Name: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למד טכניקת מיקרוכירורגיה לבידוד תאי גזע עצביים מהאמיננס הגנגליוני בעוברי עכברים בגיל E13. שיטה זו מאפשרת ייצור נוירוספירות תוך שלושה ימים ומספקת מקור אמין למחקר התפתחות עצבית ורפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי המכון Royan.

כל ניתוחים ופרוצדורות על בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים של מכון Royan, טהראן, איראן.
1. הכנת מכשירי ניתוח שוטף מאגר (HEPES-מ), תא תרבות המדיה וצלחות תרבות תא
<ol><li>לחטא כלים כירורגיים (מספריים, סכין להב ידית ומלקחיים) על ידי autoclaving שאותם בהתבסס על הקווים המנחים עיקור שגרתית.</li>
	<li>הכנת אמצעי אחסון נאותים מאגר HEPES-מ (בסביבות 100 מ ל זה מספיק בשביל כל העכברים בהריון). הוסף ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה (10% פניצילין/סטרפטומיצין) למאגר HEPES-מ. בריכוז זה של אנטיביוטיקה יש צורך להפחית את הסיכון של זיהום מיקרוביאלי.<ol>
<li>כדי להכין מאגר HEPES-מ, להוסיף 0.5958 גר' אבקת HEPES 100 מ של מאמ (מינימום הכרחי בינוני), ומערבבים היטב. להתאים את ה-pH ל 7.3-7.4 ולסנן את המדיום באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפוך לבטחון לאומי בינוני המכיל neurobasal בינוני (NB), בתוספת 20 ng/mL EGF, bFGF 10 ננוגרם למ"ל, תוספת x N2 100 1% או 1% B27 תוספת (ללא ויטמין A), 1 U/mL הפארין, 1%-גלוטמין, חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1% (NEAA), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 0.1 מ מ β-mercaptoethanol.</li>
</ol>2. בעלי חיים ניתוח, ניתוח מיקרו
<ol><li>עזים ומתנגד עכבר בהריון ביוםה 13 של ההיריון (כאן, שימוש BALB/c המתח מגיל 4 חודשים) על ידי הזרקת בקרום הבטן של קטמין-חריגות השירותים הווטרינריים, 100 מ"ג/ק"ג ו- 10 מ"ג/ק"ג על ידי למשקל הגוף בהתאמה.<ol>
<li>לאשר הרדמה עמוקה מצידה של גירוי כואב (למשל, קמצוץ עם מלקחיים) ברגל של החיה, כאשר יש רפלקס אין כאב, להקריב את החיה על ידי נקע בצוואר הרחם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נקי, מחטא העור של הבטן על ידי התזת 70% אתנול.</li>
	<li>שליטה על העור בבטן ולאחר מכן לחתוך את העור ואת fascia הבסיסית עם מספריים כדי לחשוף את חלל הבטן ואת הרחם קרניים.<ol>
<li>הסר את הקרניים הרחם המכילה את העוברים על-ידי מספריים, להעביר אותם לתוך צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 25 מ של מאגר HEPES-מ קר.</li>
		<li>למקם את צינור חרוטי מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית ופתח את הכובע מתחת למכסה המנוע. . תוציא את הקרניים הרחם מן צינור שטיפה 3 פעמים עם מספיק נפח המאגר טרי HEPES-מ קר לסלק פסולת ודם</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את רקמת הרחם 10 ס מ המכיל 7-10 מ"ל של מאגר HEPES-מ קר צלחת פטרי. פתח את הקרניים הרחם באמצעות עוברי מספריים והעברת בסדר תבשיל חדש המכיל 7-10 מ"ל של מאגר HEPES-מ קר. עכשיו לשים את הצלחת 10 ס מ עם העוברים תחת המיקרוסקופ ויבתר עבור פעולת ניתוח מיקרו.</li>
	<li>לכופף את קצה מחט מזרק 25-27 גרם על ידי דחיפת את קצהו על ידית להב סכין פלדה. לכופף את קצה המחט עד הקצה מכופף בזווית של 70-90 מעלות. בדוק את קצה המחט תחת המיקרוסקופ ויבתר לראות העיקול בקצה המחט. הערה: באופן טבעי, העוברים יש עמדה לרוחב בצלחת.</li>
