Name: הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למד כיצד להקים זיהום נגיפי ב-Drosophila melanogaster באמצעות שיטת הננו-הזרקה לניתוח אינטראקציות מארח-נגיף. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת במינון הזיהום ומספקת מסגרת למחקרים עתידיים בווירולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות את כל המעבדה פאן IPS. רשויות אישורים. אנו מודים ד ר וואנג Lanfeng (IPS, CAS) על סיוע ניסיוני, ד ר Gonalo קורדובה סטגר (ספרינגר הטבע), ד ר ג'סיקה ורגס (IPS, פריז), ד ר ז'ו סנג (IPS, פריז) להערות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהתוכנית האסטרטגית עדיפות מחקר של האקדמיה הסינית למדעים L.P (XDA13010500) או מלאה (XDB29030300), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין L.P (31870887 ו- 31570897), J.Y (31670909). L.P הוא עמית CAS הנוער חדשנות קידום האגודה (2012083).

המחברים אין לחשוף.

במאמר זה, נציג הליך מפורט על איך להקים מערכת זיהומיות ויראליות למבוגרים דרוזופילה melanogaster באמצעות ננו-הזרקה. הפרוטוקולים כוללים את הכנת קווים לטוס המתאים ואת וירוס מניות, זיהום, ההערכה זיהומיות האינדיקטורים וטכניקות המדידה של התגובה אנטי ויראליים. למרות DCV משמש כדוגמה חיידק ויראלי, עשרות סוגים שונים של וירוס בהצלחה הוחלו למחקר במערכת דרוזופילה. בנוסף, מאות גורמים רגולטוריים, של הוירוס או של המחשב המארח, זוהו באמצעות הקרנה בקנה מידה גדול בזבובים. לכן, בשיטה זו היא יכולת הסתגלות גבוהה, אינו מגביל את DCV / אי...

