זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus
30 בינואר 2019
זיהוי של endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים מייצג אחד האתגרים הגדול ביותר בתחום של ננו-רפואה. כאן, אנו מציגים חקר מקרה המתארת את המסגרת המורכבת LAL שלושה פורמטים שונים כדי להעריך את פוטנציאל זיהום אנדוטוקסין בחלקיקים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות בתחום הרפואי על בטיחות של תרופות ננו. היתרונות של טכניקה זו היא כי הוא סטנדרטי, והוא משמש ברחבי העולם להערכת מוצרים, כדי ננו תרופות. הדגמה של ההליך, יהיה בארי נוין, במעבדה לאפיון טכנולוגי ננו.
להכנת תקן כיול, השתמש ב- 900 מיקרוליטרים של לימולוס אמבוציטים ליסאט, או מים ברמה LAL. ו-100 מיקרוליטרים של אנדוטוקסין סטנדרטי לבקרה, כדי להכין כמה דילול ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת תקן כיול עם ריכוז של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר. לאחר מכן, באמצעות 900 מיקרוליטרים של מים בדרגת LAL, ו-100 מיקרוליטרים של יחידת אנדוטוקסין אחת לכל תקן כיול מיליליטר, הכינו תקן כיול שני, בריכוז של יחידת אנדוטוקסין 0.1 למיליליטר.
לאחר מכן חזור על הדילול הסידורי פי עשרה כדי להכין שני תקני כיול נמוכים יותר. כדי להשיג בסך הכל ארבעה תקני כיול, החל מ- 0001 ליחידת אנדוטוקסין אחת לכל מיליליטר. כדי להכין יחידת אנדוטוקסין 05 לבקרת איכות מיליליטר, משלב 50 מיקרוליטר של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של פתרון אנדוטוקסין סטנדרטי בקרה, עם 950 microliters של מים בדרגה LAL.
הבא בתוכנה בחר את הגדרות הכלי וצור את התבנית. בחר לאסוף נתונים והזן את מזהה הבדיקה ואת קבוצת הנתונים בכרטיסיה כללי. תחת הכרטיסיה חומרה, בחר את סוג הכלי ואת פעולת השירות LAL וודא שמספר סידורי, מזהה המערכת ומידע היציאה הטורית מופיעים על המסך.
לחץ על אישור פעמיים כדי לאשר את בחירת המכשיר, ואת התקשורת עם המכשיר, והזן את מזהה הדגימה באותו סדר שבו הדגימות ייבדקו. לאחר מכן השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין את העקומה הסטנדרטית של הפקד השלילי ולבדוק דגימות. הוסף את עוצמת הקול המתאימה של תקני כיול בקרה שליליים, ואת בקרת האיכות לצינורות זכוכית כפולים המסווים מראש.
ולהוסיף את הנפח המתאים של LAL למבחן הנתעב הראשון. Vortex הנתעב בקצרה, ומ מניחים את הבקבוקון לתוך חריצי הבדיקות המתאימים בקרוסלה המכשיר. לפני טעינת הדגימות, לבצע מספר דילולים של חומר ננו הבדיקה בתוך דילול תקף מקסימלי כפי שהוכח.
כדי להכין יחידת אנדוטוקסין 05 למיליליטר של בקרת שיפור עיכוב, לשלב 25 microliters של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של פתרון אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה, עם 475 microliters של חומר ננו הבדיקה בדילול נתון. לאחר המערבולת, לטעון את פקדי שיפור החדשנות המתאימים, ואת דגימות המחקר unspiked לתוך המכשיר. ואז aliquot unspiked וחומרי ננו ממוסקרים בדילול מסוים לתוך צינורות מסומנים מראש.
לפני המערבולת, וטעינה לתוך קרוסלה המכשיר. כדי לבצע LAL ג'ל קריש, להכין אנדוטוקסין תקן בקרה לריכוז סופי של ארבעה lambda, ולשלב 100 microliters של תקן, עם 100 microliters של מים, או מדגם בדיקה כדי להשיג ריכוז סופי של אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה שני lambda. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של לי לסין לכל דילול למדה.
Vortex הצינורות לזמן קצר, ולה מניחים את מתלה של צינורות לתוך 37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, להפוך את הצינורות עם תנועה חלקה, באופן ידני להקליט את התוצאות באמצעות פלוס עבור קריש מוצק, ומינוס ללא קריש, או קריש רופף. בניתוח מייצג זה, PEGylated ליפוזומלי דוקסורוביצין הפריע LAL כרומוגני בדילול חמש, אולם הפרעה זו התגברה בדילול גבוה יותר.
