הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה בין מארח וירוסים על איך ביעילות להקים זיהום ויראלי Drosophila melanogaster. שיטה זו nanoinjection מאפשר שליטה מדויקת של מינון הזיהום של הנגיף והוא יכול להיות מיושם בקלות על זיהומים עם פתוגנים מיקרוביאליים אחרים. התחל בגידול אחד פעמים 10 לתאי כוכב S2 קיימא השביעי למיליליטר כמו monolayer רופף, חסיד למחצה בצלחת תרבות תאים 10 ס"מ עם 10 מיליליטר של מדיום Drosophila שלם של שניידר ללא דו תחמוצת הפחמן נוספת ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

במהלך הדגירה, יש להפשיר מחדש וירוס Drosophila C המופשר טרי או DCV לריבוי של זיהום של 0.01 במיליליטר אחד של מדיום שלם ולהוסיף פתרון וירוסים לכלים של תרבות התאים. ואז להחזיר את הצלחת 25 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך שלושה עד חמישה ימים. הנגיף מוכן לאיסוף כאשר מורפולוגיה התא נראה מטושטש המדיום התרבותי מלא חלקיקים שחורים המעידים על פסולת התא.

מערבבים את העל-טבעי על-ידי צינורות מספר פעמים לפני העברת כל תרבות התאים לצינור של 15 מיליליטר עבור תזה של התאים המארחים במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ליצור ריכוזי עבודה של וירוס, להפשיר את ההשעיה התא באמבט מים 25 מעלות צלזיוס עם רעידות מתמיד לפני pelleting פסולת התא על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן להעביר את supernatant לתוך צינור סטרילי חדש 15 מיליליטר עבור מערבולת aliquot עד 200 microliters של פתרון וירוס לכל צינור.

כדי לקבוע את המינון הממוצע של רקמת רקמת וירוס מדביק, הזרע הראשון פעם אחת 10 כדי חמשת תאי כוכב S2 ב 100 microliters של מדיום מלא לשמונה בארות לכל עמודה ב 12 שורות של צלחת 96 גם. ואז להחזיר את הצלחת 25 מעלות צלזיוס אינקובטור. בחר באופן אקראי חמישה צינורות של וירוס מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס.

בעוד התאים מתיישבים, למלא 10 צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 1.5 מיליליטר עם 450 microliters של מדיום מלא סטרילי ולהוסיף 50 microliters של מלאי וירוס לצינור הראשון 1.5 מיליליטר המכיל 450 microliters של בינוני מלא סטרילי מדלל את המתלים 10 פי צעד ל הבאר ה -12. בסוף הדגירה, להוסיף 50 microliters של כל דילול ל באר המתאימה בכל עמודה עבור צינור זה של וירוס ולהוסיף 50 microliters של תרבות בינוני ללא וירוס אחד גם לכל עמודה כמו היטב שליטה שלילית. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור 25 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים ולהעריך את ההשפעה הציטופתית של כל מלאי וירוס תחת מיקרוסקופ Brightfield בהגדלה 20X מדי יום.

לסווג באר שבה התאים נראים מטושטשים המדיום מלא שברים כמו באר חיובית באר שבה מורפולוגיה התא הוא נורמלי כמו באר שלילית. לפני הרבייה, מערבבים ביסודיות 400 מיקרוליטרים של 50 מיקרוגרם למיליליטר של טטרציקלין עם ארבעה גרם של מזון זבובים סטנדרטי טרי ומניחים את האוכל בארבע מעלות צלזיוס בן לילה כדי להתאדות את האתנול. למחרת בבוקר, לחמם את האוכל לטמפרטורת החדר ולמקום את האוכל ו 20 נקבות ו 10 זכרים מבוגרים eclosed לאחרונה זבובים לתוך בקבוקון רבייה עבור דגירה רבייה של שלושה עד ארבעה ימים ב 25 מעלות צלזיוס ו 60% לחות תחת מחזור אור / כהה רגיל.

