Name: זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: למדו לזהות אנדוטוקסין בננו-חומרים באמצעות מבחני Lysate Amoebocyte Limulus (LAL). שיטה זו מספקת מסגרת סטנדרטית להערכת בטיחות תרופות ננו-רפואיות ולהבטחת עמידה בתקנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי כספים פדרליים של המכון הלאומי לסרטן, מכוני הבריאות הלאומיים, תחת חוזה HHSN261200800001E. התוכן של פרסום זה אינן משקפות בהכרח את ההשקפות או מדיניות של מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, ולא הזכיר של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים, או ארגונים מעיד על ממשלת ארה ב.

1. הכנת דוגמאות ננו-חלקיק
<ol><li>הכנת המדגם במחקר ב- LAL כיתה מים.</li>
	<li>אם ה-pH הדגימה מחוץ לטווח 6-8, להתאים את ה-pH באמצעות pyrogen ללא סודה קאוסטית או חומצה הידרוכלורית.</li>
	<li>באמצעות LAL כיתה מים להכין מספר דילולים המדגם במחקר. ודא כי דילול הגבוה ביותר לא יעלה על דילול מרבי חוקי (MVD). עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים אודות MVD שערוך.</li>
</ol>2. הכנת ריאגנטים משותף בין תבניות לל
<ol><li>לדלל נתרן הידרוקסידי מרוכז מניות באמצעות מים ריאגנט LAL ללא pyrogen להכין את הפתרון עובד-ריכוז של 0.1 ש</li>
	<li>לדלל מלאי חומצה הידרוכלורית מרוכזת באמצעות ללא pyrogen לל ריאגנט מים ולהכין הפתרון עובד-ריכוז סופי של 0.1 ש</li>
	<li>הכנת אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה (ס)<ol>
<li>לשקם ס להנדסה ולמדעיי המחשב על פי האישור של ניתוח המסופקים על ידי היצרן. הערה: עיין בסעיף הדיון עבור הערות חשובות בנוגע למידע הכלול באישור. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים לגבי מספר קטלוג ויישום של ניסוח של ביה ס נתון בתבניות LAL שונות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת הכימית לל<ol>
<li>לשקם הכימית לאל על פי האישור של ניתוח המסופקים על ידי היצרן. הערה: עיין בסעיף הדיון פרטים חשובים לגבי הכנה ריאגנט לל. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים לגבי מספר קטלוג ויישום של ניסוח ריאגנט LAL נתון בתבנית LAL שונים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. עכירות LAL Assay
<ol><li>הכנת הסטנדרטים כיול<ol>
<li>שימוש µL 900 LAL כיתה מים 100 µL של ביה ס, להכין כמה שיותר דילולים ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת כיול סטנדרטי עם טווח הריכוז מ 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.</li>
		<li>תחילה תווית צינורות ולהוסיף μL 900 LAL-כיתה מים לתוך כל שפופרת. לאחר מכן להוסיף 100 μL של solutionn של האיחוד האירופי/mL 10 להכין כיול סטנדרטי עם ריכוז של 1EU/mL.</li>
		<li>חזור על דילול 10-fold טורי כמתואר לעיל כדי להכין שלושה סטנדרטים כיול נמוכה יותר. ודא כי היה מוכן ארבעה סטנדרטים כיול ועד 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של פקדים איכות<ol>
<li>להכין בקרת איכות של האיחוד האירופי/mL 0.05 על ידי שילוב µL 50 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם µL 950 מים LAL-כיתה. הערה: עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים לגבי הכנה שליטה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של פקדים עיכוב/שיפור (חברת החשמל)<ol>
<li>להכין IEC עם ריכוז של האיחוד האירופי 0.05/mL על-ידי שילוב µL 25 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 µL 475 של nanomaterial הבדיקה לדילול נתון. הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח ניסיוני<ol>
<li>לאפשר את המכשיר להתחמם על-ידי הפעלת הוא כ 30 דקות מראש. הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 660 ננומטר כמו זה מתאים עכירות לל.</li>
		<li>היכנס על-ידי הקלדת את שם המשתמש והסיסמה.</li>
		<li>פתח את התוכנה (טבלה של חומרים) על-ידי לחיצה על הסמל המתאים על מסך המחשב.</li>
		<li>בחר לאסוף נתונים במסך הבית של התוכנה. הזן את המידע קבוצת הבדיקה מזהה ונתונים לחלל המתאים בכרטיסייה ' כללי ' במסך הבית.</li>
		<li>לחץ על הכרטיסיה חומרה לבחור את סוג מכשיר מתוך התפריט הנפתח.</li>
		<li>הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 660 ננומטר כפי שהוא מתאים עכירות לאל על-ידי בחירת השיטה עכירות לל.</li>
		<li>ודא כי המספר הסידורי, מזהה המערכת ומידע יציאה טורית מופיעים על המסך. לחץ על אישור. לחץ על אישור שוב כדי לאשר.</li>
		<li>הזן את מזהה מדגם באותו סדר שהמדגם נבדק. השתמש ללחצני ברירת מחדל כדי להזין את שליטה שלילי, דגימות עיקול ו מבחן סטנדרטי.</li>