	<li>מבלי לשנות את עמדתם, להחזיק את הצוואר ואת הגוף של העובר עם מלקחיים בסדר ולאחר מכן להכניס את החלק כפוף של קצה המחט פונטאנלה חזיתית ראש העובר. שם יהיה דימום קטן או קריש דם שם.<ol>
<li>הזז את מחט באופן שטחי. בעוד החלק כפופות בתוך הבליטה כלפי המצח ולאחר מכן לכיוון האחורי של הראש, ודא לחתוך את העור ואת הגולגולת ולא נזק למוח המשמש כבסיס.</li>
		<li>לדחוף את העור עם קצה המחט רוחבית כדי לחשוף את המוח ולהוסיף את המחט מן הצד הלטראלי של העור באזור מתחת המוח. הסר במוח הגולגולת על-ידי דחיפתו לצאת החוצה מהגולגולת גזור.</li>
		<li>תחזיק את המוח יציב עם המלקחיים מעוקל וחותכים וקליפה של האונה כל באמצעות מיקרו-מספריים כדי לחשוף את קדושתו ganglionic.</li>
		<li>. תחזיק את המוח ולמקם את קדושתו ganglionic גזור לתוך צנטריפוגה 15 מ"ל הצינור המכיל תאי גזע עצביים בינוני. קדושתו ganglionic מוצג בבירור עם חלקיו האמצעי ולא לרוחב.</li>
		<li>חזור על הליך זה עד כל המוחות היה גזור-מיקרו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חותכים את קדושתו ganglionic גזור על-ידי הצבת את הטיפ פיפטה בתחתית הצינורית. Pipette התליה לאורך 4 עד 5 פעמים כדי לשבור את הרקמה להשעיה תא בודד.<ol>
<li>Centrifuge התליה ב 110 x g עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA.</li>
		<li>דגירה התליה תא ב- 37 מעלות למשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף אמצעי מקביל של מעכבי טריפסין סויה (25 µg/mL) להפסיק את הפעילות טריפסין. Pipette התליה תא למעלה ולמטה כדי לוודא כי טריפסין כבר לגמרי לא מופעל.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב 110 x g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע מחדש להשעות את התאים 1 מ"ל של מדיום לבטחון לאומי מלאה ואת לספור את מספר התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צלחת התאים (2 x 105 תאים/mL)-המועצה לבטחון לאומי בינוני לתוך הבקבוק תרביות רקמה בגודל מתאים. העברה מ ל T25, 20 מ"ל T75, 40 מ"ל עד T175 המבחנות. הערה: Neurospheres יופיע לאחר שלושה ימי תרבות-37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO2. אחרי 6-7 ימים, הספירות צריך למדוד בין 150-200 מיקרומטר בקוטר, תהיה מוכן תת-תרבות. ע י טיפוח מיליון NSCs הראשי לאחר שבעה ימים מספר התאים יגדל ל 3-4 מליון.</li>
</ol>3. trypsinization ו- Passaging של Neurospheres
<ol><li>כדי תת-תרבות neurospheres, להעביר את המדיום עם neurospheres מושעה הצינור צנטריפוגה, צנטריפוגה ב 110 x g למשך 5 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.<ol>
<li>בטל את טריפסין בעזרת מעכבי טריפסין סויה פיפטה neurospheres בעדינות עד ורווקה למטה כדי לבצע אותם תאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב 110 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש תאי 1 מ"ל של המועצה לבטחון לאומי בינוני. תאים אלה מוכנים תת-תרבות או תרבות על Laminin הבא, פולי-L-Ornithine מצופה משטחים לניסויים מתקדמים.</li>
	<li>תת-תרבות הבא, להעביר NSCs לתוך הבקבוק החדש (בצע שלב 2.8), תרבות אותם במדיום לבטחון לאומי. עבור אינדוקציה של בידול עצביים תרבות NSCs במדיום לבטחון לאומי בהיעדרו של bFGF ו EGF Laminin, פולי-L-Ornithine מצופה לוחות (איור 1B).</li>
	<li>תהליך ציפוי, מלא מעיל על פני התרבות התא על-ידי הוספת נפח מספיק של פולי-L-ornithine מדולל פתרון (25 µg/mL) לצלחת תרבות תא, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.<ol>
