Name: הכנת חרוזים2 Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO לטיהור חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: חקור הכנת חרוזי סיליקה מותמרים ב-poly(PFPA) לטיהור חלבון באמצעות נוגדנים קשורים. שיטה זו מאפשרת הפרדת חלבונים יעילה ויישומים ביומולקולריים מגוונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי סוכנות לפיתוח הגנה (מענק מס ' UD170039ID).

1. הכנת Poly(PFPA) Homopolymer
<ol><li>Recrystallization של AIBN<ol>
<li>לשלב 5 g של 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) עם 25 מ של מתנול ב גביע 250 מ. לטבול את הספל באמבט שמן 60 ° C, ואז נמרצות ומערבבים את התערובת עם בר-מערבבים עד התפרקה לחלוטין AIBN.</li>
		<li>לסנן את הפתרון חמים באמצעות נייר סינון (5-8 μm חלקיקים השמירה) ולאחסן את פילטרט של 4 ° C כדי לאפשר לגבישים טופס לאט.</li>
		<li>לאסוף את AIBN recrystallized על ידי סינון. לשלב את המוצר שנאספו עם 25 מ של מתנול טריים וחזור על התהליך recrystallization.</li>
		<li>יבש את 2 x AIBN recrystallized בתנור ואקום בטמפרטורת החדר (RT) בן לילה. לאחסן את המוצר בחושך ב <-10 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>סינתזה של בנזיל dithiobenzoate25<ol>
<li>להכין בקבוקון סיבוב למטה שלוש-צוואר 500 מ"ל מצויד עם פס מגנטי stir, הקבל refluxing, משפך יורד על מחצה גומי. לחבר את הבקבוקון אל קו גז חנקן דרך מעבה refluxing ואת לשטוף מבפנים אוויר עם חנקן. הוספת מד חום דרך מחצה. להוסיף 41 מ"ל (0.041 mol) של 1 מ' פתרון של phenylmagnesium ברומיד tetrahydrofuran (THF) באמצעות מזרק מחצה אותו.</li>
		<li>חממו את הפתרון phenylmagnesium ברומיד עד 40 ° צלזיוס באמבט שמן. לאחר מכן להוסיף 3.1 g (0.041 mol) של פחמן דיסולפידי דרך המשפך יורד לאט, שמירה על הטמפרטורה הפתרון ב- 40 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להוסיף 7.1 גרם (0.042 mol) בנזיל ברומיד לתערובת הנובעת דרך המשפך יורד מעל 15 דקות להגביר טמפרטורת התגובה עד 50 מעלות צלזיוס. המשך ערבוב בטמפרטורה זו למשך 45 דקות.</li>
		<li>להעביר את התערובת התגובה משפך, לדלל עם 15 מ"ל מים קרים קרים. לחלץ את המוצר על-ידי הוספת 15 מ"ל של דיאתיל אתר ולהסיר את שכבת מים נמוכה יותר. חזור על החילוץ עם דיאתיל אתר עוד פעמיים.</li>
		<li>לשטוף את שלבי אורגני בשילוב עם כמות שופע מים, אז מי מלח (פתרון של 50% (w/v) NaCl במים) ויבש המוצר מעל נטול מים מגנזיום גופרתי.</li>
		<li>הסר הממס בואקום ב 35 ° C באמצעות המאדה.</li>
		<li>לטהר את המוצר על ידי גזים עמודה באמצעות 400 מ של סיליקה ג'ל (גודל הנקבוביות 60 Å, 63-200 רשת שינוי גודל החלקיקים) ואתר נפט כמו eluent, מניב 5 גר' בנזיל dithiobenzoate (BDB) כמו שמן אדום. לאשר את הטוהר המוצר על ידי 1H NMR (400 מגה-הרץ, CDCl3): אלפא 8.02-7.99 (2 H, m), 7.55-7.50 (1 H, m), 7.41-7.29 (7 H, m), 4.60 (2 H, s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>סינתזה של poly(PFPA) באמצעות רפסודה הפילמור9,26<ol>
<li>זמינים מסחרית PFPA מונומר מכיל כמות קטנה של מעכבי. לפני הפילמור, הסר את מעכבי על ידי מעבר של מונומר מזרק חד פעמיות גדוש אלומינה בסיסי.</li>
		<li>להוסיף 0.4 מ"ג (0.0024 mmol) של AIBN recrystallized, 4.3 מ ג (0.018 mmol) של BDB, 1012 מ ג (4.25 mmol) נטול מעכבי PFPA ו- 0.7 מ של anisole נטול מים בקבוקון schlenk ב 20 מ.</li>
		<li>להתחבר את הבקבוקון schlenk ב קו, דגה את התערובת לפחות שלושה מחזורים ההקפאה-משאבות-הפשרה. בקצרה, הקפאת תערובת התגובה באמבט חנקן נוזלי. החל ואקום להסיר את הגז בתוך קראוון. לאטום את הבקבוקון ולאחר מכן הסר מן חנקן נוזלי כדי לאפשר את התוכן להפשיר-RT.</li>
		<li>מקם את הבקבוקון באמבט שמן 70 מעלות צלזיוס, להגיב במשך 4 שעות תחת מחק לצמיתות2 N.</li>
		<li>לסיום התגובה, להסיר את הבקבוק. את האמבטיה שמן ולחשוף את תוכן התגובה לאוויר.</li>
		<li>לזרז הפולימר תוך קר מתנול, ואז לייבש הפולימר התאושש בתנור ואקום ב 40 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>כדי למדוד את המשקל המולקולרי של פולימר, השתמש ג'ל הסתננות כרומטוגרפיה (GPC). השתמש THF שלב ניידים 35 ° C עם 1 מ"ל לדקה קצב ושפע לבנות את עקומת כיול באמצעות סטנדרטים פוליסטירן monodisperse. לרכוש GPC מדידה, להמיס הפולימר THF (1-2 mg/mL), מסנן דרך מסנן טפלון חד פעמיות (PTFE) μm 0.2. מזריקים μL 100 המדגם לתוך הכלי GPC. להמיר את זמן השמירה מדגם נמדד משקל מולקולרי באמצעות עקומת כיול פוליסטירן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת Poly(PFPA) Functionalized SiO2 חרוזים
<ol><li>טיפול של חרוזים2 SiO עם APTES<ol>
<li>חלקיקי2 SiO זמינים בצורה של השעיה מימית 5% (w/v). משלבים 0.8 מ של השעיה2 SiO עם 40 מ ג של APTES ו- 8 מ של מתנול בבקבוקון נצנוץ 20 מ ל מצויד בר מערבבים.</li>