מתעוררים זיהומים נגיפיים, במיוחד על-ידי arboviruses, כגון וירוס Chikungunya1, נגיף דנגי, קדחת צהובה וירוס2 ו-וירוסZika3, כבר היוו איום על בריאות הציבור על-ידי גרימת מגיפות 4. לפיכך, הבנה טובה יותר של וירוס-פונדקאי אינטראקציה הפך להיות חשוב יותר ויותר שליטה מגיפה וטיפול מחלות ויראליות אצל בני אדם. עבור מטרה זו, חייב להקים מודלים מתאימים ויעילים יותר לחקור את המנגנונים בנגיף.
זבוב הפירות, Drosophilamelanogaster (melanogaster ד), מספקת מערכת חזקה לחקור וירוס-פונדקאי אינטראקציה5,6 , הוכיחה להיות אחד המודלים היעילה ביותר לחקר מחלות ויראליות האדם7 , 8 , 9. נגיפים מאוד שנשמרת איתות משעולים, האחד והיחיד כלים גנטיים לגרום זבובים מודל לייצר תוצאות משמעותיות עם השלכות אמיתי לחקר נגיפים אנושיים. בנוסף, זבובים הם קלה וזולה לשמור על מעבדה, והם נוחים להקרנה בקנה מידה גדול של גורמים רגולטוריים הרומן6,10 הנגיף, המארח במהלך זיהום.
ארבע הגדולות מאוד שנשמרת מסלולים אנטי ויראליים (למשל., ה RNA מסלול של הפרעה (RNAi)11, מסלול JAK-STAT12, מסלול NF-κB ולאחר מסלול autophagy13) נלמדים גם בדרוזופילה האחרונים שנה6. מסלול RNAi היא מנגנון אנטי-ויראלי רחב יכול לדכא את רוב סוגי וירוס זיהום6,14. הפרעה של מסלול זה על ידי מוטציה בגנים כמו מקצץ-2 (Dcr-2) או Argonaute 2 (AGO2) יכול להוביל וירוס מוגברת כייל נוגדנים ומנחה התמותה15,16,17. הנתיב JAK-STAT היה מעורב השליטה זיהום על ידי וירוס של משפחת Dicistroviridae ומשפחת Flaviviridae בחרקים, למשל., וירוס דרוזופילה C (DCV) זבובים16 ו וירוס הנילוס המערבי (WNV) וירוס דנגה יתושים18,19. אגרה דרוזופילה (הומולוגי ל מסלול NF-κB אנושי) חיסוני (IMD) מסלולים (בדומה מסלול NF-κB ו- TNF אנושי) הן מעורב מגן וירוס הפלישה20,21, 22. autophagy הוא במנגנון שנשמרת אחר מעורב ברגולציה של זיהום ויראלי, אשר מאופיין היטב דרוזופילה23,24. לפיכך, זיהוי גורמים רגולטוריים הרומן של מסלולים אלה ויבתר crosstalk בין אלה איתות נגיפים ועוד מסלולים ביולוגיים, כגון חילוף החומרים, הזדקנות, התגובה העצבית וכן הלאה, ניתן בקלות להגדיר ב- דרוזופילה מערכת.
למרות ביותר ומבוססת במודלים דרוזופילה זיהומיות ויראליות הם המושרה על ידי RNA וירוסים, זיהום על ידי 6I וירוס ססגוני הגעה (IV-6) וירוסים קליתיאה (kallithea) הראו הפוטנציאל ללימוד הווירוסים DNA זבובים25, 26. יתר על כן, ניתן לשנות את הנגיף גם כדי לאפשר זיהום של דרוזופילה, כגון וירוס שפעת9. זה התרחב באופן משמעותי את היישום של פלטפורמת הסינון דרוזופילה . בהליך זה, אנו משתמשים DCV כדוגמה כדי לתאר כיצד לפתח מערכת זיהומיות ויראליות דרוזופילה. DCV הוא חיובי-סנס נטושים RNA שוירוס יחיד של נוקלאוטידים כ 9300, קידוד חלבונים 927. בתור חיידק הטבעי של melanogaster ד, DCV נחשב כמו וירוס מתאים ללמוד התגובה החיסונית פיזיולוגיים, התנהגותי, הבסיס מארח במהלך אינטראקציה והתפתחות משותף מארח-וירוס28. בנוסף, שיעור התמותה המהירה שלה בעקבות זיהום פראי סוג בזבובים הופכת DCV שימושי עבור גנים עמיד או רגישים מסך מארח29.
עם זאת, ישנם מספר היבטים של דאגה כשלמדתי זיהומים נגיפיים ב דרוזופילה. לדוגמה, חיידקים סימביוטיים Wolbachia יש את היכולת לעכב את ספקטרום רחב של התפשטות וירוס רנ א ב דרוזופילה וכילה נגד יתושים30,31,32. הראיות זה התבצעה מציגה את מנגנון אפשרי אשר Wolbachia רחובות Sindbis (SINV) בנגיף דרך קולטנים upregulation של methyltransferase Mt2 ביטוי מארח33. בנוסף, הרקע הגנטי של חרקים גם הוא קריטי עבור זיהום ויראלי. למשל, פולימורפיזם טבעי בגן, pastrel (pst), קובעת את הרגישות לזיהום DCV דרוזופילה34,35, בעוד מנחלת Ubc-E2H ו- CG8492 מעורבים קריקט שיתוק וירוס (CrPV) ואת הצאן הבית זיהום בנגיף (FHV), בהתאמה36.
הדרכים מסוים להקים את האינטראקציה וירוס-פונדקאי בזבובים, להיבחר על-פי מחקר למטרות כגון מסך תפוקה גבוהה עבור מרכיבי התא המארח דרוזופילה תא קווים37,38, אוראלי זיהום ללמוד תגובה אנטי-ויראלי ספציפי בטן22,39,40, המחט חירור41,42 או ננו-הזרקת על-ידי העברת אפיתל מחסומים כדי לעורר החיסונית מערכתית תגובות. ננו-הזרקת בדיוק יכול לשלוט המינון ויראלית כדי לגרום תגובה אנטי ויראליים מבוקרת, הנגע פיזיולוגיים43, ומבטיח הפארמצבטית ניסויית גבוהה44. במחקר זה, אנו מתארים שיטה ננו-הזרקת ללמוד אינטראקציות וירוס-מארח דרוזופילה, הדגשת חשיבות תופעות רקע הזבובים.

