בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם
16 באפריל 2019
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה של לבודד תאים אפיתל יחיד, שלפוחית השתן נגוע של המודל מאתר של דלקת בדרכי השתן.
קהילות חיידקים תאיים, או IBCs, נצפו בעכברים שקיבלו זיהומים ניסיוניים בדרכי השתן, או UTIs. הם גם נראו במשיעי השתן של חולי UTI אנושיים. הטכניקה שאנו מתארים היום היא דרך לבודד IPCs יחיד מעכברים נגועים בניסויים.
טכניקת micropipetting הפה היא הטכניקה היחידה הזמינה כיום עבור בידוד חיידקים תאיים משלפוחיות עכבר נגועות. כדי להכין פיפיות פה זכוכית, לצבוט בחוזקה את שני הקצוות של צינור נימי זכוכית באופן שווה לסובב את אמצע הצינור קדימה ואחורה לאורך הציר שלה על מקור להבה פתוח. כאשר הזכוכית הופכת רכה, להסיר את נימי ממקור החום ומיד למשוך את הזכוכית לגזרים.
האורך הסופי האידיאלי של נימי משך הוא שלושה עד חמישה סנטימטרים יותר נימי unpulled כדי להבטיח קוטר פנימי מתאים לבודד תאים אפיתל שלפוחית השתן יחיד. כאשר הזכוכית התקררה, בדוק אם אמצע נימי הזכוכית צר יותר ושפנים הצינור עדיין חלול. להרים את הקצה הגדול של נימי משך ביד אחת, להשתמש מדפים כדי לתפוס את נימי בנקודה הצרה ביותר שלה, לוודא המדפים מופעלים עם מספיק כוח כדי לאחוז נימי בחוזקה מבלי למחוץ אותו.
סובב במהירות את המדפים כדי לצלם את נימי המשכה בנקודה הצרה ביותר. לאחר מכן, מניחים את נימי בגודל מיקרופיפט בפה בצלחת פטרי 100 מילימטר ו UV לעקר את המנה במשך 30 דקות. כדי לקצור את שלפוחית השתן, מניחים עכבר בתצורת supine ולעקר את אזור הבטן עם 70% אתנול.
באמצעות ממטרים מעוקרים אתנול ומספריים כירורגיים, לבצע חתך עור רוחבי בסנטימטר אחד מעל פתח השופכה ולהרחיב את החתך באלכסון לכיוון הגפיים העליונות של העכבר כדי ליצור חתך בצורת V לאורך כל החלק הראשון של העכבר החושף את התוכן של peritoneum. באמצעות כלים מעוקרים חדשים, בעדינות לדחוף למטה על רפידות השומן ליד אזור האגן של העכבר כדי לגרום לשלפוחית השתן לבוט ולתפוס את שלפוחית השתן החשופה על שיא. שמירה על אחיזה איתנה על שלפוחית השתן, לחתוך את השופכים ואת השופכה כדי לשחרר את שלפוחית השתן ולהכניס את הקצה של פיר אחד של מדפים מעוגל לתוך פתיחת שלפוחית השתן שבו זה היה רק חרות.
שחררו את המלכודות שאוחזות את העופרת ושומרות על המדפים מעוגל סגורים כמעט לחלוטין, השתמשו בזוג מלכודות שני כדי למשוך בעדינות את הקצה החיצוני של הפה של שלפוחית השתן הרחק מהמדפים העגולים ומסובבים את הקצה השני של המדפים המגולפים כדי להפוך את שלפוחית השתן מבפנים החוצה. לאחר מכן, השתמש בזוג המדפים השני כדי לפתות בעדינות את שלפוחית השתן ההפויה מקצות הממטרים למיליליטר אחד של PBS קר. ובעדינות לגרד את שכבת התא האפיתל הפנימי בצד החיצוני של שלפוחית השתן הפוכה עם שני זוגות של מדפים נקיים.