<li>וארוקן את פולי-L-ornithine ולשטוף את x 2 טוב עם PBS. להוסיף נפח מספיק של 5 µg/mL laminin לגמרי לכסות את פני השטח תרבות, דגירה ב 37 ° C עבור 2 ח' וביופסיה laminin לפני ציפוי תאים או לאחסן צלחת ב 4 ° C עד שהוא נדרש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לזרום Cytometry Assay
הערה: הביטוי של סמנים ספציפית של NSCs, נוירונים ותאי גלייה נמדד על ידי לזרום cytometry assay13. הפרוטוקול מבוסס על מנון. et al.,13 עם שינויים מזעריים.
<ol><li>מביצועם neurospheres או ניתוק NSCs בתרבית מ מצופה לוחות מאת trypsinization כדי להפוך אותם תאים בודדים. להוסיף 500 µL מאגר קיבעון (2% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS) 100 µL של התליה תא (בסביבות 1 מיליון תאים הם מספיק מכתים עם כל נוגדן) ולאחר מכן דגירה הצינורות-RT למשך 15 דקות.</li>
	<li>שטיפת התאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS שפופרת, צנטריפוגה-110 גרם x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא, עוזב כ 100 µL בצינור.<ol>
<li>Permeabilize תאים עם Tween-20 (0.7% Tween-20 ב- PBS) על-ידי הוספת µL 500 מאגר Tween-20 100 µL תא השעיה. דגירה הצינורות-RT למשך 15 דקות על שייקר מסלולית (100 סל"ד).</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על צנטריפוגה וכן לשטוף את PBS. הסר את תגובת שיקוע הצינורות לחלוטין, משאיר רק בגדר מאחור. להוסיף 100 µL של נוגדנים העיקרי מדולל (ארנב אנטי עכבר βtub-III, GFAP, Nestin נוגדנים-ריכוז 1:200) דילול מאגר המכיל אלבומין פרה 1%, 10% סרום (נסיוב עז) ו- 0.5% Tween-20 ב- PBS ובעדינות triturate לערבב. דגירה הצינורות-RT במשך 30 דקות על תפקודי לב / נשימה.</li>
	<li>לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS ולהסיר את תגובת שיקוע הצינורות לחלוטין, משאיר רק בגדר מאחור.<ol>
<li>להוסיף 100 µL של נוגדנים משניים מדולל (עז אנטי ארנב FITC מצומדת-ריכוז שבערך) ב- PBS בגדר תא, בעדינות triturate לערבב. דגירה הצינורות-RT במשך 30 דקות על מטרף בחושך.</li>
		<li>לשטוף את הדגימות 2 x עם PBS, ואז לשטוף פעם אחת עם מאגר זרימה. צנטריפוגה, מחדש להשעות בתאים µL בכ 150 זרימה מאגר לניתוח cytometer זרימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li>
<li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360(2018).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li>
<li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li>
<li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li>
<li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerrari%2C+D+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).</li>
<li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li>
<li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li>
<li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241(2014).</li>
<li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li>
<li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells%3A+A+novel+role+for+c-Src%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li>
<li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160(2018).</li>
<li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li>
<li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li>
</ol>

