גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים
25 בינואר 2019
המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש שילוב של חישובית ומחקר ספסל למצוא רצפי חדשניים אשר לא ניתן להפריד בקלות בין רצף טיהור משותף, אשר עשוי להיות מוכר באופן חלקי בלבד.
הפרוטוקול שלנו הוא משמעותי כי זה יכול לשמש כדי לזהות רצפים גנומיים שלא ניתן לבודד רצפי טיהור שותף, אשר עשויים עצמם להיות ידועים רק חלקית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא שזה זול, באמצעות תוכנה חופשית בעיקר כי ניתן להוריד, כמו גם גמיש. אתה יכול ליישם את זה על שאלות ביולוגיות רבות.
יישומים פוטנציאליים כוללים זיהוי מטרות חיסון חיידקי וזיהוי וירוסים שהרצפים שלהם שונים מאוד ממיקרואורגניזמים ידועים. ניתן להחיל שיטה זו על כל מערכת שבה לא ניתן להפריד את הלא נודע באופן ניסיוני, כל עוד רצף הייחוס ללא היעד הגנומי זמין. טכניקה זו לוקחת קצת ניסוי וטעייה, ולכן סבלנות חשובה.
ייתכן שיהיה עליך בעיות לירות בתוכניות. אתה יכול להשתמש בתוכניות שונות מאלה שאנו מתארים כאן. השתמש במדריכים למשתמש ככל האפשר.
הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שעבודה חישובית תלויה בהבנה בסיסית של אופן המבנה של תיכנות שורת הפקודה. כדי להתחיל, השתמש Trimmomatic 0.32 כדי להסיר מתאמי illumina ובסיסים באיכות נמוכה. השתמש בגירסה אגס 0.9.11 כדי ליצור קריאות ממוזגות באיכות גבוהה מפלט trimmomatic מזווג קריאות באמצעות פרמטרי ברירת המחדל.
לאחר מכן השתמש בגירסה זוחלים 1.1 כדי לתקן את הקרויים המיוצרים באמצעות אגס. לבסוף השתמש ב- Trinity גירסה 2.4.0 במצב ברירת מחדל כדי להרכיב את הרצפים מתוקנים. עבור ספריות ספציפיות לגדילים, השתמש בפרמטר SS_lib_type גדיל.
הפלט הוא קובץ FASTA שימוקם בספריה חדשה הנקראת trinity_output. הפוך מסד נתונים BLAST של רצף ההפניה nucleotide_reference. פאסה בשורת הפקודה.
BLAST התאימה לשאילתה שהורכבה למסד הנתונים של ההפניה. כדי להשיג קובץ פלט, השתמש BLAST_results. txt כדי ליצור פלט טבלאי הנדרש עבור שלבי עיבוד תת-קווינס עם סקריפטים של פייתון, השתמש ב- outfmt 6 להקפצה מוגברת, השתמש ברצפי חלבונים מההרכבה כשאילתת BLAST עם NUCLEOTIDE BLAST מתורגם, המבצע תרגום שישה-לכיוון של מסד הנתונים של הנוקלאוטיד.
כדי להשיג רצפי חלבונים עבור השאילתה, הפעל את TransDecoder. הפקודה Long0rfs כדי לזהות את מסגרות הקריאה הפתוחות הארוכות ביותר מתוך רצפי שאילתות שהורכבו. עכשיו תרוץ תבלסטן.
במידת הצורך, ודא שהקוד הגנטי הנכון נבחר עבור האורגניזם הנחקר באמצעות db_gencode עם אפשרות הקוד המתאימה. אם יש התייחסות לחלבון באיכות גבוהה, השתמשו בהתאמת חלבון-חלבון עם blastp במקום tblastn הפוך מסד נתונים BLAST של התייחסות החלבון. הקפד לשמור את התוצאה כקובץ לעיבוד במורד הזרם, ולהשתמש בפלט טבלאי כדי להבטיח שקבצי ה- Script של פייתון יוכלו לנתח אותם כראוי.