כאשר כל התאים כבר גירד, להכניס את הקצה unpulled של נימי זכוכית משך לתוך תקע הגומי של צינור שאפתן להתאים בחוזקה את הקצה הצר של קצה פיפטה מיליליטר אחד לתוך הקצה הפתוח השני של הצינור. התאימו היטב את הקצה הצר של פיפטה שאפתנית של שני מיליליטר לקצה הפתוח והרחב יותר של קצה החלילן המיליליטרי והמקום את מתלי התאים השרוטים תחת מיקרוסקופ ניתוח. באמצעות הגדלה של פי 20 עד 40, זהה את ה- IBCs כאגרגטים פלואורסצנטיים גדולים וטבול את הקצה המשובח של נימי הזכוכית בצינור טרי של PBS לשנייה אחת כדי להפחית את ספיגת נפח לא רצוי באמצעות פעולה נימית.
כאשר IBC של עניין כבר ממוקם, לאט להביא את הקצה הפתוח של הצינור נימי לכיוון IBC ולהחיל כוח יניקה קטן מאוד על פיפטה שאפתן להנחות את IBC לתוך נימי הזכוכית. לאחר מכן, להעביר את נימי ריק 1.5 צינור צנטריפוגה מיליליטר ולהחיל לחץ חיובי קל לגרש את טיפה IBC לתוך הצינור. בנוסף לאישור נוכחותו של IBC מבודד אחד בצינור האיסוף באמצעות המיקרוסקופ המ לנתח, טוהר IBC המבודד יכול להיות מאושר על ידי מיקרוסקופ קונפוקלים.
התאים המבודדים צריכים להכתים הן E.coli והן uroplakin צריך להיות בין 50 ל 120 מיקרומטר בגודל. לאחר הבידוד, ניתן לאשר את נוכחותם וכדאיותם של תאי החיידקים ב- IBC הבודד באמצעות כימות יחידה יוצרת מושבה או תגובת שרשרת פולימראז כמותית למקבילות גנומיות. יש לציין, תאי אפיתל לא מושפעים מבודדים עם אותו פרוטוקול אינם מדגימים כמויות לכימות של חיידקים.
יתר על כן, ניתוח תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך כמותי מאשר את נוכחותם של גנים חיידקיים במגוון של IBCs מבודדים ומגובים בנפרד. תמיד לוודא כי micropipette הפה יכול להרים ולגרש נוזל בקלות. אל תהססו לשנות את נימי או את המנגנון כולו אם micropipette הפה מרגיש occluded.
טכניקת מיקרופיטינג בפה זו מאפשרת לנו לחקור באופן ישיר ומפורש את האוכלוסיות תאיות הטופס במהלך UTI ניסיוני. ללא טכניקה זו, אוכלוסיות תאיים אלה יהיו מזוהמים בחיידקים חוץ-תאיים ונחיתות במספרם. כמה סוכנים זיהומיות אחרים עשויים להיות בקלות רבה יותר aerosolized או מועבר מאשר E.coli השתמשנו ביישום זה.
במקרים אלה, פקדים נוספים מסוימים עשויים אפוא להיות מוצדקים, כגון הוספת מסנן או הארכת הצינור, בהתאם ליישום בו נעשה שימוש. IBCs מבודדים באמצעות טכניקת micropipetting הפה זה עשוי לשמש בניתוחים אחרים במורד הזרם תא יחיד, כגון QRTPCR או רצף RNA.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאי אפיתל שלפוחית שתן בודדים ונגועים מתוך מודל מכרסמים של זיהום בדרכי השתן (UTI). טכניקה זו מאפשרת את המחקר של קהילות חיידקים תוך-תאיים (IBCs) ללא זיהום מחיידקים חוץ-תאיים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- מחלות זיהומיות
- ביולוגיה תאית
רקע
- קהילות חיידקים תוך-תאיים (IBCs) נמצאות הן בחולדות והן בחולים אנושיים עם UTI.
- טכניקת המיקרו-פיפטה האוראלי היא כיום השיטה היחידה לבידוד IBCs משתן חולדות נגועות.
- הבנת IBCs חיונית למחקר הפתוגנזה של UTIs.