אין ניגוד אינטרסים הכריז.

היא מאוד חשוב עבור מדעני מוח בעזרת מקור מתאים של תאי גזע עצביים. תאי גזע עצביים יכול להיות שנקטפו מאזורים שונים במוח העובר, הם יכולים ליצור סוגים ספציפיים של נוירונים ותאי גלייה. ישנן מספר שיטות אינדוקציה של ההתמיינות של תאי גזע עצביים כדי לגרום להם לייצר נוירונים בוגרים ותאי גלייה. ישנם דיווחים רבים המעידים כי תחת תרבות מסוים התנאים גדודים גורם עם מחלות, הם יכולים לייצר נוירונים14oligodendrocytes להפוך15,16 , האסטרוציטים...

תאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזורים שונים של המוח מבוגר ואת העובר, ויש להם נטייה ליצור סוגים שונים של נוירונים, תאי גליה1. האזורים subventricular המוח יונקים בוגרים2 קדושתו ganglionic במוח העובר לבטחון לאומי אזורים עשירים3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. במוח המתפתח, מספק קדושתו ganglionic רוב interneurons קורטיקלית במיוחד GABAergic interneurons3. יש גם שיטות פולשניות פחות לייצור תאי גזע עצביים מתאי גזע עובריים (ESCs) או להשתמש בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) להפחית את הביקוש חיה. למרות העובדה כי יצירת NSCs ESCs או iPSCs הוא אפשרי4,5, זה יש כמה יתרונות וחסרונות לעומת הבידוד של תאי גזע עצביים מבוגר או העובר המוח6,7, 8. הפרוטוקולים עבור גרימת את הבידול של ESCs ו- iPSCs לכיוון פנוטיפים עצביים הם תמיד זמן ועלות לצרוך, הקצב של הצלחה (70-80% Nestin חיובי תאים)5 מושווה נמוך עם בידוד ישיר של NSCs מ (החייתי במוח יותר מ-99% Nestin חיובי תאים)9. יתר על כן, תאי גזע לאבד את נטייתם הגנטית של יציבות ובידול אחרי קטעים מספר10,11. למרות שישנם דיווחים חדשים אחרים על המרה ישירה של תאים סומטיים לתוך NSCs, תאים אלה הם מהונדסים גנטית והם אינם נגישים בקלות בכל מעבדה12. לכן, עדיין יש ביקוש גדול עבור בידוד של תאי גזע עצביים מהמוח בעלי חיים; זה אפשרי לצמצם את כמות השימוש בבעלי חיים על ידי שיפור טכניקות כירורגיות. על-ידי הפחתת זמן ניתוח ושיפור הטכניקות, זה אפשרי לשמור תאים מן הנזק ולקבל שיעור הגבוה ביותר של NSCs של כל בעל חיים.
כאן, אנחנו מציגים טכניקה פשוטה and לשחזור עבור בידוד של תאי גזע עצביים של מוח העובר13 העכבר E.

<table><tbody><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל מלקחיים</td><td>פלקון</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>אדסון, 12 ס"מ, ישר</td><td>WPI</td><td>14226</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>צלחת סיגמא</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים, 12.5 ס"מ, ישר</td><td>WPI</td><td>15908</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה דומונט, 11 ס"מ, ישר</td><td>WPI</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>100983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמט</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>עיזים אנטי ארנב FITC מצומד נוגדן משני</td><td>Sigma</td><td>AP307F</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>סיגמא</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>הפרין&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>h3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>90909C</td><td></td></tr><tr><td>אינסולינסירינג עם 25-27 מד מחט&nbsp;</td><td>SUPA רפואי</td><td>A1SNL127</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NB בינוני</td><td>Gibco</td><td>21103-31</td><td></td></tr><tr><td>חומצת אמינו לא חיונית (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS ללא Ca ו-Mg</td><td>Gibco</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>5140122</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין</td><td>סיגמא</td><td>&nbsp; P4957</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי עכבר בטא טובולין-III נוגדן</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי עכבר GFAP נוגדן</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי עכבר נוגדן Nestin</td><td>Sigma</td><td>N5413</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל #3</td><td>WPI</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עקומת</td><td>WPI</td><td>14396</td><td></td></tr><tr><td>מספריים חדים ישרים</td><td>WPI</td><td>14192</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה</td><td>Roche</td><td>10109886001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות, T25</td><td>BD</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות, T75</td><td>BD</td><td>353024</td><td></td></tr><tr><td>מספריים Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vannas, &nbsp; 8 ס"מ, ישר&nbsp;</td><td>WPI</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