עכשיו, השתמש בסקריפט הפייתון התת-אקטיבי כדי להסיר רצפים תואמים. כדי למפות את ההיקראות על ההרכבה, השתמש BWA-MEM גירסה 0.7.12 או bowtie 2 כדי למפות את קריאות גלם שהורדו על הרכבת השאילתה. תחילה, צור אינדקס להרכבה ולאחר מכן מפה את ההקרנות.
הפלט יהיה בתבנית SAM. הפעל את הסרת קובץ ה- Script של פייתון ללא מיפוי. py באמצעות קובץ SAM כקלט.
פעולה זו מזהה את השמות של רצפי שאילתות ללא קריאות תואמות ושמור אותם בקובץ טקסט חדש. הפלט של השלב הקודם הוא רשימה של שמות רצפים בקובץ txt. חלץ קובץ FASTA עם רצפים אלה.
הפלט יהיה קובץ fasta. השתמשו ב-Genius כדי לקבוע רצפי פריימר אופטימליים באופן ידני. הדגש רצף מועמדים של 21 עד 28 זוגות בסיס עבור פריימר קדימה, הימנעות ריצות של ארבעה או יותר של כל בסיס.
נסו למקד אזור עם שילוב אחיד למדי של כל זוגות הבסיס. G או C יחיד בשלושה פריים אנד מועיל, עוזר לעגן את פריימר. לחץ על הכרטיסיה סטטיסטיקה בצד ימין של המסך כדי להציג את טמפרטורת ההיתוך המשוערת של רצף זה כאשר האזור המועמד מסומן.
כוון לטמפרטורת התכה בין 55 ל -60 מעלות צלזיוס, תוך הימנעות מחזרות, ו ריצות ארוכות של G C.Choose פריימר הפוך באותו אופן, ממוקם 150 עד 250 זוגות בסיס שלושה פריים של פריימר קדימה. בעוד אורכי פריימר לא צריך להתאים, טמפרטורת ההיתוך החזוי צריך להיות קרוב ככל האפשר לזה של פריימר קדימה. הקפד להפוך את הרצף על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ב- Genius בזמן שהרצף מסומן באפשרות תפריט.
שיטה חלופית היא להשתמש בפונקציה עיצוב פריימר, שנמצאת בסרגל הכלים העליון בחלון הרצף. הוסף את האזור להגברתו תחת אזור היעד. תחת הכרטיסיה מאפיינים, הוסף את הגודל הרצוי, טמפרטורת ההיתוך ו- G C אחוזים, ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור פריימרים.
כדי לבצע אימות PCR כמותי של הרצף הנותר, הכינו תחילה תערובת תגובה עבור כל תבנית ב- triplicate, עם תערובת המאסטר הירוקה של SYBR, פריימרים קדימה ואחפה ומים, לנפח כולל של 25 מיקרוליטרים. הפעל תוכנית qPCR המודיעה על-ידי הטמפרטורה ותזמן ההארכה שהיו מאומתים בעבר. עקומות denaturing הסופי צריך להיווצר לפחות בפעם הראשונה פריימרים מועסקים qPCR כדי לאמת את ההגברה של מוצר DNA יחיד.
למדוד את האותות הירוקים qPCR SYBR יחסית Actin על ידי Ct עבור כל המקרים, לחשב את הממוצע, ואת סטיית התקן של שניים Ct יחסית Actin. בצע אלקטרופורזה של ג'ל נקודת קצה, כדי לאשר זיהוי נכון של גודל המוצר על-ידי qPCR. כאן, להפעיל 25 microlitres של המוצר qPCR מעורבב עם חמישה microlitres של צבע 6X Glitterol על 2%TAE אגרוז ג'ל ב 200 וולט במשך 20 דקות.
אם ה- qPCR שלך מראה שלא זיהית את רצפי היעד, חזור על המחזור כולו עם הפניה חדשה, שעשויה להתקבל ממסד נתונים מקוון. הפרויקט התת-אקטיבי במקרה זה התחיל ברצף ה-RNA מרקמה מרופדת חיידקים של פרוש זברה בוגר זכר ונקבה. בסופו של דבר, זוהו 935 גנים סומטיים שלא נכללו קודם לכן בכל ביאור הגנום.
