה ספציפי ויכולת איגוד תאים של רוטה-וירוס באמצעות מבחני פלק ו-RT-qPCR. שיטות אלו מאפשרות הערכת הבדלים פנוטיפיים בין זני הווירוס.

מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

גלה סרטונים נוספים