		<li>להכין צינורות כפולים עבור כל דגימה ולהוסיף 200 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של שליטה שלילי (מים), סטנדרטים כיול, בקרת איכות, חברת החשמל ו מבחן חלקיקים לתוך צינורות זכוכית שכותרתו מראש.</li>
		<li>להוסיף 50 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של ריאגנט LAL הראשון הבקבוקון הבדיקה, מערבולת זה בקצרה, והוספה לתוך מבחן חריץ של הקרוסלה כלי. אם היחס 1:1, הנפח של הכימית LAL לא 100 µL.</li>
		<li>חזור על הפעולות המתוארות לעיל לקבלת דוגמאות אחרות. תהליך דוגם אחד בכל פעם. הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הדפסות כסף לל
<ol><li>הכנת סטנדרטים כיול<ol>
<li>שימוש µL 900 LAL כיתה מים 100 µL של ביה ס, להכין כמה שיותר דילולים ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת כיול סטנדרטי עם ריכוז של האיחוד האירופי 1/mL.</li>
		<li>באמצעות מים כיתה LAL µL 900 ו 100 µL של הכיול האירופי/mL 1 רגיל, להכין תקן כיול השני-ריכוז של האיחוד האירופי 0.1/mL.</li>
		<li>חזור על דילול 10-fold טורי כמתואר לעיל כדי להכין שני סטנדרטים כיול נמוכה יותר. ודא כי היה מוכן ארבעה סטנדרטים כיול ועד 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת פקדים איכות.<ol>
<li>להכין בקרת איכות של האיחוד האירופי/mL 0.05 על ידי שילוב µL 50 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם µL 950 מים LAL-כיתה. הערה: עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים לגבי הכנה שליטה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של פקדים עיכוב/שיפור (חברת החשמל)<ol>
<li>הכן האיחוד האירופי 0.05/mL על ידי שילוב של 25 μL של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם μL 475 של מבחן nanomaterial. הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח ניסיוני<ol>
<li>לאפשר את המכשיר להתחמם על-ידי הפעלת הוא כ 30 דקות מראש. הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 405 ננומטר כמו זה מתאים עכירות לל.</li>
		<li>פתח את התוכנה על ידי לחיצה על הסמל המתאים על מסך המחשב. היכנס על-ידי הקלדת את שם המשתמש והסיסמה.</li>
		<li>בחר לאסוף נתונים במסך הבית של התוכנה. הזן מידע קבוצת זהות ונתונים מבחן לחלל המתאים בכרטיסייה ' כללי ' במסך הבית.</li>
		<li>לחץ על הכרטיסיה חומרה לבחור את סוג מכשיר מתוך התפריט הנפתח. לבחור את המכשיר.</li>
		<li>ודא כי המספר הסידורי, מזהה המערכת ומידע יציאה טורית מופיעים על המסך. לחץ על אישור. לחץ על אישור שוב כדי לאשר.</li>
		<li>הזן את מזהה מדגם באותו סדר שהמדגם נבדק. השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין בקרה שלילית, דגימות עיקול ו מבחן סטנדרטי.</li>
		<li>להכין צינורות כפולים עבור כל דגימה ולהוסיף 200 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של שליטה שלילי (מים), סטנדרטים כיול, בקרת איכות, חברת החשמל ו מבחן חלקיקים לתוך צינורות זכוכית שכותרתו מראש.</li>
		<li>להוסיף 50 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של ריאגנט LAL הראשון הבקבוקון הבדיקה, מערבולת זה בקצרה, והוספה לתוך מבחן חריץ של הקרוסלה כלי. אם היחס 1:1, הנפח של הכימית LAL לא 100 µL.</li>
		<li>חזור על הפעולות המתוארות לעיל לקבלת דוגמאות אחרות. תהליך דוגם אחד בכל פעם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ג'ל-קריש לל
הערה: זו assay מזהה הנוכחות של endotoxins במדגם בהתבסס על התצפית הויזואלית גילוי של קריש דם בצינור התגובה. השלבים ניסיוני שיפורטו להלן. להשתמש סדין הספסל כדי לתעד את התוצאות. גיליון ספסל זה לא חובה, דרכים אחרות של הקלטה התוצאות assay מקובלים גם. דוגמה כזו גיליון ספסל מסופק בחומרים משלים לנוחיות הקורא. למבדה (l) היא הרגישות של ג'ל-קריש וזמינותו והיא האיחוד האירופי 0.03 נקודות/mL.
<ol><li>תווית צינורות התגובה רבים לפי הצורך כדי להתאים את מספר הבדיקה שנותחה דוגמאות. עיין בגיליון ספסל לקבלת פרטים אודות מספר משכפל בשימוש שלב 1, שלב 2, שלב 3 מתוך וזמינותו.</li>
	<li>ΜL 100 aliquot דגימת מים, פקדים או מבחן למחזור.</li>
	<li>הכן של ביה ס כך הריכוז הסופי שווה ל- 4λ.</li>
	<li>לשלב 100 μL של תקן הנ עם μL 100 דגימת מים או מבחן כדי להשיג את הריכוז הסופי של ביה ס של 2λ. חזור עוד שלוש פעמים כדי להשיג למדא, חצי-למבדה, רבע למדא.</li>
	<li>ודא כי הטמפרטורה באמבט מים היא 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להוסיף 100 μL של lysate לכל מבחנה, מערבולת בקצרה ומניחים על האצטבה עם כל הקברים לאמבט מים לשעה.</li>
	<li>היפוך ברכבת התחתית עם תנועה חלקה.</li>
	<li>תוצאות לתעד באופן ידני באמצעות "+" (חברת קריש) או "–" (אין קריש דם או קריש דם חופשי) בגיליון ספסל.</li>
	<li>להמשיך עם הניתוח על פי ה USP ההימור 854; להשתמש בגליון ספסל תמיכה חומר</li>
</ol>