<table><tbody><tr><td>מסנן 0.22um</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>מותג</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה ללא RNase</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת תרבית תאים</td><td>Sigma</td><td>CLS430167</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>100 צינורות החלפה</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>צינור 15 מ"ל</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 qPCR מערכת</td><td>ABI</td><td>7500</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>חממת תאים</td><td>Sanyo</td><td>MIR-553</td><td></td></tr><tr><td>Centriguge</td><td>Eppendof</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centriguge</td><td>Eppendof</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>151858</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>DEPC מים</td><td>סיגמא</td><td>95284-100 מ"ל</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>חממת דרוזופילה</td><td>Percival</td><td>I-41NL</td><td>גידול Drosophila</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>12657-029</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>תחתונה שטוחה 96 באר צלחת</td><td>סיגמא</td><td>CLS3922</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>אולימפוס</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>סיגמא</td><td>מיצוי RNA I9516</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה (מיצוי RNA)</td> מאגר <td></td><td>ליזה מגיב Thermo Fisher 15596026 TRIzol (</td><td></td></tr><tr><td>מיצוי RNA דגימה נוזלית)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296028</td><td>TRIzol LS מיקרוסקופ ריאגנט</td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II מזרק ננוליטר אוטומטי</td><td>דראמונד סיינטיפיק</td><td>3-000-204</td><td>Nanoject II נפח משתנה (2.3 עד 69 nL) מזרק אוטומטי עם נימי זכוכית (110V)</td></tr> <tr><td>סרט דבק אופטי</td><td>ABI</td><td>4360954</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין, נוזל</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>qPCR צלחת</td><td>ABI</td><td>A32811</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>שניידר s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S9895</td> תוכנה סטטיסטית <td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td></td><td>GraphPad Prism 7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransScript Fly סינתזת cDNA גדיל ראשון</td><td>SuperMix TransScript</td><td>AT301</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>IKA</td><td>VORTEX 3</td><td>מיצוי RNA</td></tr></tbody></table>

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

וירוס מפיצים הוא הגורם העיקרי במחלות מדבקות. לפיכך, להבין את האינטראקציה בין הוירוס המארח הוא מאוד חשוב להרחיב את הידע שלנו על מניעה וטיפול של זיהום ויראלי. זבוב הפירות melan דרוזופילהogaster הוכיחה להיות אחד האורגניזמים מודל פורה ויעיל ביותר המסך עבור גורמים אנטי ויראליים ולחקור אינטראקציה וירוס-מארח, בשל כלים גנטית חזקים מאוד שנשמרת חיסונית מולדת איתות המסלולים. ההליך המתואר כאן מדגים שיטת ננו-הזרקת ליצור זיהום נגיפי, זירוז תגובות אנטי מערכתית של הזבוב הבוגר. שליטה מדויקת של המינון הזרקת ויראלי בשיטה זו מאפשר הפארמצבטית ניסויית גבוהה. הפרוטוקולים המתוארים במחקר זה כוללים את ההכנה של זבובים, הווירוס, בשיטת הזרקה, ניתוח שיעור הישרדות, המדידה עומס וירוס הערכה מסלול אנטי ויראליים. ההשפעות ההשפעה של זיהום נגיפי מאת רקע הזבובים שהוזכרו כאן. שיטה זו דלקת היא קלה לביצוע, הדיר באופן כמותי; זה יכול להיות מיושם על המסך עבור המחשב המארח/ויראלי הגורמים המעורבים באינטראקציה וירוס-מארח, לנתח crosstalk בין החיסון מולדים איתות מסלולים ביולוגיים אחרים בתגובה זיהום ויראלי.

התוצאות של סעיף זה מתקבלים לאחר DCV זיהום של melanogaster ד. איור 1 מציג את תרשים זרימה של זיהום ויראלי דרוזופילה. זבובים מוזרקים intra-thoracically ולאחר מכן הדגימות נאספים לשקילת TCID ויראלי50 ואת רמת ה-RNA הגנום (איור 1). להדבקת וירוס יכול לגרום פירוק התא, CPE נצפית ב- 3 ימים שלאחר זיהום (איור 2 א). העומס וירוס נמדדת וזמינותו CPE בקנה אחד עם זה נמדד על ידי qPCR (איור 2B). כפי שמוצג באיור3, Wolbachia</e...

פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים זיהום ויראלי ויוו דרוזופילה melanogaster באמצעות שיטת ננו-הזרקת טכניקות בסיסיות כדי לנתח וירוס-פונדקאי אינטראקציה.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה בין מארח וירוסים על איך ביעילות להקים זיהום ויראלי Drosophila melanogaster. שיטה זו nanoinjection מאפשר שליטה מדויקת של מינון הזיהום של הנגיף והוא יכול להיות מיושם בקלות על זיהומים עם פתוגנים מיקרוביאליים אחרים. התחל בגידול אחד פעמים 10 לתאי כוכב S2 קיימא השביעי למיליליטר כמו monolayer רופף, חסיד למחצה בצלחת תרבות תאים 10 ס"מ עם 10 מיליליטר של מדיום Drosophila שלם של שניידר ללא דו תחמוצת הפחמן נוספת ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.במהלך הדגירה, יש להפשיר מחדש וירוס Drosophila C המופשר טרי או DCV לריבוי של זיהום של 0.01 במיליליטר אחד של מדיום שלם ולהוסיף פתרון וירוסים לכלים של תרבות התאים. ואז להחזיר את הצלחת 25 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך שלושה עד חמישה ימים. הנגיף מוכן לאיסוף כאשר מורפולוגיה התא נראה מטושטש המדיום התרבותי מלא חלקיקים שחורים המעידים על פסולת התא.מערבבים את העל-טבעי על-ידי צינורות מספר פעמים לפני העברת כל תרבות התאים לצינור של 15 מיליליטר עבור תזה של התאים המארחים במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ליצור ריכוזי עבודה של וירוס, להפשיר את ההשעיה התא באמבט מים 25 מעלות צלזיוס עם רעידות מתמיד לפני pelleting פסולת התא על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן להעביר את supernatant לתוך צינור סטרילי חדש 15 מיליליטר עבור מערבולת aliquot עד 200 microliters של פתרון וירוס לכל צינור.כדי לקבוע את המינון הממוצע של רקמת רקמת וירוס מדביק, הזרע הראשון פעם אחת 10 כדי חמשת תאי כוכב S2 ב 100 microliters של מדיום מלא לשמונה בארות לכל עמודה ב 12 שורות של צלחת 96 גם. ואז להחזיר את הצלחת 25 מעלות צלזיוס אינקובטור. בחר באופן אקראי חמישה צינורות של וירוס מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס.בעוד התאים מתיישבים, למלא 10 צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 1.5 מיליליטר עם 450 microliters של מדיום מלא סטרילי ולהוסיף 50 microliters של מלאי וירוס לצינור הראשון 1.5 מיליליטר המכיל 450 microliters של בינוני מלא סטרילי מדלל את המתלים 10 פי צעד ל הבאר ה -12. בסוף הדגירה, להוסיף 50 microliters של כל דילול ל באר המתאימה בכל עמודה עבור צינור זה של וירוס ולהוסיף 50 microliters של תרבות בינוני ללא וירוס אחד גם לכל עמודה כמו היטב שליטה שלילית. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור 25 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים ולהעריך את ההשפעה הציטופתית של כל מלאי וירוס תחת מיקרוסקופ Brightfield בהגדלה 20X מדי יום.לסווג באר שבה התאים נראים מטושטשים המדיום מלא שברים כמו באר חיובית באר שבה מורפולוגיה התא הוא נורמלי כמו באר שלילית. לפני הרבייה, מערבבים ביסודיות 400 מיקרוליטרים של 50 מיקרוגרם למיליליטר של טטרציקלין עם ארבעה גרם של מזון זבובים סטנדרטי טרי ומניחים את האוכל בארבע מעלות צלזיוס בן לילה כדי להתאדות את האתנול. למחרת בבוקר, לחמם את האוכל לטמפרטורת החדר ולמקום את האוכל ו 20 נקבות ו 10 זכרים מבוגרים eclosed לאחרונה זבובים לתוך בקבוקון רבייה עבור דגירה רבייה של שלושה עד ארבעה ימים ב 25 מעלות צלזיוס ו 60% לחות תחת מחזור אור / כהה רגיל.