תאי גזע עצביים (NSCs) multipotent, יכולים להצמיח שלושת הסוגים התא העיקריים של מערכת העצבים המרכזית (CNS). In vitro לקשרי תרבות והרחבה של NSCs מספקים מקור מתאים של תאים עבור מדעני מוח ללמוד את הפונקציה של נוירונים ותאי גלייה יחד עם האינטראקציות שלהם. ישנן מספר טכניקות שדווחו על בידודו של תאי גזע עצביים של המוח בתרבית של מבוגר או העובר. במהלך פעולת המיקרוכירורגית לבודד NSCs מאזורים שונים של מערכת העצבים עובריים, חשוב מאוד לצמצם את הנזק לתאי המוח כדי לקבל את היחס הגבוה של תאי גזע בשידור חי וניתן להרחבה. טכניקה אפשרית להפחתת מתח במהלך בידוד התאים האלה מהמוח העובר העכבר הוא צמצום זמן כירורגי. . הנה, נדגים טכניקה שפותחה עבור בידוד מהיר של תאים אלה מן E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו. ניתוחים כוללות קצירת E13 העכבר העוברים מן הרחם, חותכים את פונטאנלה חזיתית של העובר עם טיפ המחט בנט, חילוץ במוח הגולגולת, microdissection של המוח מבודדים לקצור את קדושתו ganglionic, דיסוציאציה של הרקמה שנקטפו במדיום לבטחון לאומי כדי לקבל השעיה תא בודד, ולבסוף תאי ציפוי בתרבות ההשעיה ליצירת neurospheres.

ניתוח מיקרו, בידוד תא ותרבות Neurosphere. כאן, אנו הציג שיטה מהירה ויעילה העכבר E13 המוח למיקרו ובידוד של תאי גזע עצביים. מאמר זה מראה שזה אפשרי להסיר את כל המוח גולגולת העובר E העכבר13 דרך קרע בסדר ב פונטאנלה חזיתית. בשיטה זו, המוח מחזיקה מעמד פחות נזק, וזה אפשרי לבודד תאים מחלקים שונים של המוח. התאים שנקטפו יכול לייצר neurospheres במדיום לבטחון לאומי בנוכחות bFGF EGF, והם 150-200 µm גודל קוטר לאחר שבעה ימים בתרבות (איור 1 א'</s...

