Name: השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למד את שיטת Contact Bubble Bilayer ליצירת דו-שכבות שומנים לרישום ערוצי יונים בודדים. שיטה זו משלבת יתרונות של patch clamp ו-planar lipid bilayer לחקר אינטראקציות ממברנה-ערוץ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות מריקו Yamatake, מסקו הטקשימה לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על-ידי KAKENHI גרנט מספרים 16H 00759 ו-17 H 04017 (וכו).

1. מכינים ליפוזומים
<ol><li>לפזר פוספוליפידים (למשל, 10 מ ג אבקת) ב כלורופורם-ריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"ג/מ"ל).</li>
	<li>להתנדף כלורופורם.<ol>
<li>המקום הפתרון פוספוליפיד הבקבוק העגול-התחתון, ערכת אותו על המאדה (ראה טבלה של חומרים) מחובר גליל גז2 N. סובב את הבקבוק תחת זרימה2 N בטמפרטורת החדר עד סרט דק פוספוליפיד מופיע (לאחר ~ 30 דקות).</li>
		<li>למקם את הבקבוק פתוח desiccator מחובר אליו משאבת ואקום. באמצעות המשאבה ואקום, תשאף הפנימי של desiccator במשך מספר שעות כדי להסיר את הכלורופורם ביסודיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף אמצעי אחסון המתאים של פתרון אלקטרוליט הבקבוק, להשעות את פוספוליפיד להשיג 2 מ"ג/מ"ל פוספוליפיד ההשעיה.</li>
	<li>Sonicate התליה על כמה עשרות שניות בעזרת sonicator אמבט (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבל השעיה מרובה שכבות שלפוחית (קמפנילה MLV).</li>
	<li>עבור הכנת proteoliposomes המכילים חלבונים ערוץ יון, להוסיף פתרון חלבון (עם החלבונים solubilized באמצעות חומרי ניקוי המתאים; 2% נפח היא מקסימלית) כדי ההשעיה קמפנילה MLV ו sonicate למשך מספר שניות באמצעות את sonicator אמבט.</li>
</ol>2. מכינים פיפטות זכוכית גדול נשא
<ol><li>הגדר זכוכית נימי פולר פיפטה, הרכיבו micropipettes עם טיפ מחודדות בסדר באמצעות משיכת שני שלבים.</li>
	<li>להגדיר את micropipette על microforge וליצור קשר עם קצה micropipette נימה פלטינה-החלק מחודדות בקוטר של 30 עד 50 מיקרומטר.</li>
	<li>מחממים את הסיב בקצרה (5 s) מיד לכבות אותו. הערה: זו מניפולציה טופסי הצבעה כדי לפצח החימום, לפיה קצה micropipette מנותקת, עוזב משעמם רחב בקוטר של 30 עד 50 מיקרומטר.</li>
</ol>3. לטפל השטח של שקופיות זכוכית עם באר קעורה רדוד (Siliconization סיום דוחה מים)
<ol><li>לנקות את השטח של השקופית זכוכית עם באר רדוד עם מים מזוקקים, אתנול.</li>
	<li>החל אמצעי אחסון המתאים (למשל, 100 µL) של ריאגנט siliconizing (דוחה מים) על גבי הזכוכית שקופית חור.</li>
	<li>יבש הכימית לגמרי באוויר.</li>
	<li>מניחים את השקופית זכוכית על השלב של מיקרוסקופ הפוכה.</li>
</ol>4. יוצרים את CBB ולבצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות
<ol><li>להוסיף 100 µL של hexadecane לתוך הבאר רדוד של חור siliconized שקופיות זכוכית. הערה: עבור שיטת השומנים-אאוט, פוספוליפידים מופצים ב- hexadecane (20 מ"ג/מ"ל) מראש.</li>
	<li>למלא את הפתרון אלקטרוליט חצי אורך micropipette, באמצעות מזרק טוברקולין.</li>
	<li>הגדר את micropipette על גבי המחזיק micropipette עם יציאת לחץ, ומאפשר האלקטרודה תיל Ag/AgCl לטבול לתוך הפתרון אלקטרוליט פיפטה.</li>
	<li>חבר אחד של בעלי micropipette לשלב ראש של מגבר תיקון-קלאמפ ואת השני אל הקרקע חשמל.</li>
	<li>חבר microinjector של הנמל לחץ של בעל micropipette.</li>
	<li>הגדר את micropipette עמדה ראויה מעל הבמה של מיקרוסקופ הפוכה על-ידי מניפולציה של micromanipulator.</li>