<ol><li>Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Mechanisms+Governing+Innate+Inflammatory+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+%26+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses.</a> Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).</li>
<li>Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+TLR4+signaling+that+lead+to+increased+susceptibility+to+infection+in+humans%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endotoxin+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll+receptors%2C+CD14%2C+and+macrophage+activation+and+deactivation+by+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS.</a> Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).</li>
<li>US Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bacterial+Endotoxins+Test%22">Bacterial Endotoxins Test</a>. , (2011).</li>
<li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFDA%2C+U+%22Guidance+for+Industry%3A+Pyrogen+and+Endotoxins+Testing%3A+Questions+and+Answers%22">Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers</a>. , (2012).</li>
<li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFDA%2C+U+%22Endotoxin+Testing+Recommendations+for+Single-Use+Intraocular+Ophthalmic+Devices%22">Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices</a>. , (2015).</li>
<li>Fennrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+70+years+of+pyrogen+detection%3A+Current+state+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).</li>
<li>Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+biosensor+based+diagnosis+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).</li>
<li>Solano, G., Gomez, A., Leon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+endotoxins+in+equine-derived+snake+antivenoms%3A+Comparison+of+the+USP+pyrogen+test+and+the+Limulus+Amoebocyte+Lysate+assay+%28LAL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL).</a> Toxicon. , 13-18 (2015).</li>
<li>Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+-+a+source+of+bacterial+endotoxin+detector+in+liquid+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22International+Food+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples.</a> International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).</li>
<li>Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saline+and+buffers+minimize+the+action+of+interfering+factors+in+the+bacterial+endotoxins+test%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+immunotoxicity+studies+of+nanotechnology-formulated+drugs%3A+Challenges%2C+considerations+and+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy.</a> Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambiguities+in+applying+traditional+Limulus+amebocyte+lysate+tests+to+quantify+endotoxin+in+nanoparticle+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations.</a> Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+method+for+endotoxin+detection+depends+on+nanoformulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation.</a> Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).</li>
<li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+and+Some+Practical+Solutions+to+Overcome+Nanoparticle+Interference+with+LAL+Assays+and+to+Avoid+Endotoxin+Contamination+in+Nanoformulations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations.</a> Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).</li>
<li>Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+Removal+from+Escherichia+coli+Bacterial+Lysate+Using+a+Biphasic+Liquid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).</li>
<li>Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+bacterial+endotoxins+in+ophthalmic+viscosurgical+device+materials+by+direct+analysis+in+real+time+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).</li>
<li>Uhlig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+3-hydroxy+fatty+acids+as+environmental+markers+of+endotoxin+using+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).</li>
<li>Smulders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+of+nanoparticles+by+endotoxin%3A+evaluation+of+different+test+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods.</a> Particle and Fibre Toxicology. 9, 41(2012).</li>
<li>NCL. NCL assay cascade. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols">https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols</a> (2015).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nanoparticle+immunotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nanoparticle immunotoxicity.</a> Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).</li>
<li>Borton, L. K., Coleman, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material-mediated+pyrogens+in+medical+devices%3A+Applicability+of+the+in+vitro+Monocyte+Activation+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test.</a> Altex. , (2018).</li>
<li>Stoppelkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speeding+up+pyrogenicity+testing%3A+Identification+of+suitable+cell+components+and+readout+parameters+for+an+accelerated+monocyte+activation+test+%28MAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Testing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).</li>
<li>Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+rabbit+pyrogen+test+for+assessing+meningococcal+OMV+based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines.</a> Altex. 33 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxil%28R%29--the+first+FDA-approved+nano-drug%3A+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).</li>
<li>Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitative+evaluation+of+endotoxin+contamination+in+nanoparticle+formulations+by+LAL-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays.</a> Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).</li>
<li>FDA, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFDA%2C+U+%22Guidance+for+Industry%3A+Estimating+the+Maximum+Safe+Starting+Dose+in+Initial+Clinical+Trials+for+Therapeutics+in+Adult+Healthy+Volunteers%22">Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers</a>. , (2005).</li>
<li>Mohan, P., Rapoport, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+as+a+molecular+nanotheranostic+agent%3A+effect+of+doxorubicin+encapsulation+in+micelles+or+nanoemulsions+on+the+ultrasound-mediated+intracellular+delivery+and+nuclear+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking.</a> Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).</li>
<li>Dabbagh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-melting-point+polymeric+nanoshells+for+thermal-triggered+drug+release+under+hyperthermia+condition%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hyperthermia%22%5BJournal%5D)">Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition.</a> International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+the+use+of+commercial+LAL+assays+for+the+analysis+of+endotoxin+contamination+in+metal+colloids+and+metal+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles.</a> Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin+%28lipopolysaccharide%29+binds+to+the+surface+of+gold+nanoparticles%2C+interferes+with+biocorona+formation+and+induces+human+monocyte+inflammatory+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation.</a> Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במידע הנמסר פרוטוקול זה תואר קודם15,26 ומסתמך על מספר מסמכי רגולציה שפורסם על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA או ה-FDA) ואת ארצות הברית פרמקופיאה (USP)4 , 5 , 6 , 27, והוא גם זמין באתר NCL20 בפרוטוקולים STE1.2 (עכירות LAL), STE1.3 (LAL ג'ל-clot) ו STE1.4 (LAL הדפסות כסף).
מבחן-נ...