		<li>לאפשר את התגובה להמשיך ב RT עבור 5 שעות עם בחישה נמרצת.</li>
		<li>להעביר את הפתרון צינור חרוטי. כדי לבודד את APTES functionalized SiO2 חרוזים, centrifuge את הפתרון ב g x 10,000 למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע. לשטוף את החרוזים על ידי פיזור אותם מחדש ב- 3 מ"ל של מתנול טריים. לנער את הצינורית ביד ערבוב, אבל אם יש צורך, לשפר את הפיזור מאת sonication באמבט מים במשך כמה שניות. Centrifuge החרוזים-g 10,000 x עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, חזור על השלב לשטוף עוד פעם אחת.</li>
		<li>לשלב את מתנול שטף חרוזים2 SiO עם 3 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). לנער את התערובת ביד, או אם יש צורך sonicate לכמה שניות, עד החרוזים מופצים באופן מלא בדימתיל סולפוקסיד. Centrifuge את החרוזים ב g x 10,000 למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע. חזור על השלב כדי להבטיח exchange הממס מלאה של מתנול דימתיל סולפוקסיד. הערה: התליה האחרון מכיל את APTES functionalized חרוזים2 SiO התפזרו 4 מיליליטר דימתיל סולפוקסיד.</li>
		<li>כדי לבדוק את התפלגות גודל החלקיקים, לבצע ניתוח DLS. קחו טיפה אחת של ההשעיה מוכן שלב 2.1.4 ובמקום לתוך cuvette חד פעמיות UV. לדלל את הדגימה על ידי ממלא את cuvette דימתיל סולפוקסיד טריים עד 2/3 מלא. הכנס את הדגימה בעל תא להתחיל קירור והקפאה. למדידה גודל החלקיקים, השתמש בפרמטרים ההתקנה הבאים: טמפרטורה: 25 ° C; Equilibration זמן: 120 s; משך זמן המדידה: אוטומטי.</li>
		<li>כדי לבדוק את ההרכב משטח, לבצע ניתוח XPS. יבש מדגם קטן של המתלה מוכן בשלב 2.1.4 בתנור ואקום ב 40 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לוקחים את הפולימר יבשים ארוז בצורה שווה על גבי בעל מדגם 0.5 ס מ x 0.5 ס מ. לטעון את הדגימה אל החדר ואקום גבוה (10-8 טנדר של גוה של) ולהתחיל קירור והקפאה. עבור כלי XPS מסוימת בשימוש, ליצור את photoelectrons באמצעות רנטגן Kα אל מונוכרומטי פעלו בגיל 15 kV 6.7 mA ו לאסוף באמצעות הגדלה מצב היברידית במנתח-eV 50 עוברים אנרגיה ספקטרה ברזולוציה גבוהה, eV 100 להעביר אנרגיה עבור סקרים היסודות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכבה poly(PFPA) כדי APTES functionalized SiO2 חרוזים<ol>
<li>הכינו את הפתרון poly(PFPA) על ידי המסת 20 מ ג של poly(PFPA) ב 2 מ של דימתיל סולפוקסיד בבקבוקון נצנוץ 20 מ. הערה: מחקר זה poly(PFPA) משקל מולקולרי נמוך יחסית (20 ק ג/mol) משמש. לכן, למרות הריכוז גבוה פולימר (10 mg/mL), אין עדות פולימר crosslinking הוא ציין. אם פולימר משקל מולקולרי גבוה, ואז פולימר פתרון ריכוז אולי צריכים להיות מותאמים כדי להימנע crosslinking אפשרי.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של APTES functionalized חרוזים2 SiO הושעו ב דימתיל סולפוקסיד (מתוך שלב 2.1.4) לפתרון של poly(PFPA). להגיב ב RT לשעה עם בחישה נמרצת.</li>
		<li>לבודד את החרוזים2 SiO poly(PFPA) הושתל על ידי צנטריפוגה ב g x 10,000 למשך 5 דקות, ואחריו הסרת תגובת שיקוע. לשטוף את החרוזים על-ידי הוספת 3 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד ואת תערובת ע י ניעור או עם היד או כמה שניות של sonication. Centrifuge את החרוזים ב g x 10,000 למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע. חזור על הכביסה של חרוזים2 SiO poly(PFPA) הושתל עם דימתיל סולפוקסיד פעמיים.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים פעמיים יותר עם מים מזוקקים טריפל (TDW). בשלב זה, לשלב את החרוזים עם 3 מ של TDW, ולאחר מכן מערבבים ע י ניעור עם היד או כמה שניות של sonication. Centrifuge את החרוזים ב g x 10,000 למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>כדי לבדוק את התפלגות גודל החלקיקים, לבצע DLS בעקבות ההליך שמתואר בשלב 2.1.5. כדי לבדוק את הכימיה. משטח, לבצע XPS בעקבות ההליך שמתואר בשלב 2.1.6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת SiO2 חרוזים הושתל עם Poly(PFPA) שהוחלפו פג
<ol><li>כדי להכין את הפתרון poly(PFPA), לפזר 20 מ ג של poly(PFPA) ב 2 מ של דימתיל סולפוקסיד בבקבוקון נצנוץ 20 מ.</li>
	<li>כדי להכין פתרון פג, התמוססות אמין-functionalized פג ב 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד. הכמות המדויקת של פג להשתמש נקבעת על-פי מידת הרצוי של החלפת ה-PFP, נקבעים על-ידי המשוואה המוצג להלן: כמות אמינו-יתד (g/g-poly(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x % פג-Sub) x (MW_PEG / MW_poly(PFPA)) איפה N_poly(PFPA) = poly(PFPA) מידת פלמור % פג-Sub = אחוז החלפת פג MW_PEG = משקל מולקולרי של אמינו-יתד MW_ poly(PFPA) = משקל מולקולרי של poly(PFPA)</li>
	<li>להעביר את הפתרון פג הפתרון poly(PFPA). להגיב ב RT לשעה עם בחישה נמרצת.</li>