	<li>כוונון ההיסט של אלקטרודה פוטנציאליים.<ol>
<li>מקום 1 µL של הפתרון אלקטרוליט אותו נהגו למלא את micropipette על פני השטח שטוחים סביב הבאר רדוד של הזכוכית שקופית חור, יצירה של כיפת אלקטרוליט.</li>
		<li>לטבול את הקצה בשני micropipettes הכיפה אלקטרוליט על-ידי מניפולציה של micromanipulator.</li>
		<li>להתאים את הפוטנציאל היסט אלקטרודה של המגבר תיקון-קלאמפ.</li>
		<li>לאשר את ההיסט הנכון בסוף ניסויים על ידי שבירת CBB את דרך יישום של פוטנציאל גבוה קרום (פירוט חשמל; באמצעות זאפ על המגבר), גורם שתי בועות נכרכים לתוך אחד (בועה fusion).</li>
		<li>תקן את נוזלי צומת פוטנציאלי54 במקרים שבהם משמשים פתרונות אלקטרוליט אסימטרי, כך הערך המחושב מתווסף קרום יישומית פוטנציאל קרום נכון פוטנציאליים. הערה: צומת נוזלי פוטנציאליים מחושבת באמצעות התוכנית JPCalc55.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לצייר את הפתרון ליפוזום מהקצה. הערה: ערוצי מסיסים במים נבדקים באמצעות השיטה השומנים-אאוט, suctioning של הפתרון ליפוזום אינו הכרחי.<ol>
<li>במקום µL 1 של ליפוזום פתרון על משטח שטוח סביב הבאר רדוד של הזכוכית שקופית חור (המכילות ליפוזום dome).</li>
		<li>לתפעל את micromanipulator והכנס את קצה micropipette לתוך הכיפה המכילות ליפוזום.</li>
		<li>האחות הפתרון המכילות ליפוזום על ידי הורדת הלחץ בתוך המחזיק micropipette באמצעות microinjector.</li>
		<li>חזור על התהליך עבור פיפטה אחרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לתפעל את micromanipulator, טבלו את קצה micropipette hexadecane הבאר רדוד.</li>
	<li>לפוצץ בועה מים באיטיות על ידי הגדלת הלחץ עד הבועה מגיע לגודל הרצוי (לדוגמה, 50 מיקרומטר בקוטר), לשמור על הלחץ אותו לאחר מכן.</li>
	<li>למחוק את הבועות על-ידי העברת המידע באמצעות ממשק שמן-האוויר אם זה קשה לשמור על גודל הבועות יציב.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.8 ל 4.9 עד נוצרות בועות יציבה.</li>
	<li>לטפל בועות כדי לאפשר קשר ביניהם (איור 5). הערה: לפעמים הבועות מתקרבים אחד לשני באופן ספונטני כדי ליצור את CBB. במקרים אחרים, הבועות קרובים אבל אל תצור קשר עם אחד את השני. במקרה זה, לדחוף את הבועות אחד את השני באופן מכני.</li>
	<li>לכוונן את הלחץ כדי לשמור על גודל הבועה, בגלל הגודל רשאית לשנות בהדרגה אפילו בכל הלחץ קבוע אינטרה-הבועה.</li>
	<li>הגדר את הקרום פוטנציאל לערך המתאים באמצעות המגבר תיקון-קלאמפ ולחכות הערוץ הנוכחי כדי להגיח (איור 6).</li>
</ol>5. למדוד Bilayer קיבוליות
<ol><li>למדוד את הקיבולת החשמלית bilayer (Cel) על-ידי החלת רמפה פוטנציאליים. הערה: כאשר שיעור השינוי מתח בפקודה הרמפה mV 10/10 ms (או 1 V/s) ואחריו-10 mV/10 ms, משרעת של הקפיצה הנוכחי על שינויים המדרון מקביל הקריאה של הערך membrane'scapacitance (למשל הרשות הפלסטינית 100 ← 100 pF).</li>
	<li>להעריך את האזור bilayer של שתי בועות בערימה אחד על השני, להתמקד המיקרוסקופ ברמת bilayer כדי להציג את קצה bilayer (איור 6). הערה: הצורה bilayer בעיקר מעגלית, האזור מחושב לפי הרדיוס.</li>
	<li>לחשב את קיבול הממברנה ספציפי (Csp) על-ידי חלוקת את הקיבולת החשמלית על-ידי האזור bilayer (Csp = Cel/A).</li>
	<li>לחשב את עובי bilayer (עובי של גרעין הידרופובי) באמצעות Dc = (חדוהrחדוה0) /Csp (איפה חדוהr וחדוה0 מייצגים המקדם הדיאלקטרי של אזור הידרופובי bilayer המקדם הדיאלקטרי של ואקום, בהתאמה).</li>
</ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