אנדוטוקסין היא אבן בניין של הקיר תא החיידק גראם שליליים1,2. זה יכול להפעיל את התאים החיסוניים ב מאוד נמוכה (picogram) ריכוזים1,2. המתווכים proinflammatory (ציטוקינים, לאוקוטריאנים, eicosanoids, וכו ') המיוצר על ידי תאי בתגובה אנדוטוקסין אחראים קדחת, תת לחץ דם, יתר לחץ דם, בעיות בריאות חמורות יותר, כולל אי ספיקת איברים מרובים 1 , 2 , 3. חומרת בתיווך החיסון תופעות המופעלות על-ידי אנדוטוקסין תלוי מחריפותו נקבעים על-ידי אנדוטוקסין הרכב ואת מבנה ומדד אנדוטוקסין הבינלאומי יחידות (IUs או EUs)3. המספר של יחידות אלה לכל קילוגרם של משקל גוף משמשת להגדרת מנה פירוגני הסף של אנדוטוקסין. מינון זה הוא ש-5 האיחוד האירופי לק"ג למוצרים סמים מנוהל באמצעות כל נתיבי אבל המסלול במחלה. סמים עצומות למטר מרובע של פני השטח של הגוף, נוזלים תוך-עיני, radiopharmaceuticals מוצרים מנוהל באמצעות מסלול במחלה יש מנה פירוגני סף שונות, אשר הוא 100 האיחוד האירופי/m2, האיחוד האירופי 0.2/mL, האיחוד האירופי 175/V (איפה V נפח של המוצר מיועד עבור ניהול), ו- 0.2 האיחוד האירופי לק"ג, בהתאמה4. פרטים נוספים אודות המנה פירוגני מסף סמים מוצרים והתקנים שונים הינם מסופקים, נדון במקום אחר4,5,6.
חיות להשתנות באופן נרחב את רגישותם בתיווך אנדוטוקסין תגובות. בני אדם, קופים, ארנבים הם בין המינים רגישים ביותר ביותר endotoxins3. כדי למנוע תופעות לוואי בתיווך אנדוטוקסין בחולים ולמנוע המסקנות לא מדויק של רעילות פרה ולימודי היעילות, זה חיוני כדי לזהות ולכמת endotoxins ניסוחים כיתה-קליניים ומחקרים קליניים מראש שני במדויק. מספר שיטות זמין כרגע ניתן להשיג משימה זו. אחד מהם הוא וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), אשר נמצא בשימוש נפוץ ברחבי העולם מוצרים ביו מסך עבור פוטנציאל אנדוטוקסין לזיהום גם באשר לזהות זיהומים חיידקיים7,8,9. Lysate הוא מוכן מן amoebocytes, התאים הנוכחי בדם של הפרסה סרטנים Limulus פוליפמוס המתגוררים לחוף המזרחי של יבשת צפון אמריקה7. מעניין, יש כמה מינים שונים של סרטנים פרסה (Tachypleus גיגס , Tachypleus tridentatus) ב אסיה10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (טל) משמש במספר מדינות אסיה איתור אנדוטוקסין הדומה איך LAL משמש cuntries10. Lysates (LAL וטל) מכילים קבוצה של חלבונים המקנים בעת הפעלת פרוטאז פעילות. אחד החלבונים האלה, הגורם כביכול C מופעל בעת מגע עם אנדוטוקסין. C גורם שהופעל cleaves Factor B, אשר בתורו גם הופך פרוטאז ודבק אנזים קרישת pro כדי לייצר אנזים קרישת דם. התוצאה של תגובות שרשרת הזאת היא היווצרות של ג'ל, עלייה של עכירות מדגם ו, בנוכחות מצע הדפסות כסף, המראה של מוצר צבעוניים, אשר לשמש בסיס ג'ל-קריש דם, עכירות, מבחני הדפסות כסף, בהתאמה. אמנם יש תבנית LAL אין חובה, של מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) מסביר ההדרכה עבור תעשיית המסמך, כי במקרה של אי-התאמה בתוצאות הבדיקה בין פורמטים שונים לל, ההחלטה בהתבסס על וזמינותו ג'ל-קריש5 .
רבים נפוץ כימיקלים המעבדה (למשל., EDTA), סמים ידוע מוצרים (לדוגמה פניצילין) להפריע LAL מבחני11. ההפרעות מזוהה בדרך כלל על-ידי הערכת ההתאוששות של אנדוטוקסין תקן עלה בריכוז ידוע לתוך פתרון המכיל את החומר. אם השחזור ספייק הוא פחות מ- 50% או יותר מאשר 200%, אז התוצאה של LAL assay עבור החומר מבחן נתון אינו חוקי עקב עיכוב או שיפור, בהתאמה4. ניסוחים המבוסס על ננו-טכנולוגיה מורכבים לעיתים קרובות ומשבשים LAL באמצעות מגוון רחב של מנגנונים12,13,14. גישות רבות תוארו להתגבר על ההפרעות: שיחזור מדגם מאגרים ספציפיים, פיתחה, חלבון איון על ידי חימום, הרס של חומרי חלול מבוססי השומנים על ידי חימום ומשלימות את הדגימה. עם עודף קטיונים דו ערכיים5,12,13,14,15. שיטות אלטרנטיביות במצבים כאשר לא ניתן להתגבר על הפרעות LAL גם תוארו: אליסה, תא כתב HEK-TLR4 קו assay, ספקטרומטר מסה16,17,18, 19.
במסמך זה, מתוארים הליכים ניסיוני לעריכת ג'ל-קריש דם, עכירות, מבחני LAL הדפסות כסף. מבחני אלה הינם גם זמינים על אתר ננוטכנולוגיה אפיון מעבדה (NCL)20 בפרוטוקולים STE1.2 (עכירות LAL), STE1.3 (LAL ג'ל-clot) ו STE1.4 (LAL הדפסות כסף). מומלץ לבצע לפחות שתי תבניות שונות לאפיון הננו-ניסוח זהה. כאשר תוצאות של עכירות, הדפסות כסף LAL מסכימים, התוצאות ג'ל-קריש דם נחשבים5. כאשר התוצאות של שתי תבניות LAL מסכימים, נוספים הם ממצאי מחקרים באמצעות מונוציט הפעלת מבחן (MAT) או ארנב pyrogen מבחן (RPT) כדי לוודא LAL ערכו21. חשוב לציין כי כל שיטה המשמש לצורך זיהוי אנדוטוקסין לפירוגניות הערכה יש יתרונות ומגבלות21,22,23,24. הכרה במגבלות של ההליך שימוש כדי לאפיין את ניסוח ננוטכנולוגיה נתון חיוני להשגת הצדקה מדעית לשימוש של האופטימלית עבור הננו-ניסוח זה ההליך.
במחקר זה, שימש PEGylated liposomal דוקסורוביצין ניסוח nanoparticle מודל. ניסוח זה אושר על ידי FDA בארה ב בשנת 1995 ומשמשת לטיפול סרטן מטופלים ברחבי העולם25.

