זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

זיהוי של endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים מייצג אחד האתגרים הגדול ביותר בתחום של ננו-רפואה. כאן, אנו מציגים חקר מקרה המתארת את המסגרת המורכבת LAL שלושה פורמטים שונים כדי להעריך את פוטנציאל זיהום אנדוטוקסין בחלקיקים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות בתחום הרפואי על בטיחות של תרופות ננו. היתרונות של טכניקה זו היא כי הוא סטנדרטי, והוא משמש ברחבי העולם להערכת מוצרים, כדי ננו תרופות. הדגמה של ההליך, יהיה בארי נוין, במעבדה לאפיון טכנולוגי ננו.

להכנת תקן כיול, השתמש ב- 900 מיקרוליטרים של לימולוס אמבוציטים ליסאט, או מים ברמה LAL. ו-100 מיקרוליטרים של אנדוטוקסין סטנדרטי לבקרה, כדי להכין כמה דילול ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת תקן כיול עם ריכוז של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר. לאחר מכן, באמצעות 900 מיקרוליטרים של מים בדרגת LAL, ו-100 מיקרוליטרים של יחידת אנדוטוקסין אחת לכל תקן כיול מיליליטר, הכינו תקן כיול שני, בריכוז של יחידת אנדוטוקסין 0.1 למיליליטר.

לאחר מכן חזור על הדילול הסידורי פי עשרה כדי להכין שני תקני כיול נמוכים יותר. כדי להשיג בסך הכל ארבעה תקני כיול, החל מ- 0001 ליחידת אנדוטוקסין אחת לכל מיליליטר. כדי להכין יחידת אנדוטוקסין 05 לבקרת איכות מיליליטר, משלב 50 מיקרוליטר של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של פתרון אנדוטוקסין סטנדרטי בקרה, עם 950 microliters של מים בדרגה LAL.

הבא בתוכנה בחר את הגדרות הכלי וצור את התבנית. בחר לאסוף נתונים והזן את מזהה הבדיקה ואת קבוצת הנתונים בכרטיסיה כללי. תחת הכרטיסיה חומרה, בחר את סוג הכלי ואת פעולת השירות LAL וודא שמספר סידורי, מזהה המערכת ומידע היציאה הטורית מופיעים על המסך.

לחץ על אישור פעמיים כדי לאשר את בחירת המכשיר, ואת התקשורת עם המכשיר, והזן את מזהה הדגימה באותו סדר שבו הדגימות ייבדקו. לאחר מכן השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין את העקומה הסטנדרטית של הפקד השלילי ולבדוק דגימות. הוסף את עוצמת הקול המתאימה של תקני כיול בקרה שליליים, ואת בקרת האיכות לצינורות זכוכית כפולים המסווים מראש.

ולהוסיף את הנפח המתאים של LAL למבחן הנתעב הראשון. Vortex הנתעב בקצרה, ומ מניחים את הבקבוקון לתוך חריצי הבדיקות המתאימים בקרוסלה המכשיר. לפני טעינת הדגימות, לבצע מספר דילולים של חומר ננו הבדיקה בתוך דילול תקף מקסימלי כפי שהוכח.

כדי להכין יחידת אנדוטוקסין 05 למיליליטר של בקרת שיפור עיכוב, לשלב 25 microliters של יחידת אנדוטוקסין אחת למיליליטר של פתרון אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה, עם 475 microliters של חומר ננו הבדיקה בדילול נתון. לאחר המערבולת, לטעון את פקדי שיפור החדשנות המתאימים, ואת דגימות המחקר unspiked לתוך המכשיר. ואז aliquot unspiked וחומרי ננו ממוסקרים בדילול מסוים לתוך צינורות מסומנים מראש.

לפני המערבולת, וטעינה לתוך קרוסלה המכשיר. כדי לבצע LAL ג'ל קריש, להכין אנדוטוקסין תקן בקרה לריכוז סופי של ארבעה lambda, ולשלב 100 microliters של תקן, עם 100 microliters של מים, או מדגם בדיקה כדי להשיג ריכוז סופי של אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה שני lambda. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של לי לסין לכל דילול למדה.

Vortex הצינורות לזמן קצר, ולה מניחים את מתלה של צינורות לתוך 37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, להפוך את הצינורות עם תנועה חלקה, באופן ידני להקליט את התוצאות באמצעות פלוס עבור קריש מוצק, ומינוס ללא קריש, או קריש רופף. בניתוח מייצג זה, PEGylated ליפוזומלי דוקסורוביצין הפריע LAL כרומוגני בדילול חמש, אולם הפרעה זו התגברה בדילול גבוה יותר.

התאוששות ספייק היה בין 50 ל 200% כאשר הניסוח נבדק בדילול 50 ו 500 ב LAL turbidity וכרומוגנית, כמו גם בדילול חמש, ב LAL turbidity. כאשר הותאמו על ידי גורם הדילול, התוצאות היו עקביות בין הזיות בשני החיבורים. יתר על כן, התוצאות היו עקביות בין שלושת פורמטים החיבור.

זכור כי לכל מדגם יש מגוון משלו של דילולים, כל פורמט LAL משתמש בתקן הבקרה שלו ב- doxin ו- lysate, ושצינורות המשמשים להכנת הדילולים, ולבצע תגובה שונה עבור כל חיבור LAL. עבור הליך זה שיטות אחרות כמו ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על חומר לאחר התפתחותו, טכניקה זו סללה את הדרך עבור התפרים ואת התחום של ננו רפואה, לחקור את היישומים הרפואיים של ננו טכנולוגיה ניסח תרופות בבני אדם, מודלים קליניים כולל אך לא מוגבל פרימטים שאינם אנושיים, ארנבות, כלבים, וחולדות. אל תשכח כי עבודה עם דוקסין יכול להיות מסוכן מאוד ואת אמצעי הזהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.