התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב
December 8th, 2018
פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לשלב את השימוש במיקרו נוזלים עם מערכי מיקרו אלקטרודה כדי ליצור את הפלטפורמה המתאימה לחקר תקשורת עצבית והפצת אותות אקסונאליים. שלום, אני פאולו אגואר ואני PI של המעבדה להנדסת נוירו וחישוב מדעי המוח ב INEB, משמש קוד להנדסה ביו רפואית באוניברסיטת פורטו, פורטוגל. הבנת העברת מידע במעגלים עצביים נותרה אחד האתגרים הגדולים ביותר במדעי המוח.
היום, אני הולך להראות לך איך אנחנו יכולים לשלב מערכי מפעיל מיקרו בודדים עם מיקרו נוזלים וכלים תוכנה שפותחו כאן במעבדה שלנו, כדי לזהות ולאפיין פוטנציאל פעולה הפצה. אנו משתמשים בהתקנה זו במגוון מחקרים, כלומר קידוד ופענוח עצביים, ובתקשורת בין נוירונים חושיים וסוגי תאים אחרים. אנו מאמינים כי ההדגמה החזותית של פרוטוקול זה היא קריטית.
מאז הרכבת מערכי מיקרו נוזלי מיקרו אלקטרודה הוא קושי בניהול, וקשה לשחזר רק על ידי שכפול פרוטוקולים. עבור השוק, מכירות פולחן על פלטפורמה זו אינה פשוטה, כמו ABAs קונבנציונאלי, וזה דורש תשומת לב מיוחדת החומר יושב התא, מגנטים תרבות. התקנה זו מאפשרת לנו ללמוד מספר מאפיינים הקשורים לתקשורת, כגון מהירות התפשטות וכיוון, בסביבה מבוקרת היטב.
למרות שהליך ההקלטה הוא פשוט, ניתוח נתונים דורש ידע ושימוש בכלים החישוביים הנכונים. ביום שלפני הישיבה התא, להתחיל על ידי הכנת התקנים מיקרו נוזלים, על ידי ניקוי למטה עם קלטת ויניל. לחץ בעדינות על הקלטת כנגד ההתקן כדי להגיע לכל אזורי המיקרו-נוזלים.
פלזמת אוויר לנקות את MEA במשך שלוש דקות כדי לנקות את פני השטח ולהפוך אותו הידרופילי יותר. בתוך מכסה המנוע של זרימה למינארית, הטביעו את המיקרו-נוזלים באתנול של 70 אחוז. אפשר להם להתייבש באוויר.
מניחים כל MEA בצלחת פטרי, ו לעקר על ידי 15 דקות של חשיפה לאור UV. לאחר מכן, עבור לאזור המרכזי של MEA עם 500 מיקרוליטרים של פתרון PEI. דגירה לפחות שעה אחת.
בתוך מכסה המנוע לזרימת למינאר, שאף את פתרון ציפוי ה- PEI מפני השטח של MEA. לאחר מכן, לשטוף את MEAs ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של מים סטריליים. בעזרת מיקרוסקופ סטרילי, ממוקם בתוך מכסה המנוע לזרימת למינאר.
מרכז את שבב MEA, ולהוסיף מיליליטר אחד של מים סטריליים לאזור המרכזי של MEA. לאחר מכן, מקם את ההתקן המיקרו-נוזלי על גבי משטח ה- MEA, ויישר בזהירות את הרשת המיקרו-מיקרואקטיבית של ה- MEA. שאפו את המים המוגזמים, והם דגירה לילה ב 37 מעלות, כדי לאפשר התקשרות מלאה.
למחרת, לטעון את הבארים עם למינין, ותצנרר שוב. לאחר איסוף העובר susseds, להמשיך לנתח קליפת המוח הקדם חזיתית. התחל על ידי חשיפה זהירה של המוח, באמצעות זוג מדפים.
לאחר מכן, הסר בעדינות את המוח מהחלל שלו. כסו אותו עם H-HBSS קר. כאשר קיים, להסיר ולהשליך את נורות הריח.