השיטה CBB של היווצרות ליפיד bilayer מבוסס על העיקרון של טיפונת מים בתוך שמן על ידי חד שכבתי20. טכנית, נהלי ויוצרים CBBs קלים, במיוחד עבור תיקון-קלאמפ חוקרים, שאינם בקיאים לתמרן את micropipettes זכוכית. הגדרת אלקטרופיזיולוגיות עבור המלחציים תיקון משמש ברצון CBB כאשר שני סימולטורי פיפטה עם microinjectors זמינים. מצד שני, מכיוון CBB יורש של PLB קונבנציונאלי, אשר כמות גדולה של ידע physicochemical כבר נצבר8, זה הרקע וכן ידע בכימיה משטח38 הוא מועיל עבור הפ...

עבור יון ערוצי, קרום התא הוא לא פשוט חומר התומך אלא שותף ליצירת יון שטף. מבחינה תפקודית, הקרום מבודד חשמלי ביון אשר מוטבעים ערוצים, כל קרום התא מוקנות עם קרום מנוחתו פוטנציאליים. כמקובל, ממברנה שרירותי פוטנציאל שהוטל מ מעגל חיצוני שבו נמדדה זרם חשמלי דרך הערוצים. זו הערכה כמותית של שטף יון-פוטנציאל ממברנה שונים חשף המאפיינים המולקולריים של ערוצי אלה, כגון יון סלקטיבי הסתננות שלהם פונקציות חסימה1,2. פלטפורמת ממברנה ללימודי פונקציונלי של תעלות יונים היא קרום התא או קרום bilayer השומנים. מבחינה היסטורית, הקלטות הנוכחי חשמל ערוץ אחד בוצעו לראשונה השומנים bilayers3,4, טכניקות הרלוונטיים פותחו עבור קרום התא, כגון שיטת תיקון-קלאמפ (איור 1א' )5,6. מאז, אלה שתי טכניקות התפתחו בנפרד עבור מטרות שונות (איור 1)7,8.
ממברנה ליפידים וממברנות bilayer נכון להיום המוקד של מחקר על השתתפותם ב התומך את המבנה והתפקוד של ערוץ חלבונים. לכן, הזמינות מוכן של שיטות כדי להשתנות הרכב השומנים ב bilayers הוא ביקוש גבוה. השומנים bilayer היווצרות שיטות כגון השומנים מישורי bilayer (PLB)8,9,10,11, מים בתוך שמן droplet bilayer12וכן droplet ממשק bilayer (דיב)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , טכניקות 19 (איור 1) הן אפשרויות נפוצות, מתן הזדמנות לבחינת הפונקציה הערוץ תחת משתנה השומנים יצירות20. אני אמנם טכנית הרבה יותר קל לייצר יותר PLB קונבנציונאלי, גודלו של המילה יצרה תמריץ שלילי עבור תיקון-clampers ליישם אותו ללמוד הקלטות הנוכחי ערוץ אחד עם מוליכות בגודל הרגיל (< 100 pS).
כדי לעקוף את רעשי הרקע, יש למזער את האזור bilayer. בעיה זו מזכיר את מספר החזרות של ההיסטוריה בפיתוח שיטות אלקטרופיזיולוגיות עבור השומנים bilayers (איור 1). בימים הראשונים, הוקמה bilayer בגודל קטן (1-30 מיקרומטר בקוטר), בקצה פיפטה (טיפ-מח ש שיטת; איור 1 C) 21 , 22 , 23, במקום שימוש bilayer שעמד חופשי (~ 100 מיקרומטר בקוטר) מחצה הידרופובי בתוך תא (איור 1B). שיטת טיפ-מח ש המותר עבור מדידות חשמל עם הרבה רעש נמוכה יותר רקע24. החוויות שלנו עם PLB25,26, עצה-מח ש22,23,27, תיקון-קלאמפ28,29,30, שיטות 31 הובילה אותנו רעיון חדש של יצירת bilayers השומנים על ידי שימוש בעקרונות bilayer המים בתוך שמן. לנו יש מכונה זה הבועה קשר bilayer (CBB) שיטת20,32. בשיטה זו, ולא מחזיק טיפות מים שלב שמן (איור 1D), בועת מים הוא מפוצץ מ פיפטה מזכוכית (עם עצה בקוטר של 30 מיקרומטר) לשלב שמן (איור 1E ו- 2), איפה בועה נשמר על-ידי החלת בלחץ קבוע. צורות טפט באופן ספונטני על הממשק מים-שמן על פני השטח של הבועה. לאחר מכן, שתי בועות מעוגנות באמצעות המניפולציה של שני פיפטות זכוכית, bilayer נוצרת גם monolayers שני מתקרבים אחד לשני, מניב שטח bilayer שיווי משקל. גודל הבועה נשלטת על ידי הלחץ אינטרה-הבועה (להחזיק לחץ), ואת גם גודל bilayer. קוטר ממוצע של 50 מיקרומטר משמש לעתים קרובות. למרות הנפח של הבועה הקטן (< 100 pL), זה קשור נפח גדול של הפתרון פיפטה זה בטווח microliter, המהוות שלב אלקטרוליט בצובר.
ישנם יתרונות רבים כדי להשתמש בשיטת CBB (טבלה 1). כמו טכניקה היווצרות ליפיד bilayer, ממברנות של קומפוזיציות שונות שומנים בדם יכול להיות מיוצר, ממברנות אסימטרי בקלות רבה יותר בנוי32 מאשר אלו על ידי שיטת מתקפלים33קונבנציונלי. Bilayer יכול להיות מכנית מניפולציות, בניגוד PLB קונבנציונלי יכול להיות כפוף רק עם34,הפרש הלחץ ההידרוסטטי35. על-ידי שינוי הלחץ החזקה, הבועות או להרחיב או לכווץ, שמוביל מתח הממברנה עלייה או ירידה32. Bilayer מכנית להסרה לתוך monolayers, הדומה ההקפאה-שבר טכניקה36,37 של ממברנות במחקרים מורפולוגי, אבל עם CBB, תרגיל המאפשר חזר על ניתוק וצירוף מחזורים32 . נפח קטן של הפתרון אלקטרוליט בתוך הבועה מאפשר מיזוג יעיל של ליפוזומים מחדש ערוץ לתוך bilayer, ההסתברות להשיג הקלטות הערוץ היא גבוהה הרבה יותר עם טכניקה PLB קונבנציונלי. אמצעי האחסון בועה קטנה גם מאפשר זלוף מהירה (בתוך ~ 20 ms) עוד פעם הזרקה פיפטה הוכנס גם הבועות. שלא כמו שיטת תיקון-קלאמפ, ברגע שבור, קרום CBB נוצר מחדש באופן מיידי, שוב ושוב, מדי סוכר יכול לשמש מספר פעמים ביום. על-ידי שילוב היתרונות של תיקון-קלאמפ והשיטות PLB, CBB מספק פלטפורמה תכליתי לגוון את התנאים physicochemical של הקרום, ומאפשר ללימודי חסרת תקדים של הערוץ-הממברנה אינטראקציות.