כאשר מספיק ביצים הונחו, לאסוף את זבובים בוגרים eclosed לאחרונה תחת זרימת אור של פחמן דו חמצני ולהתרבות Drosophila שוב פעמיים נוספות כפי שהוכח רק. לאחר שלושה דורות של טיפול טטרציקלין, לאסוף חמישה זבובים תחת זרימת אור של פחמן דו חמצני הומוגניזציה הזבובים עם 250 microliters של מים מזוקקים כפול וכמה 0.5 מילימטר חרוזי קרמיקה סטריליים. לאחר דקה אחת, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של חיץ A 2X לדגימה למערבולת לפני הקפאת הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הפשר במהירות דגימות מאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס באמבט מים של 25 מעלות צלזיוס, ואחריו דגירה של 30 דקות באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס לפני חילוץ הדנ"א הגנומי והגברת הדנ"א על ידי תגובת שרשרת פולימראז על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. אשר את היעדר וולבצ'יה 16 RNA קטן wsp בכל זבוב הומוגנית על ידי אלקטרופורזה ג'ל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ואז לגדל את מלאי זבובים ללא וולבצ'יה על מזון זבובים קמח תירס סטנדרטי כפי שהוכח.עבור זיהום ויראלי, תחילה להשתמש stereomicroscope ומדפים דקים כדי לשבור את הקצה של מחט נימי זכוכית לקוטר המתאים עבור ננו-ג'ינג'י. כדי להרכיב את המזרק, מניחים את התקרה O-ring ומרחב לבן על בוכנה מתכת של מזרק עם גומה גדולה פונה כלפי חוץ. השתמש מזרק מצויד מחט 30 מד כדי למלא את מחט הזכוכית בשמן מינרלי ולמקום את המחט דרך הצווארון.מניחים את O-ring גדול סביב הבסיס של הצווארון על מילימטר אחד מהקץ הקהה של המחט ולהרים את המחט על הבוכנה של המזרק. אבטחו את המחט על הבוכנה ולחץ על הכפתור הריק כדי להאריך את הבוכנה של המיקרו-ינג'קטור עד שנשמע אות נשמע. עכשיו לחץ למלא כדי לחזור בוכנה חמישה מילימטרים ולטבול את המחט לתוך 100 לוח להרכיב יחידה ההשעיה נגיפית.לנער בעדינות אחד או לפחות שלושה בקבוקונים של 20 דרוסופילה זכר ללא וולבצ'יה על צלחת ההזרקה. זבובים זכרים ניחנים עדיפים במהלך ההזדווגות ורבייה עשויה להשפיע על נקבות. ואז להזריק את בית החזה של כל זבוב עם 50.6 nanoliters של פתרון וירוס באזור בצבע מעט בהיר יותר בין mesopleura ואת pteropleura ולמדוד את עומס DCV על ידי מבחנה אפקט ציטופתי ו- RT PCR כמותי מן זבובים הקרקע כפי שהודגם רק.לאחר ההזרקה, מעבירים בזהירות את הזבובים לבקבוקון טרי וממקמים את הבקבוקון במצב אופקי כדי למנוע מהזבובים להידבק למדיום תוך כדי התאוששות מהרדמה. הזריקה היא זמן רב אבל שכפול DCV הוא מהיר מאוד ולכן חשוב מאוד לרשום את הזמן המדויק על הצינור פעם כל הזבובים מכל בקבוקון הוזרקו. זיהום וירוס יכול לגרום תות תאים והשפעות ציטופתיות נצפו בשלושה ימים לאחר ההדבקה.וולבצ'יה 16s rRNA ו wsp פריימרים ניתן להשתמש כדי לזהות את נוכחותם של וולבצ'יה ו Drosophila כפי שהוכח. זבובים נטולי וולבצ'יה מפגינים ירידה משמעותית בשיעור ההישרדות לאחר זיהום DCV ובאופן תלוי מינון. DCV מפעילה מסלולי איתות אנטי ויראליים במארח שהם קריטיים לזיהום אנטי ויראלי בדרוסופילה כפי שמדות שיעור ההישרדות ירד ועומס ויראלי מוגבר בזבובים מוטנטים Dicer-2.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי זיהום עם גנוטיפ וולבאכיה עשוי להשפיע על הרגישות של מלנוגסטר Drosophila טס לזיהום DCV. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מסך גנטי בקנה מידה גדול יותר על מנת לענות על שאלות נוספות על תחת גנים מארח מוגדרים הנדרשים לזיהום ויראלי או לתגובות אנטי ויראליות. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלה הנגיפית האנושית לחקור את המנגנונים שבבסיס התפרצויות של זיהומים נגיפיים אנדמיים בבני אדם במודל מלנוגסטר דרוסופילה.אל תשכח כי עבודה עם וירוס יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן המתאים תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