<table><tbody><tr><td><חזק>עכירות LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>בעת הצורך, הוא משמש להתאמת pH הדגימה להיות בין 6-8</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td>בעת הצורך, הוא משמש להתאמת pH הדגימה להיות בין 6-8</td></tr><tr><td>LAL Reagent</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>T0051</td><td>ניתן להשתמש במגיב זה עם עכירות מבחן רק</td></tr><tr><td>בקרה אנדוטוקסין סטנדרטי</td><td>עמיתים של קייפ קוד</td><td>E0005</td><td>ניתן להשתמש במגיב זה עם עכירות ובדיקות קרישי ג'ל</td></tr><tr><td>מים בדרגת LAL</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>ניתן להשתמש במגיב זה עם כל פורמט LAL</td></tr><tr><td>Glucashield Buffer</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>משמש למניעת תגובה חיובית כוזבת מבטא-גלוקנים</td></tr><tr><td>צינורות דילול זכוכית חד פעמיים ללא אנדוטוקסין 12 x 75 מ"מ</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>ניתן להשתמש בצינורות אלה עם כל שלושת הבדיקות</td></tr><tr><td>צינורות תגובת זכוכית חד פעמיים ללא אנדוטוקסין 8 x 75 מ"מ</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TK100</td><td>ניתן להשתמש בצינורות אלה עם עכירות ובדיקות כרומוגניות</td></tr><tr><td>טיפים נטולי פירוגן עם נפחים 0.25 ו-1.0 מ"ל</td><td>RAININ</td><td>PPT25, </td><td>טיפים ופיפטות PPT10 עלולים לספוג אנדוטוקסין ולשחרר שטיפות המפריעות לבדיקת LAL. טיפים אלה של RAININ משמשים מכיוון שהביצועים האופטימליים שלהם בבדיקת LAL אומתו ואושרו</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה נטולי פירוגן, 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>ניתן להשתמש בחומרים מקבילים אחרים</td></tr><tr><td>קומביטיפים בתשלום פירוגן, 5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>ניתן להשתמש בחומרים מקבילים אחרים</td></tr><tr><td>Repeat pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>ניתן להשתמש באספקה שווה ערך אחרת</td></tr><tr><td>מיקרוצטריפוגה</td><td>כל מותג כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במקרר, 2-8 C</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>מקפיא, -20 C</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Pyros Kinetix או Pyros Kinetix Flex reader</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>PKF96</td><td>ניתן להשתמש במכשירים אחרים. עם זאת, ריאגנטים LAL ותקני אנדוטוקסין המשמשים בבדיקה זו עשויים לדרוש אופטימיזציה. כאשר נעשה שימוש במכשור אחר, אנא פנה ליצרני המכשירים וערכות LAL לקבלת הוראות</td></tr><tr><td><חזק>בדיקת LAL כרומוגנית </חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrochrome LAL Reagent</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>CG1500-5</td><td>מגיב זה הוא ספציפי ל-Chromogenic Assay</td></tr><tr><td>Control Endotoxin Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>EC010</td><td>תקן זה שונה מזה המשמש לעכירות וקרישי ג'ל LALs; הוא מותאם לביצועים מיטביים בבדיקה הכרומוגנית</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>S2770</td><td>בעת הצורך, הוא משמש להתאמת pH הדגימה להיות בין 6-8</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>סיגמא</td><td>H9892</td><td>בעת הצורך, הוא משמש להתאמת pH הדגימה להיות בין 6-8</td></tr><tr><td>מים בדרגת LAL</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>ניתן להשתמש במגיב זה עם כל מאגר Glucashield בפורמט LAL</td></tr><tr><td></td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>משמש למניעת תגובה חיובית כוזבת מבטא-גלוקנים</td></tr><tr><td>צינורות דילול זכוכית חד פעמיים ללא אנדוטוקסין 12 x 75 מ"מ</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>ניתן להשתמש בצינורות אלה עם כל שלושת הבדיקות</td></tr><tr><td>צינורות תגובת זכוכית חד פעמיים ללא אנדוטוקסין 8 x 75 מ"מ</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TK100</td><td>ניתן להשתמש בצינורות אלה עם עכירות ובדיקות</td></tr> <tr><td>כרומוגניותטיפים נטולי פירוגן עם נפחים 0.25 ו-1.0 מ"ל</td><td>RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>טיפים ופיפטות עלולים לספוג אנדוטוקסין ולשחרר שטיפות המפריעות לבדיקת LAL. טיפים אלה של RAININ משמשים מכיוון שהביצועים האופטימליים שלהם בבדיקת LAL אומתו ואושרו</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה נטולי פירוגן, 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>ניתן להשתמש בחומרים מקבילים אחרים</td></tr><tr><td>קומביטיפים בתשלום פירוגן, 5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>ניתן להשתמש בחומרים מקבילים אחרים</td></tr><tr><td>Repeat pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>ניתן להשתמש באספקה שווה ערך אחרת</td></tr><tr><td>מיקרוצטריפוגה</td><td>כל מותג כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במקרר, 2-8 C</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>מקפיא, -20 C</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Pyros Kinetix או Pyros Kinetix Flex reader</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>PKF96</td><td>ניתן להשתמש במכשירים אחרים. עם זאת, ריאגנטים LAL ותקני אנדוטוקסין המשמשים בבדיקה זו עשויים לדרוש אופטימיזציה. כאשר נעשה שימוש במכשור אחר, אנא פנה ליצרני המכשירים וערכות LAL לקבלת הוראות</td></tr><tr><td><חזק>Gel-Clot LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAL Reagent</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>G5003</td><td>מגיב זה הוא ספציפי לבדיקת קריש הג'ל</td></tr><tr><td>Control Endotoxin Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>E0005</td><td>ניתן להשתמש במגיב זה עם בדיקות עכירות וקרישי ג'ל</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>S2770</td><td>במידת הצורך, הוא משמש להתאמת pH הדגימה להיות בין 6-8</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td>בעת הצורך, הוא משמש להתאמת pH הדגימה להיות בין 6-8</td></tr><tr><td>מים בדרגת LAL</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>ניתן להשתמש במגיב זה עם כל פורמט LAL</td></tr><tr><td>Glucashield Buffer</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>משמש למניעת תגובה חיובית כוזבת מבטא-גלוקנים</td></tr><tr><td>צינורות דילול זכוכית חד פעמיים ללא אנדוטוקסין 12 x 75 מ"מ</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>ניתן להשתמש בצינורות אלה עם כל שלושת הבדיקות</td></tr><tr><td>צינורות תגובת זכוכית חד פעמיים ללא אנדוטוקסין 10 x 75 מ"מ</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TS050</td><td>צינורות אלה מיועדים לשימוש עם בדיקת קרישי ג'ל</td></tr><tr><td>טיפים נטולי פירוגן עם נפחים 0.25 ו-1 מ"ל</td><td>RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>טיפים ופיפטות עלולים לספוג אנדוטוקסין ולשחרר שטיפות המפריעות לבדיקת LAL. טיפים אלה של RAININ משמשים מכיוון שהביצועים האופטימליים שלהם בבדיקת LAL אומתו ואושרו</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה נטולי פירוגן, 2.0 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>ניתן להשתמש בחומרים מקבילים אחרים</td></tr><tr><td>קומביטיפים בתשלום פירוגן, 5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>ניתן להשתמש בחומרים מקבילים אחרים</td></tr><tr><td>Repeat pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td><td>ניתן להשתמש באספקה שווה ערך אחרת</td></tr><tr><td>מיקרוצטריפוגה</td><td>כל מותג כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במקרר, 2-8 C</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>מקפיא, -20 C</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג</td></tr> אמבט <tr><td>מים, 37 C</td><td>כל מותג</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מותג, עם זאת, חשוב לכבות את זרימת המים או להשתמש באמבט מים שאינו במחזור מכיוון שזרימת המים תשפיע על היווצרות הקרישים ותוביל לתוצאות שליליות כוזבות</td></tr></tbody></table>