לאחר סינון חישובי, PCR כמותי עשוי להניב תוצאה שלילית שבה לא היה הבדל בזיהוי על פני רקמות ציפורים. לעומת זאת, תוצאה חיובית המייצגת את הזיהוי של רצף יעד אמיתי מאושרת כאשר DNA גנומי qPCR מראה זיהוי גדול יותר סטטיסטית ברקמת העניין, ביחס להתייחסות. כאן, גן הצמד אלפא אומת להיות מוגבל נבט כי זה היה מדולדל ברקמה סומטית יחסית לדנ"א האשכים שבו היה נוכח כי רמות שוות ערך Actin.
חשוב לזכור להשתמש בקלט הנכון במהלך כל אחד מהצעדים החישוביים. ייתכן שיהיה עליך לעבור את חיסור המחזור מספר פעמים כדי להשיג את רצף היעד או רצפים. מגוון ניתוחים פילוגנטיים, מבניים ותפקודיים יכולים להתבצע על הגנים שהתגלו.
שיטות נוספות אלה מעניקות תובנה לגבי התפקידים האבולוציוניים והתפקודיים של הגנים. זיהינו את הגן הראשון על כרומוזום ציפורי שיר מוגבל נבט, שהרחיב את העניין ביסוד הגנומי המפתיע הזה. העבודה שלאחר מכן הראתה כרומוזומים דומים במין ציפורי שיר רבים המכילים גנים רבים נוספים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של רצפים גנומיים שקשה לבודד מרצפים המטהרים במקביל. הוא רותם טכניקות של מחקר חישובי ומעבדתי כאחד, ובכך הופךו למתאים למגוון של מחקרים ביולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנומיקה
- ביולוגיה חישובית
- מיקרוביולוגיה
רקע
- זיהוי רצפים גנומיים עלול להיות מאתגר כאשר הם מטוהרים יחד עם רצפים אחרים.
- ייתכן שחלק מהרצפים המטוהרים במשותף ידועים רק באופן חלקי.
- שיטה זו היא חסכונית, שכן היא משתמשת בעיקר בתוכנות חינמיות.
- היא גמישה ויכולה לתת מענה לשאלות ביולוגיות מרובות.
מטרת המחקר
- למציאת רצפים גנומיים חדשים שלא ניתן להפרידם בקלות מרצפים שמטופלים יחד בתהליך הניקוי (co-purifying sequences).
- לספק שיטה שניתן ליישם במערכות ביולוגיות שונות.
- לשפר את הזיהוי של מטרות פוטנציאליות לחיסונים בקטריאליים ושל רצפים ויראליים לא ידועים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שילוב של ניתוח חישובי וטכניקות ניסיוניות.
- שימוש בתוכנות חינמיות לניתוח גנומי.
- יישום של שיטת ניסוי וטעייה לדיוק השיטה.
- רצפי ייחוס נדרשים לצורך יישום יעיל.
תוצאים עיקריים
- הפרוטוקול מזהה בהצלחה רצפים גנומיים שקשה לבודד.
- הוא מדגים גמישות בהקשרים ביולוגיים שונים.
- יישומים פוטנציאליים כוללים זיהוי מטרות לחיסונים ורצפים ויראליים לא ידועים.
- סבלנות היא חיונית בשל אופי הניסוי והטעייה של השיטה.
מסקנות
- טכניקה זו היא כלי בעל ערך למחקר גנומי.
- היא פותחת נתיבים חדשים לזיהוי רצפים ביולוגיים חשובים.
- שיפור ויישום נוספים עשויים להוביל לתגליות משמעותיות במיקרוביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
גנומיקה חיסורית (Subtractive genomics) מאפשרת זיהוי של רצפים גנומיים חדשים שאינם ניתנים לבידוד פיזי מתערובות מורכבות, ובכך היא פותרת צוואר בקבוק מרכזי בגילוי מטרות לפיתוח חיסונים ומחקר אנטי-ויראלי. באמצעות חיסור חישובי של רצפי ייחוס ידועים מנתונים גנומיים מעורבים, השיטה תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים כאשר טיהור פיזי אינו מעשי או יקר מדי. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מועמדים מובילים על ידי אספקת נתיב בעלות נמוכה ובמדד של יכולת הרחבה לגילוי רצפים רלוונטיים ביולוגית, כגון אנטיגנים ויראליים או פקטורי virulent של חיידקים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות בידוד רצפים ספציפיים לפתוגן מרעש גנומי של המארח או מהרקע.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות סינון חישובי איטרטיבי ואישור ביטוי ספציפי לרקמה באמצעות qPCR.