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

מטרת פרוטוקול וידאו זה היא הקמת פרוטוקול מקור ויעיל עבור עכבר עוברי עצבי גזע תא בידוד ותרבות. שלום, אני מרים סדגי-זאדה. אני סטודנטית לתואר שני בביולוגיה תאית ומולקולרית במכון רויאן.היום אני ועמיתי רוצים להראות לכם איך לקצור תאי גזע עצביים מ-13 גנגליונים של עכבר עוברים. שלום, אני בחרה עליזאדה-שורז'יסטאן. אני סטודנטית לתואר שני לביולוגיה תאית ומולקולרית במחלקה לתאי גזע במכון רויאן לביוטכנולוגיה.שלום, אני רזא דהגאני-ורנמקהסטי. כמו כן אני לומד ביולוגיה תאית ומולקולרית במכון רויאן. ניתוחים כוללים קצירת כל 13 עוברי עכבר מרחם.חיתוך החלק הקדמי של fontanel של העובר עם קצה מחט כפוף חילוץ המוח מהגולגולת. ניתוח מיקרו של מוח מבודד כדי לקצור את ההגמליוני. דיסוציאציה של הרקמה שנקטפו במדיום תאי גזע עצביים כדי להשיג השעיה של תא יחיד.ולבסוף, ציפוי תאים בתרבות השעיה כדי ליצור תאי עצב. לנקות ולחטא את העור של אזור הבטן על ידי ריסוס עם 70% אתנול. לשלוט על הבטן כלפי מעלה ולאחר מכן לחתוך את העור ואת הפנים עם מספריים כדי לחשוף חלל הבטן וקרני הרחם.הסר את קרני הרחם המכילות את העוברים על ידי מספריים ולהעביר אותם לתוך צינור חרוט 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל קר HEPES MEM חיץ. מניחים את הצינור חרוט מתחת למכסה המנוע זרימה למינלית. פתח את הכובע מתחת למכסה המנוע.מוציאים את קרני הרחם מהצינור, ושטיפת שלוש פעמים עם נפח מספיק ש

isolation-and-culture-of-embryonic-mouse-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מתאר את שיטת לבידוד של neuroprecursors מהקורטקס המתפתח של עכברים עובריים. ההליך להסרת עוברים מן הרחם, לנתח את רקמת קליפת המוח, ולעכל את קליפת המוח מבודד מוצג.

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

זה פרוטוקול וידאו מדגים את היישום של assay neurosphere לבידוד והרחבת בתאי גזע עצביים מן יואילו הוד מעלתם ganglionic היום עובריים 14-עכבר המוח.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

דרך אלטרנטיבית של בידוד motoneurons עכבר עובריים מן חוט השדרה מתואר. השיטה לוקחת בחשבון את העובדה לקטינים יכולים לאגד את הזיקה נמוך עצב p75NTR גורם הגדילה לקולטן. זה preplating לקטינים מבוססי מאפשרת טיהור דומה לזה עם נוגדן ספציפי נגד p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את...

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

הסרטון מדגים את תהליך הבידוד והטיפוח של תאי גזע עצביים מהאזור התת-קלוסלי של מוח העכבר. זה כרוך בניתוח רקמות, דיסוציאציה אנזימטית, וטיפוח אותם עם גורמי התמיינות כדי להתפתח לתאים עצביים בוגרים.

בידוד וטיפוח של תאי גזע עצביים בוגרים מהאזור התת-קלוסלי של העכבר

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת תאי אב עצביים (NPCs) במבחנה מתאי גזע עובריים של עכברים (mESCs). mESCs מתורבתים בתרחיף ליצירת גופים עובריים (EBs), אשר מונחים לאחר מכן להתמיין NPCs באמצעות טיפול בחומצה רטינואית בתרבית דבקה.

טכניקה ליצירת תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינותם לתאים עצביים. תאי גזע מתרחיף התא המבודד מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים ומתורבתים ליצירת נוירוספרות. לאחר מכן הנוירוספרות נשמרות במדיום התמיינות כדי ליצור תאים עצביים.

בידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינות לתאים עצביים

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

הקמת מערכות תרבית להרחבת תאי גזע עצביים בוגרים (aNSCs) מאפשרת בדיקה ויישום של תאי גזע עצביים בוגרים לטיפול. האזור התת-קלוסלי (SCZ) הוכר לאחרונה כאזור חדש ליצירת נוירובלסטים בעכברים בוגרים. כאן מתוארות שיטות לבידוד, הרחבה ובידול של SCZ-aNSCs.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

למד טכניקת מיקרוכירורגיה לבידוד תאי גזע עצביים מהאמיננס הגנגליוני בעוברי עכברים בגיל E13. שיטה זו מאפשרת ייצור נוירוספירות תוך שלושה ימים ומספקת מקור אמין למחקר התפתחות עצבית ורפואה רגנרטיבית.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

גלה סרטונים נוספים