כאשר מספיק ביצים הונחו, לאסוף את זבובים בוגרים eclosed לאחרונה תחת זרימת אור של פחמן דו חמצני ולהתרבות Drosophila שוב פעמיים נוספות כפי שהוכח רק. לאחר שלושה דורות של טיפול טטרציקלין, לאסוף חמישה זבובים תחת זרימת אור של פחמן דו חמצני הומוגניזציה הזבובים עם 250 microliters של מים מזוקקים כפול וכמה 0.5 מילימטר חרוזי קרמיקה סטריליים. לאחר דקה אחת, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של חיץ A 2X לדגימה למערבולת לפני הקפאת הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הפשר במהירות דגימות מאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס באמבט מים של 25 מעלות צלזיוס, ואחריו דגירה של 30 דקות באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס לפני חילוץ הדנ"א הגנומי והגברת הדנ"א על ידי תגובת שרשרת פולימראז על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. אשר את היעדר וולבצ'יה 16 RNA קטן wsp בכל זבוב הומוגנית על ידי אלקטרופורזה ג'ל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ואז לגדל את מלאי זבובים ללא וולבצ'יה על מזון זבובים קמח תירס סטנדרטי כפי שהוכח.

עבור זיהום ויראלי, תחילה להשתמש stereomicroscope ומדפים דקים כדי לשבור את הקצה של מחט נימי זכוכית לקוטר המתאים עבור ננו-ג'ינג'י. כדי להרכיב את המזרק, מניחים את התקרה O-ring ומרחב לבן על בוכנה מתכת של מזרק עם גומה גדולה פונה כלפי חוץ. השתמש מזרק מצויד מחט 30 מד כדי למלא את מחט הזכוכית בשמן מינרלי ולמקום את המחט דרך הצווארון.

מניחים את O-ring גדול סביב הבסיס של הצווארון על מילימטר אחד מהקץ הקהה של המחט ולהרים את המחט על הבוכנה של המזרק. אבטחו את המחט על הבוכנה ולחץ על הכפתור הריק כדי להאריך את הבוכנה של המיקרו-ינג'קטור עד שנשמע אות נשמע. עכשיו לחץ למלא כדי לחזור בוכנה חמישה מילימטרים ולטבול את המחט לתוך 100 לוח להרכיב יחידה ההשעיה נגיפית.

לנער בעדינות אחד או לפחות שלושה בקבוקונים של 20 דרוסופילה זכר ללא וולבצ'יה על צלחת ההזרקה. זבובים זכרים ניחנים עדיפים במהלך ההזדווגות ורבייה עשויה להשפיע על נקבות. ואז להזריק את בית החזה של כל זבוב עם 50.6 nanoliters של פתרון וירוס באזור בצבע מעט בהיר יותר בין mesopleura ואת pteropleura ולמדוד את עומס DCV על ידי מבחנה אפקט ציטופתי ו- RT PCR כמותי מן זבובים הקרקע כפי שהודגם רק.

לאחר ההזרקה, מעבירים בזהירות את הזבובים לבקבוקון טרי וממקמים את הבקבוקון במצב אופקי כדי למנוע מהזבובים להידבק למדיום תוך כדי התאוששות מהרדמה. הזריקה היא זמן רב אבל שכפול DCV הוא מהיר מאוד ולכן חשוב מאוד לרשום את הזמן המדויק על הצינור פעם כל הזבובים מכל בקבוקון הוזרקו. זיהום וירוס יכול לגרום תות תאים והשפעות ציטופתיות נצפו בשלושה ימים לאחר ההדבקה.

וולבצ'יה 16s rRNA ו wsp פריימרים ניתן להשתמש כדי לזהות את נוכחותם של וולבצ'יה ו Drosophila כפי שהוכח. זבובים נטולי וולבצ'יה מפגינים ירידה משמעותית בשיעור ההישרדות לאחר זיהום DCV ובאופן תלוי מינון. DCV מפעילה מסלולי איתות אנטי ויראליים במארח שהם קריטיים לזיהום אנטי ויראלי בדרוסופילה כפי שמדות שיעור ההישרדות ירד ועומס ויראלי מוגבר בזבובים מוטנטים Dicer-2.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי זיהום עם גנוטיפ וולבאכיה עשוי להשפיע על הרגישות של מלנוגסטר Drosophila טס לזיהום DCV. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מסך גנטי בקנה מידה גדול יותר על מנת לענות על שאלות נוספות על תחת גנים מארח מוגדרים הנדרשים לזיהום ויראלי או לתגובות אנטי ויראליות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלה הנגיפית האנושית לחקור את המנגנונים שבבסיס התפרצויות של זיהומים נגיפיים אנדמיים בבני אדם במודל מלנוגסטר דרוסופילה.

אל תשכח כי עבודה עם וירוס יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן המתאים תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.