establishment-viral-infection-analysis-host-virus-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

מקור: סיווה-ג'ותי, ג'. א. ואחרים. זיהום חיידקי דרך הפה ונשירה ב-Drosophila melanogaster. J. vis. exp. (2018)הסרטון מדגים את ההדבקה בפה של Drosophila melanogaster בחיידקים פתוגניים. הוא כולל הכנת בקבוקי זיהום והעברת זבובים רעבים כדי לאפשר בליעת חיידקים. ההליך מתעד קולוניזציה במעי, ואחריה עיקור פני השטח והומוגניזציה של זבובים. לבסוף, הוא מראה כימות של עומס חיידקים פנימי באמצעות דילול סדרתי וספירת מושבות.

זיהום פה של דרוזופילה מלנגסטר עם חיידקים פתוגניים

מקור: הירויאסו, א., ד ' ואחרים, חילוץ המוציטים מזחלי דרוזופילה מלנגסטר לזיהום מיקרוביאלי וניתוח. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים את התהליך ליצירת זיהום חיידקי בזחלי דרוזופילה על ידי הכנסתם לטיפה חיידקית ודקירתם עם מחט טונגסטן. הזחלים מודגרים לאחר מכן על צלחת אגר מחורצת ועשירה בחומרים מזינים כדי לחקור אינטראקציות בין מארח לפתוגנים.

הקמת זיהום חיידקי בזחלי דרוזופילה

בסרטון זה, אנו מתארים הליך לביצוע ננו-הזרקה של נגיף RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי לזבובי דרוזופילה זכרים בוגרים ולאחר מכן חוקרים את התגובות האנטי-ויראליות שיזמו עקב הזיהום. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז מזהה את הרגולציה של גנים ספציפיים בזבובים הנגועים המצביעים על הפעלת מסלולי תגובה חיסונית, כולל הפרעות RNA ואיתות JAK/STAT.

ננו-הזרקה נגיפית תוך-חזה לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בזבובים בוגרים

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת ההשפעה הציטופתית כדי לקבוע את המינון הנגיפי הזיהומי של תרבית הרקמה של נגיף Drosophila C על תאי Drosophila S2*. מגוון ריכוזים נגיפיים משמשים להדבקת התאים בתרבית. שיעור התאים המציגים שינויים מבניים נקבע, ונתונים אלה משמשים לחישוב מינון הזיהום בתרבית הרקמה.

בדיקה כדי לקבוע את המינון המדבק של וירוס דרוזופילה C בתאי חרק בתרבית

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל יוצא דופן לחקר מערכות חיסון מולדות וההשלכות הפיזיולוגיות של זיהום ומחלות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לספק זיהומים חיידקיים חזקים וניתנים לחזרה כמותית ל-D. melanogaster, וכיצד למדוד לאחר מכן את חומרת הזיהום ולכמת את התגובה החיסונית של המארח.

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי לחשוף ולהדביק את זבוב הפירות הים דרוזופילה melanogaster עם פתוגנים חיידקיים אורלית, וכדי למדוד את מספר חיידקים זיהומיות המחסן בעקבות זיהום במעיים. בהמשך נתאר את ההשפעה של החיסון מוטציות על הישרדות לעוף בעקבות זיהום חיידקי הפה.

זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב דרוזופילה melanogaster

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

פרוטוקול זה מתאר וזמינותו של phagocytosis ויוו ב מבוגרים דרוזופילה melanogaster לכמת פגוציט הכרה ואישור של זיהומים חיידקים.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

למד כיצד להקים זיהום נגיפי ב-Drosophila melanogaster באמצעות שיטת הננו-הזרקה לניתוח אינטראקציות מארח-נגיף. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת במינון הזיהום ומספקת מסגרת למחקרים עתידיים בווירולוגיה.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

גלה סרטונים נוספים