לפני הצגת פרוטוקול מפורט של תהליך היווצרות CBB, רקע physicochemical של היווצרות bilayer מוצג הראשון, אשר יהיה שימושי עבור תיקון-clampers לפתור קשיים ניסיוני הנוגע היווצרות קרום כי אתה נתקל.
ניסויים CBB להקנות את לקחי מדע הכימיה משטח38. CBB דומה בועת סבון התפוצץ מקשית לתוך האוויר, איפה באופן דומה, בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני. אחד לא ישים לב כי בועת מים בקושי מנופח ממברנה שומנים לא נכללת גם את בועת מים או הממס האורגני בהיעדרו של amphipathic שומנים, המתח-ממשק מים-שמן גבוה, הלחץ אינטרה-בועת עבור פיצוץ בועה יהיה גבוה. זהו מימוש משוואת לפלס (ΔP = 2 וγ/R, כאשר ΔP הוא הלחץ אינטרה-הבועה, γ הוא מתח הפנים ו- R הוא רדיוס בועה). כאשר ריכוז ליפידים השלב אורגני או הפתרון אלקטרוליט הוא גבוה, הצפיפות של ליפידים ב טפט עולה, כפי שמכתיבה את איזותרמה ספיחה גיבס (-dγ = Γאני dµאני, איפה Γאני עודף משטח של המתחם, ממוצעאני הוא הפוטנציאל הכימי של רכיב אני)39, המוביל מתח נמוך והקלות של היווצרות בועה. ב CBB, יכול להיות שנצפו על bilayer מזווית וצורניים (איור 2), זווית מגע בין חד שכבתי bilayer הוא מדיד. זווית זו מייצגת איזון בין את surface tensions של טפט bilayer (משוואת צעירים: γbi = γמו cos(θ), איפה γbi הוא המתח bilayer, γמו הוא המתח טפט ו θ באמצעות הוא הזווית קשר). שינויי הזווית קשר מצביעים על שינויים במתח bilayer, בהתחשב בכך המתח טפט יוערך משינויים ב זווית הקשר כפונקציה של קרום פוטנציאליים (משוואת יאנג-ליפמן: γמו = Cm V2 /4 (cos (θ באמצעות0) - cos (θ באמצעותv)), כאשר Cm הוא קיבול הממברנה, V הוא קרום פוטנציאליים ו θ באמצעות0 וθ באמצעותv הן הזוויות-0 ו- V mV, בהתאמה)40,41 ,42. כאשר שתי בועות קרוב מספיק, הם מתקרבים אחד לשני באופן ספונטני. זאת בשל הכוח Waals ואן דר, ניתן להבחין ויזואלית תהליך דינמי זה במבנה CBB.
מערכת CBB מורכב שלבים ברורים: כלומר, שלב שמן בתפזורת, מים בועות מצופה טפט ולאחר bilayer קשר איתם (איור 3). אלה מזכירים שלבי מרובים שנצפתה PLB, כמו הטורוס המכילות הממס מסביב השלב bilayer וגם שלב אורגניים דקים דחוקה על ידי שני monolayers43,44. ב CBB, לשלב טפט היא רציפה עם העלעל bilayer, מולקולות ליפיד בקלות לפזר בין את טפט העלעל. שלב חד שכבתי מכסה את רוב פני השטח בועה, המהוות את שלב עיקרי זה משמש מאגר השומנים. כי הזנב הידרופוביות של ליפידים של טפט מרחיב כלפי חוץ כדי לשלב שמן בתפזורת, הפנים bilayer או הליבה הידרופובי פותח לשלב שמן בכמות גדולה. לפיכך, חומר הידרופובי מוזרק לשלב שמן קרוב bilayer הוא מסוגל לגשת בקלות הפנים bilayer. זוהי הטכניקה זלוף ממברנה שפיתחנו לאחרונה45, לפיו הרכב השומנים ב- bilayer משתנה במהירות (תוך שנייה) במהלך הקלטות הנוכחי ערוץ אחד. מצאנו כי תכולת כולסטרול bilayer יכול להיות הפיכה נשלט על ידי מיתוג את זלוף כולסטרול45לסירוגין. בכל מקרה שבו הריכוז של החומר הרלוונטי טפט, bilayer שונה, מעבר הצבע ריכוז של חומר רלוונטי מפורקת באופן מיידי באמצעות דיפוזיה, הידוע בשם אפקט ס שלושה קמפוסים:46, 47. מצד שני, כפכפים מעבר monolayers הן איטיות48,49,50.
שימוש בשיטת CBB, bilayer נוצר בתנאים physicochemical מגוונים, כגון pH אלקטרוליט המתחילים 1 51, ריכוז מלח (K+, Na+, וכו '.) עד 3 מ', פוטנציאל הממברנה גבוהה כמו ±400 mV, ומערכת טמפרטורה של עד 60 מעלות צלזיוס.
ישנן מספר אפשרויות עבור היווצרות CBB ההתאגדות של מולקולות ערוץ בו. על היווצרות טפט על הממשק מים-שמן, שומנים מתווספות או הממס האורגני (שיטת השומנים-out; איור 4 א, ג 4) או בתוך בועה כמו ליפוזומים (שומנים בדם-אין שיטה; איור 4 B, 4 D). ראוי לציין, השיטה השומנים-in מאפשר היווצרות של ממברנות אסימטרי15,32. ערוץ מולקולות מסיסים בתמיסה המימית (למשל, פפטידים להיוות ערוץ) מתווספים ישירות לתוך52,בועה (איור 4A, B)53, ואילו ערוץ חלבונים הם מחדש לתוך ליפוזומים, אשר יתווספו לאחר מכן לתוך הבועה (איור 4C, D). במסמך זה, היווצרות של CBBs על ידי שיטת השומנים-in עבור גם ערוץ פפטיד (polytheonamide B (pTB); איור 4 A) או חלבון (ערוץ אשלגן KcsA, איור 4C) מוצג.