	<li>להכין APTES functionalized חרוזים2 SiO הושעו ב דימתיל סולפוקסיד, זהה השלבים המוצגים ב 2.1 צעד. העברת 1 מ"ל של ההשעיה חרוז בתוך תמיסת poly(PFPA) שהוחלפו פג המבושלות שלב 3.3. לאפשר משתילים בין poly(PFPA) לבין APTES functionalized חרוזים2 SiO להמשיך ב RT לשעה עם בחישה נמרצת.</li>
	<li>לבודד את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב g x 10,000 למשך 5 דקות, ואחריו הסרת תגובת שיקוע. לשטוף את החרוזים על-ידי הוספת 3 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד ואת תערובת ע י ניעור או עם היד או כמה שניות של sonication. Centrifuge את החרוזים ב g x 10,000 למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע. חזור על כביסה דימתיל סולפוקסיד פעמיים.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים פעמיים יותר עם TDW. בשלב זה, לשלב את החרוזים עם 3 מ ל TDW, ואז לערבב ע י ניעור עם היד או כמה שניות של sonication. Centrifuge את החרוזים ב g x 10,000 למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>יבש את החרוזים ב 40 מעלות צלזיוס בתנור ואקום למשך הלילה.</li>
</ol>4. נוגדן הנייח על Poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים
הערה: ההליך משמש בין אחוז החלפת פג ב- poly(PFPA). להכין תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) על ידי המסת PBS טבלית TDW. להכין תמיסת מלח פוספט buffered 0.1% (v/v) עם Tween-20 (PBST) על-ידי הוספת 1/1000 Tween-20 PBS.
<ol><li>הוסף 5 מ ג של poly(PFPA) הושתל חרוזים2 SiO לרכבת התחתית microcentrifuge 1.5 mL.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים על-ידי הוספת µL 800 של PBS, לערבב היטב על ידי vortexing. Centrifuge החרוזים ב 10,000 x g ב- RT עבור דק 1. הסר את תגובת שיקוע, חזור על השלב שטיפת שלוש פעמים.</li>
	<li>להוסיף 350 µL של PBS טריים, 50 µL 0.1% (v/v) PBST µg 6.67 של הנוגדן. דגירה ~ 20 h ב- מסובב ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים להסיר נוגדנים לא מאוגד. Centrifuge את החרוזים ב 400 x g ו 4 ° C עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע והוסף µL 400 פירוק מאגר בקפידה. בעדינות מחדש להשעות את החרוזים על-ידי pipetting למעלה ולמטה במשך חמש פעמים. הערה: פירוק מאגר נהגו לרחוץ את החרוזים צריכה להיות זהה אחד בשימוש במהלך פירוק תאים ו- IP, פרט לכך התוספת של מעכבי פרוטאז ו- dithiothreitol הם אופציונליים, (ראה שלב 5).</li>
	<li>חזור על שלב זה שטיפת שלוש פעמים. לאחר השטיפה הסופית להסיר את תגובת שיקוע ככל האפשר.</li>
</ol>5. התא פירוק Immunoprecipitation
<ol><li>הכנת מאגר פירוק ומאגר לשטוף<ol>
<li>הכנת המאגר פירוק (50 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 100 מ מ אשלגן כלורי, 0.5% (v/v) NP-40, 10% (v/v) גליצרול, 1 מ dithiothreitol (DTT), פרוטאז מעכב קוקטייל).</li>
		<li>הכנת המאגר לשטוף (50 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 100 מ מ אשלגן כלורי, 0.1% (v/v) NP-40, ו- 10% (v/v) גליצרול).</li>
		<li>לאחסן את מאגר הפתרונות ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של תאים<ol>
<li>זרע התאים (הלה תאים) יום או יומיים לפני הניסוי IP, לגדל את התאים-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
		<li>לאסוף כ 1.4 x 107 תאים עם תא במגרדת, העברת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים ב g x 380-RT במשך 3 דקות להסיר את תגובת שיקוע, להשהות מחדש עם 1 מ"ל של PBS קר והעברת לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב g x 10,000 ב 4 ° C עבור הסרה ס' 30 תגובת שיקוע מהוללים. ניתן לאחסן תא כדורי ב-80 מעלות צלזיוס לאחר הסרת את תגובת שיקוע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת תא lysates<ol>
<li>מחדש להשעות בגדר תא עם 400 µL של המאגר פירוק. Sonicate התאים באמצעות של ultrasonicator.</li>
		<li>Sonication, מערבולת בקצרה, צנטריפוגה lysate ב g 20,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL החדש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunoprecipitation<ol>
<li>העברת 300 µL תא lysate של נוגדנים מוכנים בעבר מודגרות poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים. שומרים על 30 µL של התא lysate בתור מדגם קלט צינור microcentrifuge. חנות המדגם קלט ב 4 º C. הערה: הסכום הכולל של החלבון בתא lysate צריך להיות כ- 4 מ ג.</li>
		<li>דגירה התערובת lysate/חרוזים עבור h 3 ב מסובב ב 4 º C.</li>
		<li>Centrifuge התערובת ב 400 g x ב 4 ° C עבור דק 1. הסר את תגובת שיקוע והוסף µL 400 שטיפת מאגר בקפידה. בעדינות מחדש להשעות את החרוזים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.</li>