לבסוף, לנתח את קליפת המוח הקדם חזיתית. להבטיח הסרה מלאה של קרום ההתהוות. חזור על הליך זה עבור שתי ההמיספרות.
עבור מספר המוחות הדרושים למחקר שלך. בתוך מכסה המנוע לזרימה למינארית, לאסוף את שברי קליפת המוח נותקו בעבר בסך הכל חמישה מיליליטר של H-HBSS. לאחר מכן, להעביר שברים אלה לצינור כרוני סטרילי 15 מיליליטר.
פיפטה, ויש לי 2.3 מיליליטר של פתרון טרי לצינור המכיל את שברי קליפת המוח. מערבבים את ההשעיה, ודגירה ב 37 מעלות במשך 15 דקות. להתסיס כל חמש דקות.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי המכיל את טריפסין, הוסף H-HBSS המכיל FBS, כדי להשבית את טריפסין הנותרים. להתסיס בעדינות. תן שברי קליפת המוח להתיישב, ולהשליך את העל-טבעי.
לשטוף פעמיים עם H-HBSS, כדי להסיר את FBS, ולהשליך את supernatant שוב. מוסיפים מדיום בסיס עצבי נוסף, ומנתקים רקמות מכנית על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה. השלך את הרקמה הנותרת על ידי סינון השעיית המלח באמצעות מסננת תאים.
לאחר מכן, לערבב 20 microliters של השעיית תא עם 20 microliters של כחול טריפאן. להעביר 10 microliters לתא Neubauer, ולספור את מספר תאים קיימא. מיד לפני התא יושב, להסיר למינין מכל הבארים של מיקרו EF. לאחר מכן, מוסיפים את הנפח הקטן של מדיום על-טבעי לכל באר של תא האקסונאלי.
לאט לאט זרע חמישה microliters של השעיית תא לתא somal. דגירה ב 37 מעלות במשך שעה אחת כדי לאפשר חיבור תא למצע. לאחר שעה, ממלאים בעדינות כל באר במדיום מתווסף חם.
הוסף אמצעי אחסון קטנים כדי למנוע ניתוק תאים. לאחר מכן, להעביר את מיקרו EF לאנקובטור. כאן מוצגת תרבות בחמישה ימים במבחנה.
אחרי שבוע, תרבויות מתחילות להפגין פעילות ספונטנית. לפני ביצוע הקלטות, השתמש בבקר טמפרטורה כדי לאכול את צלחת בסיס האש מראש. לאחר מכן, מניחים את המיקרו EF על הקדם-דגימה, סוגרים ותופסים את המכסה.
כדי להקליט, פתח את התוכנה הניסיונית מרובת הערוצים. הגדר את קצב הדגימה ל- 20 קילוהרץ. גרור את המסנן ואת התיבות המוקלטות וחבר אותם ברצף כדי להקליט נתונים גולמיים ומסוננים.
התחל את רכישת הנתונים כדי להמחיש את האותות ואת הרשומה המהירה. ניתן לחקור במהירות את הנתונים המוקלטים באמצעות מנתח רב ערוצי. כאן, התפשטות האותות לאורך המיקרוגרובים כבר ברורה.
כדי לזהות ולאפיין אירועים מופצים אלה, פתח את ההקלטה שלך בצייד מיקרו ספייק. לחץ על לחצן פרטי הקובץ כדי לגשת להגדרות ההקלטה ובחר את קבוצת המיקרו אלקטרודות לניתוח. הגדר את הסף להפצת זיהוי אירועים.
ונתונים לקריאה מהירה. התוכנה ת לפרט את כל הרצפים שזוהו. לאחר מכן המשתמש יכול להעריך את מהירות ההפצה כמידע, בין זוגות של אלקטרודות מיקרו, ובהתבסס על המרחק הבין-מרחק והמתאם הצולב שלהם.
הכלי גרף כימותרפיה מאפשר למשתמש להעריך ידנית את מהירות ההפצה. כאן מוצג אירוע הפצה. זוהה לאורך ארבע אלקטרודות מיקרו בתוך מיקרוגרוב.