<table><tbody><tr><td>אזולקטין (L-&alpha;-פוספטידילכולין, סוג IV-S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3644</td><td></td></tr><tr><td>ממיר A/D</td> חלקים <td>מולקולריים</td><td>Digidata1550A</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl אלקטרודה</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1317</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>אמבטיה ברנסון</td><td>M1800H-J</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית נימי</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>30-0062</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Dojindo</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>חור Slideglass</td><td>Matsunami זכוכית</td><td>S339929</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד</td><td>Herz</td><td>TDI-86LA(Y)2</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו Injenctor</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מניפולטור</td><td>Narishige</td><td>EMM</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr>מחזיק <td></td><td></td><td></td><td>מיקרופיפטה</td></tr><tr><td>n-Hexadecane</td><td>Nacalai</td><td>07819-32</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td><td>HEKA</td><td>EPC800</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457-POPE</td><td></td></tr><tr><td>(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine )</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757-POPG</td><td></td></tr><tr><td>(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Nacalai</td><td>28514-75</td><td></td></tr><tr><td>מאייד סיבובי</td><td>Iwaki</td><td>REN-1000</td><td></td></tr><tr><td>חומצה סוקסינית</td><td>Nacalai</td><td>32402-05</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>Buchi</td><td>V-100</td><td></td></tr></tbody></table>