- בידוד של IBCs יכול להקל על ניתוחים עוקבים כגון qPCR ורצף RNA.
מטרת המחקר
- לבודד IBCs בודדים ממודלים מכרסמים של UTI.
- לאפשר מחקר מפורט של האוכלוסיות התוך-תאיות הנוצרות במהלך UTIs.
- לספק שיטה אמינה למחקר זיהומים חיידקיים ברמת תא בודד.
שיטות בשימוש
- הכנת פיפטות זכוכית לבידוד תאים.
- מיצוי כירורגי של השלפוחית מחולדות נגועות.
- טכניקת מיקרו-פיפטה לבידוד IBCs מהשלפוחית.
- אימות של IBCs מבודדים באמצעות מיקרוסקופיה וטכניקות מולקולריות.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של IBCs שאושר באמצעות מיקרוסקופיה.
- תאים מבודדים שנצבעו חיובית עבור E. coli ואורופלקין.
- ניתוח כמותי אישר את נוכחותם של גנים חיידקיים ב-IBCs המבודדים.
- תאים לא נגועים לא הראו חיידקים שניתן לכמתם, מה שמאשר את שיטת הבידוד.
מסקנות
- טכניקת המיקרו-פיפטה האוראלי יעילה לבידוד IBCs.
- שיטה זו מאפשרת מחקר של אוכלוסיות חיידקים תוך-תאיות ללא זיהום.
- יישומים נוספים עשויים לכלול ניתוחים שונים ברמת תא בודד כדי להבין את הפתוגנזה של UTI.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Isolating single intracellular bacterial communities (IBCs) from murine urinary tract infection models enables mechanistic de-risking of host-pathogen interactions at cellular resolution. This approach supports target validation by providing purified, viable infected epithelial cells for downstream single-cell analyses, reducing confounding signals from extracellular bacterial populations. The protocol’s reliance on widely available materials and short time-to-isolation (~8 hours) enhances feasibility for early discovery workflows focused on antimicrobial target identification and phenotypic screening in infection models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating viable IBCs containing intracellular E. coli for functional target assessment.
- Operational Value: Provides a contamination-minimized system for clarifying bacterial persistence mechanisms within host cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantifiable, single-cell resolution data on bacterial gene expression and viability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (IBC-containing epithelial cells) for standardized downstream assays such as qPCR or RNA sequencing.
- Operational Value: Ensures assay readiness through isolation of nearly contaminant-free single cells, improving reproducibility in infection model screening.
- Scalability: Enables platform reuse across infection models where rare infected cells require isolation from heterogeneous mixtures.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by isolating IBCs from a murine UTI model that mirrors human intracellular bacterial community formation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates biomarker alignment by enabling detection of bacterial genes (e.g., via qRT-PCR) in individually isolated IBCs.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by confirming absence of quantifiable bacteria in uninfected epithelial controls, validating isolation specificity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of intracellular survival pathways, progressing to lead identification through single-cell analysis of isolated IBCs, and supporting preclinical validation via gene expression and viability profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating IBCs for study of intracellular bacterial populations without extracellular contamination.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible single-cell outputs suitable for compound evaluation in infection models.
- Analytics: Generates quantitative measurements (e.g., genomic equivalents via qPCR, CFU counts) that allow comparison of bacterial load and viability across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through disease-relevant IBC isolation from a murine UTI model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare infected cells from mixtures, applicable beyond UTIs to other intracellular pathogen models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through a low-cost, widely accessible micropipetting technique.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of antimicrobial targets using physiologically relevant infection models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing single-cell resolution data on intracellular bacterial persistence and gene expression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical procedures, sterile tissue handling, and micropipette manipulation.
- Depends on glass capillary preparation, UV sterilization, and dissection microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for consistent IBC isolation and downstream molecular analysis (e.g., qPCR, RNA sequencing).
- Involves adaptation considerations when applying the technique to other infection models or cell types with varying fragility or size.
- Includes practical limitations such as the biohazard risk of mouth micropipetting, which precludes use with highly infectious agents.
