השומנים Bilayer ניסויים עם בועה קשר Bilayers עבור תיקון-Clampers

שיטת בוליאר בועת מגע היא טכניקה חלופית עבור Bilayers השומנים קונבנציונאלי. ושיטה זו מאפשרת רטט רב-תכליתי יותר דרך הממברנה. שיטת CBB משלבת את היתרונות של Bilayer ליפיד פלנאר שיטת מלחציים תיקון.

כמו טכניקה bilayer השומנים CBB עם הרכב שומנים שרירותי יכול להיווצר. פיתחנו CBB להקלטות זרם ערוץ יחיד עם יחס אות גבוה לרעש. שיטה זו מאפשרת זנים של תנודות קרום ומציעה פלטפורמה מסוג עצום לממשק קרום הערוץ.

כולם חוו פיצוץ בועת סבון. תמרונים דומים נלקחים להיווצרות CBB על ידי כוונון ידני עדין של הלחץ המוחל במקום לנשוף בפה. להתאמן וליהנות CBB.

כדי להיות הליך זה לפזר פוספוליפידים בכלורופורם בריכוז הרצוי בבקבוקון תחתון עגול. מניחים את הפתרון פוספוליפיד על אידוי סיבובי מחובר צילינדר גז חנקן. סובב את הבקבוק תחת זרימת חנקן בטמפרטורת החדר עד שיופיע סרט פוספוליפיד דק.

לאחר מכן מניחים את הבקבוק הפתוח לתוך י desiccator המחובר למשאבת ואקום. באמצעות משאבת ואקום שאפו את החלק הפנימי של היודש במשך כמה שעות כדי להסיר את הכלורופורם ביסודיות. לאחר מכן להוסיף נפח מתאים של פתרון אלקטרוליטים לבקבוק ולהשעות את פוספוליפיד כדי לקבל שתי מיליגרמות לכל השעיה פוספוליפיד מיליליטר.

Sonciate ההשעיה במשך 20 עד 30 שניות באמצעות sonicator אמבטיה כדי לקבל השעיה קשה רב שכבתית. להכנת פרוטאוליפוזמים המכילים חלבונים ערוץ יון, מוסיפים פתרון חלבון המתלה קשה רב שכבתי. ו sonicate במשך כמה שניות באמצעות sonicator האמבטיה.

כדי להכין פיפטים זכוכית גדולים נשא, מניחים נימי זכוכית במשוך פיפטה ולהמציא את micropipette עם קצה מחודד עדין דרך שני צעדים מושך. לאחר מכן להגדיר את micropipette על מיקרו לזייף ו ליצור קשר עם קצה micropipette כדי חוט פלטינה בחלק מחודד בקוטר של 30 עד 50 מיקרומטר. מחממים את הכלים לזמן קצר ומיד מכבים אותו.

באמצעות מים מזוקקים ואתנול לנקות את פני השטח של מגלשת הזכוכית עם באר רדודה. לאחר מכן להחיל את reagent סיליקון על מגלשת הזכוכית ולתת את reagent להתייבש לחלוטין באוויר. לאחר מכן מניחים את מגלשת הזכוכית על הבמה של מיקרוסקופ הפוך.

הוסף 100 מיקרוליטרים של הקסדקני לתוך הקן הרדוד של מגלשת הזכוכית הסיליקון. באמצעות מזרק שחפת למלא את פתרון האלקטרוליטים עד מחצית האורך של micropipette. לאחר מכן להגדיר את micropipette על מחזיק micropipette עם יציאת הלחץ, המאפשר אלקטרודה חוט כלוריד כסף / כסף כדי להשרות את פתרון אלקטרוליט פיפטה.

חבר את אחד המחזיקים micropipette לשלב הראש של מגבר מהדק תיקון והשני לקרקע החשמלית. לאחר מכן לחבר microinjector ליציאת הלחץ של מחזיק micropipette. התאימו את המיקרופיגט למיקום מתאים מעל השלב של מיקרוסקופ הפוך באמצעות המיקרומניפולטור.

כדי להתאים את פוטנציאל היסט האלקטרודה, מקם מיקרוליטר אחד של אותו פתרון אלקטרוליטים המשמש למילוי המיקרופיט על פני השטח השטוחים סביב באר רדודה של מגלשת הזכוכית כדי ליצור כיפת אלקטרוליטים. משרים את קצה שני המיקרופיטים בכיפת האלקטרוליטים. לאחר מכן להתאים את פוטנציאל היסט האלקטרודה של מגבר מהדק התיקון.

כדי לצייר את פתרון ליפוזום מהטיפ, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון ליפוזום על פני השטח השטוחים סביב באר רדודה של זכוכית השקופית. במקום הבא קצה המיקרופיפט בליפוזום המכיל כיפה. שאפו את פתרון ליפוזום המכיל באמצעות microinjector.

חזור על ההליך עבור mircopipette האחר עבור שאפתן ערוץ מחדש ליפוזומים. עכשיו למקם את micropipette בהקסאדקנה באר רדודה. לפוצץ בועת מים לאט על ידי הגדלת הלחץ עד הבועה מגיעה לגודל הרצוי ולשמור על אותו לחץ לאחר מכן.

השלך את הבועה על ידי העברת הקצה דרך ממשק שמן האוויר אם קשה לשמור על גודל הבועה יציב. חזור על ההליכים עד שתי בועות יציבות נוצרות. צור קשר בין שתי הבועות.

כוונן את הלחץ כדי לשמור על גודל הבועה, כי הגודל עשוי להשתנות בהדרגה אפילו בלחץ הבועה האינטר-בועה הקבוע. הגדר את פוטנציאל הממברנה לערך המתאים באמצעות מגבר טענת התיקון והמתן עד שזרם הערוץ יתגלה. עבור היווצרות bilayer השומנים יציב זה חיוני כדי לנקות את blotters.

הכנת נימי זכוכית או פיפטה יש לשטוף ביסודיות ולהימנע זיהום על ידי מולקולות דטרגנט. לאחר CBB יצרו את מולקולות התעלה או בתסיפה מיקווית או בליפוזום הוכנסו באופן ספונטני לתוך bilayer בטווח של כמה עד עשרות דקות. הכנסת הערוצים אושרה על ידי עלייה צעד חכם של משרעת הנוכחית תחת פוטנציאל הממברנה להחיל.

Bilayer שנוצר על ידי שיטת CBB ניתן לפורר לשני monolayers. זרם ערוץ pTB הופיע מיד לאחר חיבור שני monolayers. והזרם גדל ככל שמגע הגדיל את משרעת הזרם סונכרן עם המניפולציה של ה-CBB.

אם מספר blow outs של בועות מגביר את ריכוז השומנים בתספור הממיקי פוחתת ואת monolayer לא נוצר. ואז לנסות להקל על הלחץ על סעיף ליפוזום. לאחר היווצרות CBB ו reconstitution ערוץ הוקמו אתה יכול לנסות לשנות קומפוזיציות של פתרון מים קרום באמצעות שפע או הזרקת חומרים הידרופיליים או הידרופוביים.

שיטת CBB פתחה דרכים רב-תכליתיות לחקור את יחסי הגומלין בין הממברנות בערוץ.