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-nano באמצעות מבחני lysate (lal) amoebocyte limulus

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

כאשר נוכח מוצרים פרמצבטיים, אנדוטוקסין רכיב הקיר תא החיידק גראם שליליים (הנקרא לעתים קרובות גם ליפופוליסכריד) יכול לגרום דלקת, חום, היפו - או יתר לחץ דם, במקרים קיצוניים, יכול לגרום נזק לרקמות ו עוגב זה ייתכן להיות קטלני. כמויות אנדוטוקסין במוצרי תרופות, לכן, הם מווסתים. בין השיטות הזמינות אנדוטוקסין זיהוי, כימות, וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) הוא נפוץ ברחבי העולם. בעוד כל מוצר התרופות עלולות להפריע וזמינותו לל, ננו-ניסוחים מייצגים אתגר מסוים עקב המורכבות שלהם. מטרת מאמר זה היא לספק מדריך מעשי חוקרים מנוסים באומדן endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים וסמים ניסח ננו-חלקיק. במסמך זה, המלצות מעשיות לביצוע שלוש תבניות LAL כולל עכירות, הדפסות כסף, ג'ל-קריש מבחני נידונות. מבחני אלה יכול לשמש כדי לקבוע אנדוטוקסין זיהום מוצרים מבוססי ננו-טכנולוגיה תרופות, חיסונים, adjuvants.