		<li>חזור על שלב זה שטיפת שלוש פעמים. לאחר השטיפה הסופית להסיר את תגובת שיקוע ככל האפשר.</li>
		<li>להכין 2 x נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) טוען צבען (25% (v/v) גליצרול, 0.1% (w/v) ברומו פנול כחול (BPB), 60 מ מ טריס-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) מרחביות, מ מ 2.75 מרקפטואתנול). חנות 2 x מרחביות לצבוע טעינה ב-20 ° C. להוסיף 30 µL של 2 x מרחביות הטעינה לצבוע את החרוזים של המדגם קלט מאוחסן, וחימום 10 דקות ב 95 ° C.</li>
		<li>לאחר חימום, לנתח את הדגימה באמצעות ווסטרן סופג27, או לאחסן את הדגימה ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li>
<li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li>
<li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+%27chemical+nose%27+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li>
<li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li>
<li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li>
<li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+Ester+Containing+Polymers%3A+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pola.26200">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li>
<li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+universal+method+toward+light-responsive+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li>
<li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/pj20166">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li>
<li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li>
<li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+defined+adjustment+of+surface+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li>
<li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/jm/b913753j">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li>
<li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014305705000649">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li>
<li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores%3A+a+method+toward+molecular+logic+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li>
<li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1381514813002514">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li>
<li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li>
<li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+grafting+of+poly%28pentafluorophenyl+acrylate%29+onto+oxides%3A+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li>
<li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine-Reactive+Poly%28pentafluorophenyl+acrylate%29+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li>
<li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li>
<li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li>
<li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li>
<li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+biomimetic+materials%3A+nonfouling+poly+%28carboxybetaine%29+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHS-ester+functionalized+poly%28PEGMA%29+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+%283D%29+substrates+for+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li>
<li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma020882h">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li>
<li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma900945s">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma202700y">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הסינתזה של poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים מודגם באיור1. על ידי שימוש APTES כ מולקולה מקשר, ניתן להכין מברשות poly(PFPA) covalently הושתל. המצע2 SiO באמצעות תהליך בן שני שלבים פשוטים. למרות כמה יחידות ה-PFP מוקרבים על התגובה עם APTES, מספר גדול של יחידות ה-PFP צפויים להישאר זמינים עבור התגובה מאוחר יותר עם אמינו-יתד או נוגדנים. הקבוצות PFP ידועים כדי ליצור אנרגיה נמוכה משטחים אז מברשות poly(PFPA) לא solvate גם מים28. עבור יישום ה-IP, הנוגדנים צריך ל...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58843/preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads">Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification</a>.&#160; Throughout the article, the term &#34;3-aminopropyltriethoxysilane&#34; has been replaced with &#34;3-aminopropyltrimethoxysilane&#34;, and &#34;APTES&#34; with &#34;APTMS&#34;.

Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

מברשות פולימר תגובתי קיבלו את עניין רב בשנים האחרונות. הם יכולים לשמש כדי לשתק מולקולות פונקציונלי על חומרים אורגני או לא ליצירת משטחים מופעל עם יישומים בתחומים כמו איתור והפרדה1,2,3,4, 5. בין פולימרים תגובתי דיווח, אלה המכילים pentafluorophenyl אסתר יחידות שימושיים בעיקר בשל שלהם תגובתיות גבוהה עם אמינים והתנגדות כלפי הידרוליזה6. אחד פולימר כזה הוא poly(PFPA), זה יכול להיות בקלות functionalized שלאחר הפילמור עם מולקולות המכילות אמינים ראשית או משנית7,8,9,10. בדוגמה אחת, מברשות poly(PFPA) היו הגיבו אמינו-spiropyrans ליצירת משטחים אור מגיב7.
הכנת poly(PFPA) ושימושיה תוארו במספר הקודם פרסומים6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. בפרט, Theato ועמיתים דיווחו על הסינתזה של מברשות poly(PFPA) דרך "הרכבה כדי" וגם "הרכבה של" שיטות7,8,10,11,12 . ב "משתילים על" הגישה, מבחן פוליגרף (methylsilsesquioxane)-פולי (אקרילט pentafluorophenyl) (poly(MSSQ-PFPA)) היברידית פולימר היה מסונתז8,10,11,12. הרכיב poly(MSSQ) היה מסוגל הדבקה חזקה טופס עם מספר של משטחים אורגניים ואנאורגניים שונים, ובכך מאפשר את הרכיב poly(PFPA) ליצור שכבת מברשת על פני השטח חומרים מצופים. "משתילים מ" הגישה, משטח יזם תוספת הפיך, פיצול שרשרת העברת (סי-רפסודה) הפילמור הועסק להכין מברשות poly(PFPA)7. במקרה זה, סוכן העברת השטח שרשרת קיבוע (סי-CTA) היה הראשון covalently למצע באמצעות התגובה סיליקה-silane. קיבוע של סי-CTA ואז השתתפו סי-רפסודה פלמור של מונומרים PFPA, יצירת מברשות poly(PFPA) בצפיפות עם הצמדה קוולנטיות יציב המצע.
על ידי ניצול מברשות poly(PFPA) מסונתז באמצעות סי-רפסודה פלמור, לאחרונה להדגים את הנייח של נוגדנים על חלקיקי סיליקה poly(PFPA) הושתל ויישומם עוקבות חלבון טיהור18. השימוש poly(PFPA) מברשות נוגדן הנייח נמצאה כדי לפתור מספר בעיות הקשורות הנוכחי ההפרדה חלבון באמצעות ה-IP. IP קונבנציונאלי מסתמך על השימוש של חלבון A/G כמו מקשר (linker) נוגדן הנייח19,20,21. מאז השימוש של חלבון A/G מאפשר את הנוגדנים להיקשר עם כיוון הדפסה ספציפי, מושגת המטרה גבוהות אנטיגן התאוששות יעילות. עם זאת, השימוש של חלבון A/G סובל אינטראקציית חלבון שאינם ספציפיים, כמו גם האובדן של נוגדנים במהלך ההתאוששות חלבון, אשר שניהם תורמים רמה גבוהה של רעש רקע. כדי לפתור חסרונות אלה, crosslinking ישירה של הנוגדנים כדי תמיכה מלאה כבר בחנו22,23,24. היעילות של טכניקות אלה הוא בדרך כלל נמוך בגלל הכיוון האקראי של נוגדנים תפור. המצע poly(PFPA) הושתל, הנייח של נוגדנים הוא קבוע, מושגת באמצעות exchange התגובה בין יחידות ה-PFP ופונקציונליות אמין על נוגדנים. כיוון נוגדן אמנם עדיין אקראי, המערכת מועילה מהצורך תגובתי PFP אתרים רבים, לשליטה על ידי מידת פלמור. יתר על כן, הראינו כי על ידי החלפת חלקי של ה-PFP יחידות עם אמינו-פג, hydrophilicity פני השטח ניתן לכוונן, ושיפור היעילות התאוששות חלבון מערכת18. בסך הכל, חלקיקי סיליקה poly(PFPA) הושתל הוצגו להיות חלופה יעילה IP מסורתי עם יעילות סבירים, כמו גם הרבה רקע נקי יותר.
בתרומה זו, מדווחים שיטה חלופית כדי להכין משטח המושתל poly(PFPA) נוגדנים הנייח ויישום ה-IP. בתהליך בן שני שלבים פשוטים, כמופיע באיור 1, מולקולה מקשר APTES קודם הופקד על גבי המשטח סיליקה, ולאחר מכן הפולימר poly(PFPA) covalently מחובר המולקולה מקשר דרך התגובה בין היחידות PFP על פולימר ולפונקציה אמין על APTES. שיטת הכנה זו מאפשרת crosslinking קבוע של poly(PFPA) על משטח המצע, אך מונע סיבוכים רבים הקשורים סינתזה סי-CTA ו- SI-רפסודה פלמור של מברשות poly(PFPA). החלפה חלקית של יחידות ה-PFP עם אמינו-יתד ניתן עדיין לבצע, שמאפשר כוונון של המאפיינים משטח של מברשת פולימר. אנו מראים חרוזים סיליקה poly(PFPA) הושתל ובכך מוכן יכול להיות מרותק למיטה עם נוגדנים ונועד לשמש העשרה חלבונית דרך IP. הליך הכנת חרוזים מפורט, נוגדן הנייח, ובדיקות IP מתועדים במאמר זה, עבור הקוראים ומעוניינים אלטרנטיבה קונבנציונאלי חלבון A/G מבוסס IP.