- ערך חזוי: מסייע במיון פורטפוליו על ידי זיהוי גנים המוגבלים לקו הנבט או מועשרים בפתוגן, בעלי פוטנציאל כנקודות התערבות סלקטיביות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר רצפי חומצות גרעיניות מתוקפים המתאימים לפיתוח בדיקות מבוססות qPCR ולסריקה ברזולוציה גבוהה.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של תהליכי זיהוי באמצעות עיצוב פריימרים ותיקוף יעילות השכפול.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מספר מטרות על ידי התאמת מחזורי חיסור רפרנס להקשרים גנומיים חדשים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אישור העשרה של המטרה ברקמות רלוונטיות למחלה באמצעות quantitative PCR.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחיתה עמימות בביולוגיה של המטרה על ידי אימות דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמות לפני ביצוע מחקרים פונקציונליים.
- סנכרון עם סמנים ביולוגיים: תומכת בזיהוי רצפים עם ביטוי דיפרנציאלי שעשויים לשמש כסמנים ביולוגיים תרגומיים במודלים של זיהום או מחלה.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ומאפשרת זיהוי מטרות מונחה-השערה לפני שלב יצירת המועמדים (lead generation) וההערכה הפרה-קלינית, במיוחד כאשר רצפי המטרה מוסתרים עקב מורכבות גנומית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי הסרת אלמנטים גנומיים ידועים כדי לחשוף רצפים חדשים בעלי עניין, כגון גנים ספציפיים לנתיב פתוגני או גנים בעלי ביטוי מוגבל.
- סריקה: מייצרת רצפים מוכנים לבדיקה עם פריימרים מאושרים, מה שמאפשר סריקה אמינה של תרכובות או התערבויות בתהליכי עבודה המשכיים.
- אנליטיקה: מייצרת ערכי Ct כמותיים ונתוני עקומת המסה מ-qPCR, מה שמאפשר ניתוח השוואתי של שכיחות המטרה בין סוגי דגימות שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי להמשכיות פרה-קלינית על ידי אישוש העשרה של המטרה בתאי נבט או ברקמות נגועות ביחס לבקרות סומטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת מחזור חישובי-ניסיוני בר-שימוש לצורך עידון איטרטיבי של רצפי מטרה לאורך פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות באמצעות סינון חיסורי ואישור ניסיוני.
- ערך תפעולי: מספק הדירות באמצעות צינורות עיבוד ביו-אינפורמטיים סטנדרטיים ומדידות qPCR בשלוש חזרות עם נורמליזציה לגנים שומרי בית (housekeeping genes).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של מטרות רלוונטיות ביולוגית בהשקעה מינימלית בתשתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על ביטוי ספציפי לרקמה ושימור אבולוציוני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכלי ביואינפורמטיקה כגון BLAST, Trinity, TransDecoder וניתוח נתוני qPCR.
- תלוי בגישה למסדי נתונים גנומיים, טרנסקריפטומיים או נתוני הרכבה (assembly) לצורך מחזורי חיסור יעילים.
- מחייב זמינות של דגימות ביולוגיות T-positive ו-T-negative לצורך תיקוף מבוסס qPCR.
- כולל פתרון בעיות (troubleshooting) איטרטיבי של כלי שורת פקודה ואופטימיזציה של פרמטרים לשלבי ההרכבה והיישור (alignment).
- מוגבל על ידי השלמות וההתאמה של רצפי הייחוס; רצפי ייחוס לא מספיקים עלולים להשאיר רעש שיורי או לגרום לחיסור יתר של אותי המטרה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:08
De novo Assemble Starting Sequence
2:03
BLAST the Assembly Against the Reference Sequence
4:44
Design Primers for the Sequence that Remains
6:25
qPCR Validation of the Remaining Sequence
7:51
Results: Example Data of qPCR Results Including Negative and Positive Outcomes
8:53
Conclusion