הדוגמה של נתונים שנוצרו לאחר בדיקות ניסוח זה מבחני LAL מוצג בטבלה 1. PEGylated liposomal דוקסורוביצין התערב עם הדפסות כסף LAL-דילול 5. עם זאת, הפרעה זו הוכרע על ידי דילולים רבתי. שחזור ספייק היה בין 50 ל- 200%, כאשר ניסוח זה נבחנה ב דילולים 50 ו-500 עכירות ו לל הדפסות כסף, כמו גם דילול 5 בעכירות לל. כאשר הוא מותאם על ידי הגורם דילול, התוצאות היו עקביות בין דילולים, בשני מבחני. יתר על כן, התוצאות היו עקביות בין התבניות assay שלוש.
<table border="1" fo:keep-together.wit...

זיהוי של endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים מייצג אחד האתגרים הגדול ביותר בתחום של ננו-רפואה. כאן, אנו מציגים חקר מקרה המתארת את המסגרת המורכבת LAL שלושה פורמטים שונים כדי להעריך את פוטנציאל זיהום אנדוטוקסין בחלקיקים.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות בתחום הרפואי על בטיחות של תרופות ננו. היתרונות של טכניקה זו היא כי הוא סטנדרטי, והוא משמש ברחבי העולם להערכת מוצרים, כדי ננו תרופות. הדגמה של ההליך, יהיה בארי נוין, במעבדה לאפיון טכנולוגי ננו.להכנת תקן כיול, השתמש ב- 900 מיקרוליטרים של לימולוס אמבוציטים ליסאט, או מים ברמה LAL. ו-100 מיקרוליטרים של אנדוטוקסין סטנדרטי לבקרה, כדי להכין כמה דילול ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת תקן כיול עם ריכוז של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר. לאחר מכן, באמצעות 900 מיקרוליטרים של מים בדרגת LAL, ו-100 מיקרוליטרים של יחידת אנדוטוקסין אחת לכל תקן כיול מיליליטר, הכינו תקן כיול שני, בריכוז של יחידת אנדוטוקסין 0.1 למיליליטר.לאחר מכן חזור על הדילול הסידורי פי עשרה כדי להכין שני תקני כיול נמוכים יותר. כדי להשיג בסך הכל ארבעה תקני כיול, החל מ- 0001 ליחידת אנדוטוקסין אחת לכל מיליליטר. כדי להכין יחידת אנדוטוקסין 05 לבקרת איכות מיליליטר, משלב 50 מיקרוליטר של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של פתרון אנדוטוקסין סטנדרטי בקרה, עם 950 microliters של מים בדרגה LAL.הבא בתוכנה בחר את הגדרות הכלי וצור את התבנית. בחר לאסוף נתונים והזן את מזהה הבדיקה ואת קבוצת הנתונים בכרטיסיה כללי. תחת הכרטיסיה חומרה, בחר את סוג הכלי ואת פעולת השירות LAL וודא שמספר סידורי, מזהה המערכת ומידע היציאה הטורית מופיעים על המסך.לחץ על אישור פעמיים כדי לאשר את בחירת המכשיר, ואת התקשורת עם המכשיר, והזן את מזהה הדגימה באותו סדר שבו הדגימות ייבדקו. לאחר מכן השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין את העקומה הסטנדרטית של הפקד השלילי ולבדוק דגימות. הוסף את עוצמת הקול המתאימה של תקני כיול בקרה שליליים, ואת בקרת האיכות לצינורות זכוכית כפולים המסווים מראש.ולהוסיף את הנפח המתאים של LAL למבחן הנתעב הראשון. Vortex הנתעב בקצרה, ומ מניחים את הבקבוקון לתוך חריצי הבדיקות המתאימים בקרוסלה המכשיר. לפני טעינת הדגימות, לבצע מספר דילולים של חומר ננו הבדיקה בתוך דילול תקף מקסימלי כפי שהוכח.כדי להכין יחידת אנדוטוקסין 05 למיליליטר של בקרת שיפור עיכוב, לשלב 25 microliters של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של פתרון אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה, עם 475 microliters של חומר ננו הבדיקה בדילול נתון. לאחר המערבולת, לטעון את פקדי שיפור החדשנות המתאימים, ואת דגימות המחקר unspiked לתוך המכשיר. ואז aliquot unspiked וחומרי ננו ממוסקרים בדילול מסוים לתוך צינורות מסומנים מראש.לפני המערבולת, וטעינה לתוך קרוסלה המכשיר. כדי לבצע LAL ג'ל קריש, להכין אנדוטוקסין תקן בקרה לריכוז סופי של ארבעה lambda, ולשלב 100 microliters של תקן, עם 100 microliters של מים, או מדגם בדיקה כדי להשיג ריכוז סופי של אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה שני lambda. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של לי לסין לכל דילול למדה.Vortex הצינורות לזמן קצר, ולה מניחים את מתלה של צינורות לתוך 37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, להפוך את הצינורות עם תנועה חלקה, באופן ידני להקליט את התוצאות באמצעות פלוס עבור קריש מוצק, ומינוס ללא קריש, או קריש רופף. בניתוח מייצג זה, PEGylated ליפוזומלי דוקסורוביצין הפריע LAL כרומוגני בדילול חמש, אולם הפרעה זו התגברה בדילול גבוה יותר.התאוששות ספייק היה בין 50 ל 200% כאשר הניסוח נבדק בדילול 50 ו 500 ב LAL turbidity וכרומוגנית, כמו גם בדילול חמש, ב LAL turbidity. כאשר הותאמו על ידי גורם הדילול, התוצאות היו עקביות בין הזיות בשני החיבורים. יתר על כן, התוצאות היו עקביות בין שלושת פורמטים החיבור.זכור כי לכל מדגם יש מגוון משלו של דילולים, כל פורמט LAL משתמש בתקן הבקרה שלו ב- doxin ו- lysate, ושצינורות המשמשים להכנת הדילולים, ולבצע תגובה שונה עבור כל חיבור LAL. עבור הליך זה שיטות אחרות כמו ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על חומר לאחר התפתחותו, טכניקה זו סללה את הדרך עבור התפרים ואת התחום של ננו רפואה, לחקור את היישומים הרפואיים של ננו טכנולוגיה ניסח תרופות בבני אדם, מודלים קליניים כולל אך לא מוגבל פרימטים שאינם אנושיים, ארנבות, כלבים, וחולדות. אל תשכח כי עבודה עם דוקסין יכול להיות מסוכן מאוד ואת אמצעי הזהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