<table><tbody><tr><td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td> <td>Daejung Chemicals</td><td>1102-4405</td><td></td></tr><tr><td>מתיל אלכוהול ל-HPLC, 99.9%</td> <td>Duksan Pure Chemicals</td><td>d62</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פנילמגנזיום ברומיד 1.0&nbsp; M ב-THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>פחמן דיסולפיד נטול מים, &ge; 99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>335266</td><td></td></tr><tr><td>בנזיל ברומיד, 98%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B17905</td><td></td></tr><tr><td>אתר נפט, 90%</td> <td>Samchun Chemicals</td><td>P0220</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אתר, 99%</td> <td>Daejung Chemicals</td><td>4025-4404</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי נטול מים, אבקה, &nbsp; 99%</td> <td>Daejung Chemicals</td><td>5514-4405</td><td></td></tr><tr><td>Pentafluorophenyl acrylate</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-264001</td><td>מכיל מעכב</td></tr><tr><td>תחמוצת אלומיניום, פעיל, בסיסי, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Daejung Chemicals</td><td>7548-4400</td><td></td></tr><tr><td>אניזול נטול מים, 99.7%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>296295</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי סיליקה ננו-חלקיקים</td><td>מיקרו-חלקיקים GmbH</td><td>SiO2-R-0.7</td><td>5% w/v תרחיף מימי</td></tr><tr><td>3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0%</td> <td>Tokyo Chemical Industry</td><td>T1255</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד עבור HPLC, &ge; 99.7%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>פולי (אתילן גליקול) פולי (אתילן גליקול) מתיל אתר</td><td>פולימרי מקור</td><td>P16082-EGOCH3NH2</td><td></td></tr><tr><td>טבלית מלח חוצצת פוספט</td><td>Takara</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Calbiochem</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.0)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM9640G</tr><tr><td>NP-40</td><td>VWR</td><td>E109-50ML</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>Biosesang</td><td>D1037</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז</td><td>Merck</td><td>535140-1MLCN</td><td></td></tr><tr><td>ברומו פנול כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 6.8)</td><td>ביו-תמיסה</td><td>BT033</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Biosolution</td><td>BS003</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>PKR טכנולוגיית איתות תאי</td><td>נוגדנים</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GAPDH</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-32233</td><td></td></tr><tr><td>ארנב רגיל IgG</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td><td>IgG 2729S</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>קוריאה קו תא בנק</td><td>10002</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>DAIHAN מדעי</td><td>WUC-D10H</td><td></td></tr><tr><td>אולטראסוניקטור</td><td>BMBio</td><td>BR2006A</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה I</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה II</td><td>LABOGENE</td><td>1736R</td><td></td></tr><tr><td>מסובב</td><td>FINEPCR</td><td>ROTATOR/AG</td><td></td></tr><tr><td>תנור ואקום</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>ThermoStable OV-30</td><td></td></tr><tr><td>כרומטוגרפיה חדירת ג'ל (THF)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר פוטו-אלקטרונים רנטגן</td><td>Thermo VG Scientific</td><td>Sigma Probe</td><td></td></tr><tr><td>פיזור אור דינמי</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN 3690</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת חרוזים2 poly(pentafluorophenyl acrylate) functionalized sio לטיהור חלבון

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

נדגים שיטה פשוטה להכנת פוליפוני (אקרילט pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) הושתל חרוזים סיליקה עבור קיבעון נוגדן ויישום עוקבות immunoprecipitation (IP). השטח המושתל poly(PFPA) מוכן באמצעות תהליך בן שני שלבים פשוטים. בשלב הראשון, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) מועבר כ מולקולה מקשר על גבי המשטח סיליקה. בשלב השני, homopolymer poly(PFPA), מסונתז דרך הפיך תוספת פיצול שרשרת העברת (רפסודה) פלמור, הורכבה על המולקולה מקשר דרך התגובה החליפין בין היחידות pentafluorophenyl (PFP) פולימר וקבוצות אמין על APTES. בתצהיר של APTES ו- poly(PFPA) על סיליקה חלקיקים הם אושרה על-ידי photoelectron הספקטרומטריה (XPS), כמו גם המנוטרת על-ידי שינוי גודל החלקיקים נמדד באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS). כדי לשפר את hydrophilicity משטח של החרוזים, החלפה חלקית של poly(PFPA) עם poly(ethylene glycol) functionalized-אמין (אמינו-יתד) מבוצע גם. Poly(PFPA) שהוחלפו פג הושתל סיליקה חרוזים אז מרותק למיטה עם נוגדנים עבור יישום ה-IP. להדגמה, נוגדן כנגד חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) הוא מועסק, יעילות IP נקבעת על-ידי סופג המערבי. מתוצאות הניתוח מראים כי החרוזים נוגדן. מרותק למיטה אכן יכול לשמש כדי להעשיר PKR בזמן אינטראקציות חלבון שאינם ספציפיים הן מינימליות.

מפרטים טכניים עבור הכנת poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים, עם או בלי פג החלפת מוצג באיור1. כדי לנטר את APTES ואת poly(PFPA) הרכבה תהליך, חרוזים2 SiO חשופות, APTES functionalized SiO2 חרוזים, poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים מאופיינים DLS (איור 2) והן XPS (איור 3). יעילות ה-IP של החרוזים נקבעים לפי סופג המערבי. איור 4 מראה המערב סופג תוצ...

