הכנת חרוזים₂ Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO לטיהור חלבון

שיטה זו יכולה לשמש להכנת משטחים המופעלים על ידי ביומולקול, אשר יש יישומים בתחומים כגון אספקת תרופות, זיהוי יעד ביולוגי, והפרדה ביולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מברשות PFPA פולי מגיבים מאוד עם אמינים, ואת ההשתקה של נוגדנים מושגת על ידי דגירה בת פתרון חיץ במשך כמה שעות. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיהור החלבון באמצעות immunopurification, כמו נוגדן משותק יכול להיקשר בהצלחה עם אנטיגנים היעד.

למרות שיטה זו היא להפגין עבור גיוס נוגדנים וטיהור חלבון, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות הדורשות גיוס ביומולקולרי. כדי לטפל גם גם ב-APTES, יש להשיג תחילה חלקיקי דו תחמוצת הסיליקון בצורה של השעיה מיקווית בנפח 5%. לשלב 0.8 מיליליטר של השעיית דו תחמוצת הסיליקון עם 40 מיליגרם של APTES, ושמונה מיליליטר של מתנול בבקבוקון 20 מיליליטר scintillation מצויד בר ערבוב.

אפשר לתגובה להמשיך בטמפרטורת החדר במשך חמש שעות עם ערבוב נמרץ. לאחר חמש שעות, להעביר את הפתרון לצינור חרוט. כדי לבודד את גם גם הגידור הדו-חמצני הפונקציונלי של APTES, יש לבודד את הפתרון ב-10,000 ג'י למשך חמש דקות.

ואז להסיר את העל-טבעי. עכשיו לשטוף את חרוזים על ידי תיפוף מחדש אותם בשלושה מיליליטר של מתנול טרי. לחץ את הצינור ביד לערבוב, אבל במידת הצורך, לשפר את הפיזור על ידי sonication באמבט מים במשך כמה שניות.

צנטריפוגה כמו קודם, ולחזור על שלב לשטוף עוד פעם אחת. ערבבו את חמוזי הסיליקון הדו-חמצני עם שלושה מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד, או DMSO. לחץ את התערובת ביד, או במידת הצורך, sonicate במשך כמה שניות עד חרוזים מפוזרים באופן מלא ב- DMSO.

לאחר צנטריפוגה לפני, להסיר את על טבעי. חזור על שלב הצנטריפוגה בפעם האחרונה כדי להבטיח חילופי ממסים שלמים ממתנול ל- DMSO. כדי להכין את פתרון PFPA פולי, להמיס 20 מיליגרם של פולי PFPA בשני מיליליטר של DMSO בבקבוקון 20 מיליליטר scintillation.

כדי להכין פתרון PEG, להמיס אמין פונקציונלי PEG במיליליטר אחד של DMSO. כעת העבר את פתרון PEG לפתרון פולי PFPA. מגיבים בטמפרטורת החדר במשך שעה עם ערבוב נמרץ.

העבר מיליליטר אחד של גם דם דו-חמצני פונקציונלי של APTES המושעה ב-DMSO לתוך פתרון ה-PFPA של פולי PFPA שהוחלף ב-PEG. אפשר השתלה בין פולי PFPA ו APTES פונקציונלי סיליקון דו חמצני חרוזים להמשיך בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת עם ערבוב נמרץ. ואז לבודד את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 G במשך חמש דקות, ואחריו הסרת העל טבעי.

לשטוף את חרוזים על ידי הוספת שלושה מיליליטר של DMSO, ומערבבים ביד או עם כמה שניות של sonication. צנטריפוגה את חרוזים כמו קודם. ולהסיר את supernatant לפני לחזור לשטוף DMSO פעמיים.

לשטוף את חרוזים פעמיים נוספות עם שלושה מיליליטר של מים מזוקקים משולשים. ואז לערבב ביד או עם כמה שניות של sonication. צנטריפוגה את חרוזים כמו קודם ולהסיר את supernatant.

לבסוף לייבש את חרוזים ב 40 מעלות צלזיוס בתנור ואקום לילה. הוסף חמישה מיליגרם של פולי PFPA מושתל סיליקון דו חמצני גם צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לשטוף את חרוזים על ידי הוספת 800 microliters של PBS, ומערבבים היטב על ידי מערבולת.

צנטריפוגה את חרוזים ב 10, 000 גרם בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. הסר את העל-טבעי, וחזור על שלב הכביסה שלוש פעמים. עכשיו להוסיף 350 microliters של PBS טרי, 50 microliters של 0.1% PBST, ו 6.67 מיקרוגרם של הנוגדן.

דגירה כ 20 שעות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את חרוזים צנטריפוגה ב 400 G ו 4 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את העל-טבעי והוסף בזהירות 400 מיקרוליטרים של מאגר תיזה.

בעדינות resuspend את חרוזים על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים. חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר הכביסה הסופית, להסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר.

הכן תאים ומאגר תזה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בכדור התא עם 400 מיקרוליטרים של מאגר התיזה. Sonicate התאים באמצעות קוליטור אולטרה.

לאחר sonication, מערבולת בקצרה. ואז צנטריפוגה lysate ב 20, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. העבר את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה חדש באורך 1.5 מיליליטר.

כדי לבצע immunoprecipitation, להעביר 300 microliters של ליסס תאים נוגדנים שהוכנו בעבר משותק פולי PFPA מושתל חרוזי סיליקון דו חמצני. שמור על 30 מיקרוליטרים של התא lysate כמו מדגם קלט בצינור microcentrifuge חדש. דגירה תערובת גם גם את תערובת גם גם 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות על מסובב ב-4 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התערובת ב 400 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. הסר את העל-טבעי והוסף בזהירות 400 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה. בעדינות resuspend את חרוזים על ידי צינור למעלה ולמטה כחמש פעמים.

לאחר שלוש שטיפות, להסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר. הוסף 30 מיקרוליטרים של צבע טעינת SDS 2x לדגימה של הקלט. ואז לחמם אותם במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.

לאחר החימום, לנתח את המדגם באמצעות סופג מערבי, או לאחסן את המדגם במינוס 20 מעלות צלזיוס. קדזי הסיליקה הפונקציונליים נבדקים על ידי ספקטרוסקופיית פוטואלקטרון רנטגן, או XPS, כדי לקבוע את הרכב פני השטח. נתוני XPS מייצגים מוצגים כאן.

בעקבות טיפול APTES, שיא חנקן 1s הקשורים לאזור קבוצת אמין APTES מזוהה. לאחר טיפול PFPA פולי, פסגת פלואור 1s הקשורים ליחידות PFP על הפולימר מזוהה. RNA קינאז חלבון מופעל, או העשרת PKR באמצעות immunoprecipitation מבוצעת, ואת דגימת החלבון רמז מנותחים באמצעות סופג מערבי.

כצפוי, חרוזים משותקים ללא נוגדנים, או תערובת נוגדנים לא ספציפית מראים שאין התאוששות PKR. חרוזים דגירה עם אנטי PKR יכול להעשיר בהצלחה PKR כפי שצוין על ידי נוכחות של להקת PKR והיעדר הלהקה GAPDH. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי בעת השוואת מערכות, ניסויי IP, כמו גם ניתוח סופג המערבי הבאים צריך להיעשות בו זמנית.

לאחר התפתחותה, טכניקה זו יכולה לשמש לשתק של מצע ביומולקולרי או חומר שונה. יתר על כן, שיטה זו יש את היתרון הנוסף של כוונון רק רכוש פני השטח כדי להיות מותאם לצרכים של כל יישום.