detection-endotoxin-nano-formulations-using-limulus-amoebocyte-lysate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון וידאו זה מתאר את הפורמט הטורבידימטרי של בדיקת Limulus amoebocyte lysate, או LAL, כדי להעריך זיהום אנדוטוקסין בננו-פורמולציות דוקסורוביצין ליפוזומליות PEGylated. העכירות של התמיסה בעקבות התגובה של האנדוטוקסין עם מגיב LAL מסייעת להעריך את האנדוטוקסין בדגימה.

Turbidimetric Limulus Amoebocyte Lysate Assay: טכניקה לזיהוי וכימות זיהום אנדוטוקסין בתרופות ננו

סרטון זה מתאר בדיקת קריש ג'ל כדי לקבוע את נוכחותם של אנדוטוקסינים חיידקיים בננו-פורמולציות באמצעות Limulus Amoebocyte Lysate שמקורו בתאי הדם של סרטני פרסה. הבדיקה מסייעת לבדוק זיהום אנדוטוקסין של מוצרים פרמצבטיים, כולל פורמולציות מבוססות ננו.

בדיקת ג'ל-קריש לימולוס אמבוציטים ליזט: שיטה לזיהוי אנדוטוקסין חיידקי בפורמולציות ננו-חלקיקים

סרטון זה מדגים בדיקה לבחינת הפעילות התלויה בקולטן דמוי אגרה (TLR) של גורמי השעתוק גורם גרעיני-קאפה-B (NF-κB) וחלבון מפעיל -1 (AP-1) במקרופאגים. ה-TLRs מפעילים מפל איתות פרו-דלקתי בעת זיהוי דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק (DAMPs), ומפעילים NF-κB ו-AP-1. המקרופאגים המהונדסים מייצרים אנזים אלקליין פוספטאז עוברי מופרש (SEAP) בהפעלת NF-κB ו-AP-1, אשר מזוהה באמצעות תגובה כרומוגנית.

בדיקה עבור NF-&kcy--תלוי TLR;B/AP-1 איתות גורם שעתוק במקרופאגים

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת תאים של כתב לסינון ננו-חלקיקים ביו-אקטיביים פוטנציאליים המעכבים איתות קולטן דמוי אגרה (TLR). הבדיקה כוללת החדרת ליפופוליסכרידים (LPS) מעורבבים עם כלאיים של ננו-חלקיקי פפטיד זהב למקרופאגים המבטאים את חלבוני הכתב - פוספטאז אלקליין עוברי מופרש (SEAP) ולוציפראז. הפחתת אות ה-TLR המושרה על ידי LPS בתיווך ההיברידים נקבעת על ידי מדידת אותות המדווח.

בדיקה לסינון ננו-חלקיקים ביו-אקטיביים לעיכוב איתות קולטן דמוי אגרה

שני ניתוחים משלימים של חלקיקים ביולוגיים אטמוספריים ממסננים שנדגמו באוויר מתוארים כאן: מיצוי וזיהוי של אנדוטוקסין ושל DNA.

Air-שנדגמו ניתוח סינון עבור אנדוטוקסינים ותוכן DNA

בזאת אנו מציגים פרוטוקול למדוד במיטה את פעילות האנדוטוקסין של דגימות הדם האנושיות. הבדיקה של פעילות אנדוטוקסין היא מבחן פשוט לבצע והוא עשוי להיות ביוארקר שימושי בחולים באורח אנוש חולה עם אלח דם.

שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

פרוטוקול זה מספק לחוקרים עם שיטה מהירה, עקיפה של מדידת tlr תלויי-NF-кb/AP-1 הפעילות שעתוק בשורה מקרופאג cell מורה בתגובה למגוון של משטחים פולימריים ושכבות חלבון נספחת כי המודל ביומיהמיקרוסביבה השתל ביומטריה.

תא עיתונאי מקרופאג שיטה לבחון קולטן שיחת כמו-תיווך NF-kB/AP-1 איתות על שכבות חלבון Adsorbed על משטחים פולימריים

הפרוטוקול המוצע כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסין במהלך בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטנטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי.

בידוד של תכולת אנדוטוקסין נמוכה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בשורות תאים סרטניים

הפרוטוקול הנוכחי מכין ומעריך את התכונות הפיזיקליות, התגובה החיסונית וההשפעה המגנה in vivo של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני.

הערכת התגובה החיסונית של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב נגד זיהום סטפילוקוקוס אאורוס עמיד למתיצילין (MRSA)

למדו לזהות אנדוטוקסין בננו-חומרים באמצעות מבחני Lysate Amoebocyte Limulus (LAL). שיטה זו מספקת מסגרת סטנדרטית להערכת בטיחות תרופות ננו-רפואיות ולהבטחת עמידה בתקנות.

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

גלה סרטונים נוספים