פרוטוקול עבור הכנת פוליפוני (pentafluorophenyl אקרילט) (חרוזים סיליקה poly(PFPA)) הושתל מוצג. לאחר מכן, השטח functionalized poly(PFPA) הוא מרותק למיטה עם נוגדנים, בעבר בהצלחה לצורך הקמת מכשול ההפרדה חלבון באמצעות immunoprecipitation.

הכנת חרוזים2 Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO לטיהור חלבון

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

שיטה זו יכולה לשמש להכנת משטחים המופעלים על ידי ביומולקול, אשר יש יישומים בתחומים כגון אספקת תרופות, זיהוי יעד ביולוגי, והפרדה ביולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מברשות PFPA פולי מגיבים מאוד עם אמינים, ואת ההשתקה של נוגדנים מושגת על ידי דגירה בת פתרון חיץ במשך כמה שעות. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיהור החלבון באמצעות immunopurification, כמו נוגדן משותק יכול להיקשר בהצלחה עם אנטיגנים היעד.למרות שיטה זו היא להפגין עבור גיוס נוגדנים וטיהור חלבון, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות הדורשות גיוס ביומולקולרי. כדי לטפל גם גם ב-APTES, יש להשיג תחילה חלקיקי דו תחמוצת הסיליקון בצורה של השעיה מיקווית בנפח 5%. לשלב 0.8 מיליליטר של השעיית דו תחמוצת הסיליקון עם 40 מיליגרם של APTES, ושמונה מיליליטר של מתנול בבקבוקון 20 מיליליטר scintillation מצויד בר ערבוב.אפשר לתגובה להמשיך בטמפרטורת החדר במשך חמש שעות עם ערבוב נמרץ. לאחר חמש שעות, להעביר את הפתרון לצינור חרוט. כדי לבודד את גם גם הגידור הדו-חמצני הפונקציונלי של APTES, יש לבודד את הפתרון ב-10,000 ג'י למשך חמש דקות.ואז להסיר את העל-טבעי. עכשיו לשטוף את חרוזים על ידי תיפוף מחדש אותם בשלושה מיליליטר של מתנול טרי. לחץ את הצינור ביד לערבוב, אבל במידת הצורך, לשפר את הפיזור על ידי sonication באמבט מים במשך כמה שניות.צנטריפוגה כמו קודם, ולחזור על שלב לשטוף עוד פעם אחת. ערבבו את חמוזי הסיליקון הדו-חמצני עם שלושה מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד, או DMSO. לחץ את התערובת ביד, או במידת הצורך, sonicate במשך כמה שניות עד חרוזים מפוזרים באופן מלא ב- DMSO.לאחר צנטריפוגה לפני, להסיר את על טבעי. חזור על שלב הצנטריפוגה בפעם האחרונה כדי להבטיח חילופי ממסים שלמים ממתנול ל- DMSO. כדי להכין את פתרון PFPA פולי, להמיס 20 מיליגרם של פולי PFPA בשני מיליליטר של DMSO בבקבוקון 20 מיליליטר scintillation.כדי להכין פתרון PEG, להמיס אמין פונקציונלי PEG במיליליטר אחד של DMSO. כעת העבר את פתרון PEG לפתרון פולי PFPA. מגיבים בטמפרטורת החדר במשך שעה עם ערבוב נמרץ.העבר מיליליטר אחד של גם דם דו-חמצני פונקציונלי של APTES המושעה ב-DMSO לתוך פתרון ה-PFPA של פולי PFPA שהוחלף ב-PEG. אפשר השתלה בין פולי PFPA ו APTES פונקציונלי סיליקון דו חמצני חרוזים להמשיך בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת עם ערבוב נמרץ. ואז לבודד את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 G במשך חמש דקות, ואחריו הסרת העל טבעי.לשטוף את חרוזים על ידי הוספת שלושה מיליליטר של DMSO, ומערבבים ביד או עם כמה שניות של sonication. צנטריפוגה את חרוזים כמו קודם. ולהסיר את supernatant לפני לחזור לשטוף DMSO פעמיים.לשטוף את חרוזים פעמיים נוספות עם שלושה מיליליטר של מים מזוקקים משולשים. ואז לערבב ביד או עם כמה שניות של sonication. צנטריפוגה את חרוזים כמו קודם ולהסיר את supernatant.לבסוף לייבש את חרוזים ב 40 מעלות צלזיוס בתנור ואקום לילה. הוסף חמישה מיליגרם של פולי PFPA מושתל סיליקון דו חמצני גם צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לשטוף את חרוזים על ידי הוספת 800 microliters של PBS, ומערבבים היטב על ידי מערבולת.צנטריפוגה את חרוזים ב 10, 000 גרם בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. הסר את העל-טבעי, וחזור על שלב הכביסה שלוש פעמים. עכשיו להוסיף 350 microliters של PBS טרי, 50 microliters של 0.1% PBST, ו 6.67 מיקרוגרם של הנוגדן.דגירה כ 20 שעות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את חרוזים צנטריפוגה ב 400 G ו 4 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את העל-טבעי והוסף בזהירות 400 מיקרוליטרים של מאגר תיזה.בעדינות resuspend את חרוזים על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים. חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר הכביסה הסופית, להסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר.הכן תאים ומאגר תזה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בכדור התא עם 400 מיקרוליטרים של מאגר התיזה. Sonicate התאים באמצעות קוליטור אולטרה.לאחר sonication, מערבולת בקצרה. ואז צנטריפוגה lysate ב 20, 000 G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. העבר את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה חדש באורך 1.5 מיליליטר.כדי לבצע immunoprecipitation, להעביר 300 microliters של ליסס תאים נוגדנים שהוכנו בעבר משותק פולי PFPA מושתל חרוזי סיליקון דו חמצני. שמור על 30 מיקרוליטרים של התא lysate כמו מדגם קלט בצינור microcentrifuge חדש. דגירה תערובת גם גם את תערובת גם גם 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות על מסובב ב-4 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התערובת ב 400 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. הסר את העל-טבעי והוסף בזהירות 400 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה. בעדינות resuspend את חרוזים על ידי צינור למעלה ולמטה כחמש פעמים.לאחר שלוש שטיפות, להסיר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר. הוסף 30 מיקרוליטרים של צבע טעינת SDS 2x לדגימה של הקלט. ואז לחמם אותם במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.לאחר החימום, לנתח את המדגם באמצעות סופג מערבי, או לאחסן את המדגם במינוס 20 מעלות צלזיוס. קדזי הסיליקה הפונקציונליים נבדקים על ידי ספקטרוסקופיית פוטואלקטרון רנטגן, או XPS, כדי לקבוע את הרכב פני השטח. נתוני XPS מייצגים מוצגים כאן.בעקבות טיפול APTES, שיא חנקן 1s הקשורים לאזור קבוצת אמין APTES מזוהה. לאחר טיפול PFPA פולי, פסגת פלואור 1s הקשורים ליחידות PFP על הפולימר מזוהה. RNA קינאז חלבון מופעל, או העשרת PKR באמצעות immunoprecipitation מבוצעת, ואת דגימת החלבון רמז מנותחים באמצעות סופג מערבי.כצפוי, חרוזים משותקים ללא נוגדנים, או תערובת נוגדנים לא ספציפית מראים שאין התאוששות PKR. חרוזים דגירה עם אנטי PKR יכול להעשיר בהצלחה PKR כפי שצוין על ידי נוכחות של להקת PKR והיעדר הלהקה GAPDH. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי בעת השוואת מערכות, ניסויי IP, כמו גם ניתוח סופג המערבי הבאים צריך להיעשות בו זמנית.לאחר התפתחותה, טכניקה זו יכולה לשמש לשתק של מצע ביומולקולרי או חומר שונה. יתר על כן, שיטה זו יש את היתרון הנוסף של כוונון רק רכוש פני השטח כדי להיות מותאם לצרכים של כל יישום.

preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

בסרטון זה, בדיקות כוח ביוממברנה (BFPs) משמשות למדידת הכוחות בין קולטנים וליגנדות. טכניקה זו יכולה לזהות אינטראקציות על ידי ניטור הלחץ הדרוש כדי לשבור את הקשרים בין pMHC מצומד על חרוזי הבדיקה לבין TCRs על תאי המטרה.

Biomembrane Force Probe כדי לכמת אינטראקציות קולטן-ליגנד

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא superfamily של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים, peptoids ופפטידים מפוגלים-N. כאן אנו מתארים שיטה סינתטית המשלבת את שניהם מפוצלת וברכה ואסטרטגיות תת מונומר לסנתז ספרייה חד מתחם אחד אגל PTAs.

סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

אנו מציעים טכניקת הרכבה עצמית פשוטה של ננו-חלקיקים קולואידיים של סיליקה כדי ליצור צומת ננו-פלואידית בין שני מיקרו-ערוצים בפולידימתילסילוקסן (PDMS). באמצעות טכניקה זו, קרום חרוז ננו-נקבובי בגודל נקבוביות של עד ~45 ננומטר נבנה בתוך מיקרו-ערוץ והוחל על ריכוז מוקדם אלקטרוקינטי של דגימות DNA.

יצירת צומת תת-50 ננומטר ננו-נוזלי ב PDMS Microfluidic שבב באמצעות תהליך ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואיד

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסנתז חומרים סיליקה bioinspired, לשתק אנזימים המצוי בו. סיליקה הוא מסונתז על ידי שילוב של סודיום סיליקט, אמין 'תוספת', אשר מנטרלים בקצב מבוקר. ניתן לשנות תכונות של חומר ותפקוד בחיי עיר אנזים הנייח או פוסט-סינתטי • חומצה תנאי של תוספים שעברו אנקפסולציה.

הכנת סיליקה פונקציונלי באמצעות שיטת Bioinspired

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור ל-רקומביננטי הסידן מחייב חלבון בחינם S100A12 והוא המושרה היונים שלה עבור גירוי מונוציט אנושי.

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.

זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

חקור הכנת חרוזי סיליקה מותמרים ב-poly(PFPA) לטיהור חלבון באמצעות נוגדנים קשורים. שיטה זו מאפשרת הפרדת חלבונים יעילה ויישומים ביומולקולריים מגוונים.

הכנת חרוזים₂ Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO לטיהור חלבון

גלה סרטונים נוספים