השומנים bilayer ניסויים עם בועה קשר bilayers עבור תיקון-clampers

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

השומנים bilayers מספקים פלטפורמה ניסיוני ייחודי ללימודי פונקציונלי של תעלות יונים, המאפשר הבחינה של הערוץ-הממברנה אינטראקציות תחת קרום שונים יצירות השומנים. ביניהם, bilayer ממשק ' droplet ' צברה פופולריות; עם זאת, גודל ממברנה גדולות מעכבת את ההקלטה של רעש רקע חשמל נמוכה. הקמנו בועה קשר bilayer (CBB) בשיטה המשלבת את היתרונות של מישורי ליפידית ושיטות תיקון-קלאמפ, כגון היכולת להשתנות הרכב השומנים, לתמרן את המכניקה bilayer, בהתאמה. באמצעות הגדרת לניסויים תיקון קונבנציונלי-קלאמפ, מבוסס CBB ניסויים ניתן בקלות לבצע. בקצרה, פתרון אלקטרוליט ב פיפטה מזכוכית הוא התפוצץ לתוך שלב בממיסים אורגניים (hexadecane), הלחץ פיפטה נשמר להשיג מידה קצף יציב. הבועה רצוף באופן ספונטני שומנים חד שכבתי (ליפידים טהור או שומנים מעורבים), אשר מסופק מן ליפוזומים הבועות. בשלב הבא, שני מצופה טפט בועות (~ 50 מיקרומטר בקוטר), בקצה פיפטות זכוכית מעוגנות bilayer בשורה. הקדמה של ליפוזומים מחדש ערוץ לתוך הבועה מוביל שילוב של ערוצים bilayer, המאפשר הקלטה הנוכחי ערוץ אחד עם יחס אות לרעש לזו של תיקון-קלאמפ הקלטות. CBBs להרכב השומנים אסימטרי נוצרות בקלות. CBB מתחדש שוב ושוב על ידי לפוצץ את הבועות הקודם ויוצרים חדשים. לפליטת כימיים שונים (למשל, ממברנה זלוף, bilayer המתח) ניתן לגזור על CBBs. שעל זה, אנו מציגים את ההליך הבסיסי לשימוש CBB היווצרות.

CBB טיפוסי היה בקוטר של 50 מיקרומטר (איור 56) והיה קיבול הממברנה ספציפי ב hexadecane µF 0.65/cm2. גודל הבועה נשלטה באופן שרירותי על ידי לחץ אינטרה-הבועה. כאשר בועות קטנות נחוצים להקלטות רעש נמוכה, הקוטר טיפ צריך להיות correspondingly קטן. לדוגמה, עבור גודל בועה של 50 מיקרומטר בקוטר, הקוטר טיפ צריך להיות 30 מיקרומטר.
ברגע CBB יצרו, מולקולות ערוץ תמיסה מימית או של ליפוזום ה...

כאן, אנו מציגים עבור היווצרות ליפיד bilayers באמצעות שיטת bilayer בועה קשר פרוטוקול. בועת מים הוא התפוצץ לתוך הממס האורגני, לפיה טפט נוצר ב הממשק מים-שמן. פיפטות שני יפגעו כדי לעגן את הבועות כדי ליצור bilayer.

השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

שיטת בוליאר בועת מגע היא טכניקה חלופית עבור Bilayers השומנים קונבנציונאלי. ושיטה זו מאפשרת רטט רב-תכליתי יותר דרך הממברנה. שיטת CBB משלבת את היתרונות של Bilayer ליפיד פלנאר שיטת מלחציים תיקון.כמו טכניקה bilayer השומנים CBB עם הרכב שומנים שרירותי יכול להיווצר. פיתחנו CBB להקלטות זרם ערוץ יחיד עם יחס אות גבוה לרעש. שיטה זו מאפשרת זנים של תנודות קרום ומציעה פלטפורמה מסוג עצום לממשק קרום הערוץ.כולם חוו פיצוץ בועת סבון. תמרונים דומים נלקחים להיווצרות CBB על ידי כוונון ידני עדין של הלחץ המוחל במקום לנשוף בפה. להתאמן וליהנות CBB.כדי להיות הליך זה לפזר פוספוליפידים בכלורופורם בריכוז הרצוי בבקבוקון תחתון עגול. מניחים את הפתרון פוספוליפיד על אידוי סיבובי מחובר צילינדר גז חנקן. סובב את הבקבוק תחת זרימת חנקן בטמפרטורת החדר עד שיופיע סרט פוספוליפיד דק.לאחר מכן מניחים את הבקבוק הפתוח לתוך י desiccator המחובר למשאבת ואקום. באמצעות משאבת ואקום שאפו את החלק הפנימי של היודש במשך כמה שעות כדי להסיר את הכלורופורם ביסודיות. לאחר מכן להוסיף נפח מתאים של פתרון אלקטרוליטים לבקבוק ולהשעות את פוספוליפיד כדי לקבל שתי מיליגרמות לכל השעיה פוספוליפיד מיליליטר.Sonciate ההשעיה במשך 20 עד 30 שניות באמצעות sonicator אמבטיה כדי לקבל השעיה קשה רב שכבתית. להכנת פרוטאוליפוזמים המכילים חלבונים ערוץ יון, מוסיפים פתרון חלבון המתלה קשה רב שכבתי. ו sonicate במשך כמה שניות באמצעות sonicator האמבטיה.כדי להכין פיפטים זכוכית גדולים נשא, מניחים נימי זכוכית במשוך פיפטה ולהמציא את micropipette עם קצה מחודד עדין דרך שני צעדים מושך. לאחר מכן להגדיר את micropipette על מיקרו לזייף ו ליצור קשר עם קצה micropipette כדי חוט פלטינה בחלק מחודד בקוטר של 30 עד 50 מיקרומטר. מחממים את הכלים לזמן קצר ומיד מכבים אותו.באמצעות מים מזוקקים ואתנול לנקות את פני השטח של מגלשת הזכוכית עם באר רדודה. לאחר מכן להחיל את reagent סיליקון על מגלשת הזכוכית ולתת את reagent להתייבש לחלוטין באוויר. לאחר מכן מניחים את מגלשת הזכוכית על הבמה של מיקרוסקופ הפוך.הוסף 100 מיקרוליטרים של הקסדקני לתוך הקן הרדוד של מגלשת הזכוכית הסיליקון. באמצעות מזרק שחפת למלא את פתרון האלקטרוליטים עד מחצית האורך של micropipette. לאחר מכן להגדיר את micropipette על מחזיק micropipette עם יציאת הלחץ, המאפשר אלקטרודה חוט כלוריד כסף / כסף כדי להשרות את פתרון אלקטרוליט פיפטה.חבר את אחד המחזיקים micropipette לשלב הראש של מגבר מהדק תיקון והשני לקרקע החשמלית. לאחר מכן לחבר microinjector ליציאת הלחץ של מחזיק micropipette. התאימו את המיקרופיגט למיקום מתאים מעל השלב של מיקרוסקופ הפוך באמצעות המיקרומניפולטור.כדי להתאים את פוטנציאל היסט האלקטרודה, מקם מיקרוליטר אחד של אותו פתרון אלקטרוליטים המשמש למילוי המיקרופיט על פני השטח השטוחים סביב באר רדודה של מגלשת הזכוכית כדי ליצור כיפת אלקטרוליטים. משרים את קצה שני המיקרופיטים בכיפת האלקטרוליטים. לאחר מכן להתאים את פוטנציאל היסט האלקטרודה של מגבר מהדק התיקון.כדי לצייר את פתרון ליפוזום מהטיפ, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון ליפוזום על פני השטח השטוחים סביב באר רדודה של זכוכית השקופית. במקום הבא קצה המיקרופיפט בליפוזום המכיל כיפה. שאפו את פתרון ליפוזום המכיל באמצעות microinjector.חזור על ההליך עבור mircopipette האחר עבור שאפתן ערוץ מחדש ליפוזומים. עכשיו למקם את micropipette בהקסאדקנה באר רדודה. לפוצץ בועת מים לאט על ידי הגדלת הלחץ עד הבועה מגיעה לגודל הרצוי ולשמור על אותו לחץ לאחר מכן.השלך את הבועה על ידי העברת הקצה דרך ממשק שמן האוויר אם קשה לשמור על גודל הבועה יציב. חזור על ההליכים עד שתי בועות יציבות נוצרות. צור קשר בין שתי הבועות.כוונן את הלחץ כדי לשמור על גודל הבועה, כי הגודל עשוי להשתנות בהדרגה אפילו בלחץ הבועה האינטר-בועה הקבוע. הגדר את פוטנציאל הממברנה לערך המתאים באמצעות מגבר טענת התיקון והמתן עד שזרם הערוץ יתגלה. עבור היווצרות bilayer השומנים יציב זה חיוני כדי לנקות את blotters.הכנת נימי זכוכית או פיפטה יש לשטוף ביסודיות ולהימנע זיהום על ידי מולקולות דטרגנט. לאחר CBB יצרו את מולקולות התעלה או בתסיפה מיקווית או בליפוזום הוכנסו באופן ספונטני לתוך bilayer בטווח של כמה עד עשרות דקות. הכנסת הערוצים אושרה על ידי עלייה צעד חכם של משרעת הנוכחית תחת פוטנציאל הממברנה להחיל.Bilayer שנוצר על ידי שיטת CBB ניתן לפורר לשני monolayers. זרם ערוץ pTB הופיע מיד לאחר חיבור שני monolayers. והזרם גדל ככל שמגע הגדיל את משרעת הזרם סונכרן עם המניפולציה של ה-CBB.אם מספר blow outs של בועות מגביר את ריכוז השומנים בתספור הממיקי פוחתת ואת monolayer לא נוצר. ואז לנסות להקל על הלחץ על סעיף ליפוזום. לאחר היווצרות CBB ו reconstitution ערוץ הוקמו אתה יכול לנסות לשנות קומפוזיציות של פתרון מים קרום באמצעות שפע או הזרקת חומרים הידרופיליים או הידרופוביים.שיטת CBB פתחה דרכים רב-תכליתיות לחקור את יחסי הגומלין בין הממברנות בערוץ.