התאוששות ספייק היה בין 50 ל 200% כאשר הניסוח נבדק בדילול 50 ו 500 ב LAL turbidity וכרומוגנית, כמו גם בדילול חמש, ב LAL turbidity. כאשר הותאמו על ידי גורם הדילול, התוצאות היו עקביות בין הזיות בשני החיבורים. יתר על כן, התוצאות היו עקביות בין שלושת פורמטים החיבור.
זכור כי לכל מדגם יש מגוון משלו של דילולים, כל פורמט LAL משתמש בתקן הבקרה שלו ב- doxin ו- lysate, ושצינורות המשמשים להכנת הדילולים, ולבצע תגובה שונה עבור כל חיבור LAL. עבור הליך זה שיטות אחרות כמו ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על חומר לאחר התפתחותו, טכניקה זו סללה את הדרך עבור התפרים ואת התחום של ננו רפואה, לחקור את היישומים הרפואיים של ננו טכנולוגיה ניסח תרופות בבני אדם, מודלים קליניים כולל אך לא מוגבל פרימטים שאינם אנושיים, ארנבות, כלבים, וחולדות. אל תשכח כי עבודה עם דוקסין יכול להיות מסוכן מאוד ואת אמצעי הזהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עוסק באתגר של זיהוי אנדוטוקסינים בחומרי ננו הנדסיים, נושא קריטי ברפואת ננו. הוא מציג מסגרת המשתמשת בשלושה פורמטים שונים של LAL להערכת זיהום פוטנציאלי באנדוטוקסינים בננו-חלקיקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ננו-רפואה
- גילוי אנדוטוקסינים
- הערכת בטיחות של ננו-חלקיקים
רקע
- אנדוטוקסינים עלולים להוות סיכונים משמעותיים ביישומים רפואיים של ננו-חומרים.
- שיטות סטנדרטיות לגילוי אנדוטוקסינים הן חיוניות להבטחת בטיחותן של תרופות ננויות.
- ליזאט של אמבוציטים מלימולוס (LAL) הוא ריאגנט נפוץ המשמש לבדיקת אנדוטוקסינים.
- הבנת רמות הזיהום בננו-חלקיקים חיונית לעמידה בדרישות הרגולטוריות.
מטרת המחקר
- פיתוח מסגרת אמינה להערכת זיהום באנדוטוקסינים בננו-חומרים מהונדסים.
- הדגמת היישום של פורמטים של LAL להערכת בטיחות של ננו-חלקיקים.
- אספקת שיטה סטנדרטית לחוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת סטנדרטים לכיול באמצעות LAL וסטנדרט בקרת אנדוטוקסין.
- יצירת מהדלים ביניים להשגת הריכוזים הרצויים.
- הדגמת הפרוצדורה על ידי חוקר מוסמך.
- שימוש במים בדרגת LAL לבדיקה מדויקת.
תוצאות עיקריות
- המסגרת שפותחה מאפשרת הערכה יעילה של רמות אנדוטוקסין בננו-חלקיקים.
- שיטות סטנדרטיות משפרות את מהימנותן של הערכות הבטיחות.
- הדגמת הפרוצדורה מאשרת את התכשירות שלה בתרחישים מהעולם האמיתי.
- התוצאות מצביעות על חשיבותן של בדיקות קפדניות בננו-רפואה.
מסקנות
- המחקר מספק גישה בעלת ערך לזיהוי אנדוטוקסינים בחומרי ננו.
- שיטות בדיקה סטנדרטיות הן חיוניות לקידום הבטיחות בננו-רפואה.