lipid-bilayer-experiments-with-contact-bubble-bilayers-for-patch

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. זה וידאו המאמר מפרט כיצד ליצור תיקון באמצעות אלקטרודות תיקון bilayer, כמו גם כיצד להשתמש ערוצי gramicidin כמו כתבים של תכונות הממברנה משתנה.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Bilayers השומנים מישורי, הנקרא גם bilayers השומנים מלאכותית, מאפשרים לך ללמוד ניצוח יון ערוצי בסביבה מוגדרת היטב. הנה, אנחנו מדגימים את השלבים הפרט צריך להכין את החדר bilayer, האלקטרודות וכיצד הבדיקה bilayer מתאים ערוץ בודד במדידות.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך לחקירת ארגון ספטין על שכבה דו-שכבתית ליפידית הנתמכת בזכוכית במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת.

בדיקת דו-שכבתית ליפידית נתמכת מישורית: טכניקת מבחנה מבוססת מיקרוסקופיה לחקר הרכבת ספטין על חיקויי קרום ביולוגי

בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפוזומים קטן המכיל תעלות יונים.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

פרוטוקול זה מפרט את השימוש במערכת חימום מבוקרת טמפרטורת משוב כדי לקדם הרכבה מונולאייר השומנים ואת היווצרות bilayer ממשק טיפה עבור שומנים עם טמפרטורות התכה גבוהות, ומדידות קיבוליות לאפיון שינויים מונחי טמפרטורה בקרום.

הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

כאן פותחה מערכת דו-שכבתית של שומנים הנתמכת על ידי ננו-ברים כדי לספק קרום סינתטי עם עקמומיות מוגדרת המאפשרת אפיון של חלבונים בעלי יכולת חישת עקמומיות במבחנה.

מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

למד את שיטת Contact Bubble Bilayer ליצירת דו-שכבות שומנים לרישום ערוצי יונים בודדים. שיטה זו משלבת יתרונות של patch clamp ו-planar lipid bilayer לחקר אינטראקציות ממברנה-ערוץ.

השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

גלה סרטונים נוספים