- נדרש מחקר נוסף כדי לדייק שיטות אלו ולהבטיח הערכות בטיחות מקיפות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
גילוי אנדוטוקסינים הוא שלב קריטי בבקרת איכות בפיתוח ננו-רפואה, שבו ננו-פורמולציות עלולות להפריע לבדיקות סטנדרטיות ולפגוע בבטיחות המוצר. בדיקת LAL מספקת שיטה סטנדרטית ומקובלת בעולם לכימות זיהום אנדוטוקסינים במוצרי תרופות המבוססים על ננו-חלקיקים, בחיסונים ובחומרים עזרי חיסון (adjuvants). בדיקת אנדוטוקסינים מהימנה תומכת בעמידה בדרישות הרגולטוריות ומפחיתה סיכונים בשלב הפיתוח הפרה-קליני על ידי זיהוי מוקדם של סכנות דלקתיות בשרשרת הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של פרופילי בטיחות של ננו-חומרים על ידי זיהוי ארטיפקטים דלקתיים המושרים על ידי אנדוטוקסינים, העלולים להטעות מחקרי תיקוף של מטרות.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית להבחנה בין השפעות פרמקולוגיות אמיתיות לבין תוצאות חיוביות שגויות המתווכות על ידי אנדוטוקסינים בסריקה ראשונית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: תומך בהכנה של מערכות ביולוגיות מוסמכות לסריקות המשך על ידי אישור רמות נמוכות של אנדוטוקסינים בספריות של תרכובים בננו-פורמולציה.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור בפורמטים של עכירות (turbidity), כרומוגניות (chromogenic) וקרישת ג'ל (gel-clot) של LAL, כדי לאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה והשוואתיות בין פלטפורמות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מבטיח שמערכות רלוונטיות למחלה לא ייפגעו מדלקת המונעת על ידי אנדוטוקסינים, ובכך שומר על הפחתת סיכונים מכניסטית במודלים תרגומיים.
- ערך תפעולי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאמות סיכונים על ידי אספקת כימות עקבי של אנדוטוקסינים במגוון מנות של חומרי מחקר, חומרי קדם-קליניים וחומרים קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקת LAL משתלבת ברצף מהגילוי לשלב הפרה-קליני כנקודת ביקורת בטיחותית, המגיעה לאחר הסינתזה הראשונית של הננו-חומרים ולפני ההערכה הביולוגית במודלים של מחלות.
- ביולוגיה של גילוי: מאשר שפעילות ביולוגית שנצפתה במבדקי תיקוף מטרה אינה נובעת מזיהום לאנדוטוקסין, ובכך תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים.
- סריקה: מספקת מדידות סטנדרטיות של אנדוטוקסין המאפשרות הערכה אמינה של תרכובות ובחירת פגיעות (hits) בספריות של ננו-פורמולציות.
- אנליזה: מייצרת קריאות כמותיות של יחידות אנדוטוקסין/mL משלושה פורמטים של LAL, מה שמאפשר לצוותים להשוות רמות זיהום בין פורמולציות וסדרות דילול.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הערכת בטיחות של ננו-חומרים להמשכיות פרה-קלינית, על ידי הבטחה שפריטי הבדיקה עומדים בספי המותרים לאנדוטוקסין לפני מחקרים in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה רב-פעמית לבדיקת אנדוטוקסינים, הישומה בפרויקטים של ננו-רפואה, חיסונים ותוכניות לפיתוח עזרים (adjuvants).
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי ביטול אנדוטוקסין כמשתנה מתערב בבדיקות פרמקולוגיות ואימונולוגיות.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת התרחבות של גילוי אנדוטוקסינים במגוון פורמטים של LAL ובסוגי ננו-חומרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי אספקת נתוני בטיחות מוקדמים, ובכך מפחית נשירה ביולוגית בשלבים מאוחרים וחוסר יעילות הונית.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מבוסס סיכון של ננו-פורמולציות בהתבסס על פרופילים כמותיים של אנדוטוקסינים וביצועי התאוששות מהוספה (spike recovery).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעקרונות של בדיקות אנדוטוקסין, טיפול בננו-חומרים ואסטרטגיות להפחתת הפרעות.
- תלוי בגישה לרכיבי LAL, מכשור מכויל (למשל, קוראי מיקרו-פלייטים, אינקובטורים), ומים וכלי מעבדה נקיים מאנדוטוקסינים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי דילול, הכללת בקרות (שליליות, חיוביות, עיכוב/הגברה), ופירוש תוצאות בפורמטים של עכירות, כרומוגניות וקרישת ג'ל (gel-clot).
- כולל שיקולי התאמה למאפיינים מגוונים של ננו-חומרים (למשל, מטען, גודל, כימיה של פני השטח) העשויים להשפיע על תגובתיות ה-LAL ולדרוש טווחי דילול מותאמים אישית.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הפרעות בבדיקה הנגרמות מננו-חלקיקים (הגברה או עיכוב), אותן יש לטפל באמצעות אופטימיזציה של הדילול ובקרות התאוששות של הוספה (spike recovery), כפי שהודגם במחקר.