אירועים אלה יכולים להיות מיוצגים בעלילה של ראסר. הנה פעילות ההפצה לאורך 11 מיקרוגרובים בשתי הדקות הראשונות של ההקלטה. המיקרוגרוב הגבוה והנמוך צבוע בצהוב ואדום, בכבוד.
שימו לב לסנכרון הפעילות לאורך 11 המיקרוגרובים. הסינכרון אינו תלוי בקצב הפעילות. כפי שניתן לראות בווריאציות של קצב הירי המיידי של שני המיקרוגרובים.
מיקרוגרובים מתפקדים גם כמגברי אותות אקסונאליים, כפי שמוצג בעלילה של הקופסה ושפם. הראינו לך כיצד לשלב מיקרו נוזלים עם MEAs, וכיצד לתרבת נוירונים עליהם. כמו כן, כיצד להקליט ולחלץ נתונים משמעותיים מהקלטות אלה.
אנו מקווים הדגמה זו כדי להיות שימושי עבור המחקר שלך, למה ייתכן שתרצה ללמוד את התקשורת במעגלים עצביים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מדגים את השילוב של מערכי מיקרואלקטרודות עם מכשירים מיקרופלואידיים לחקר העברת פוטנציאל פעולה בתרביות עצביות. הוא מדגיש את החשיבות של הדגמה ויזואלית ושימוש בכלי חישוב ידידותי למשתמש לניתוח נתונים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- הנדסת עצבים
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- הבנת העברת מידע במעגלים עצביים היא אתגר מרכזי במדעי המוח.
- מערכי מיקרואלקטרודות מאפשרים הקלטה של פעילות חשמלית מנוירונים.
- מכשירים מיקרופלואידיים מאפשרים שליטה מדויקת בסביבה התאית.
- שילוב של טכנולוגיות אלו יכול לשפר את חקר התקשורת העצבית.
מטרת המחקר
- ליצור פלטפורמה לחקר תקשורת עצבית והתפשטות אותות אקסונליים.
- לאיתור ואפיון פוטנציאלי פעולה מתפשטים בתרביות עצביות.
- כדי להקל על מחקר בקידוד ועיבוד עצבי.
שיטות בשימוש
- שילוב של מערכי מיקרואלקטרודות עם מכשירים מיקרופלואידיים.
- שימוש בכלי תוכנה שפותחו לניתוח נתונים.
- הדגמה ויזואלית של הפרוטוקול לשם בהירות.
- יישום במחקרים שונים הכוללים נוירונים חושיים.
תוצאות עיקריות
- גילוי ואפיון מוצלחים של פוטנציאלי פעולה.
- הבנה משופרת של מנגנוני התקשורת העצבית.
- הדגמה של יעילות הפרוטוקול ביישומים מחקריים.
- פיתוח כלי חישוב ידידותי למשתמש לניתוח נתונים.
מסקנות
- השימוש המשולב במערכי מיקרואלקטרודות ומיקרופלואידיקה יעיל לחקר הפעילות העצבית.
- גישה זו יכולה לקדם מחקר במדעי המוח והנדסת עצבים.
- פרוטוקולים ויזואליים חיוניים לשחזור והבנה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This microfluidic-MEA platform addresses a key challenge in neuroscience drug discovery: isolating axonal signal propagation from somatic noise in neuronal cultures. By enabling high-resolution, long-term recording of spike propagation with improved signal-to-noise ratio, the method supports mechanistic de-risking of targets involved in neurodevelopment, neurodegeneration, and neuroregeneration. It provides predictive confidence in early discovery by quantifying communication-related phenotypes such as conduction velocity and firing patterns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal signaling to clarify pathway-specific communication in neuronal circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of targets modulating spike propagation velocity and conduction failure.
- Predictive Value: Quantifies anterograde spike transmission and coding mechanisms to inform portfolio triage based on functional target engagement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated, compartmentalized neuronal cultures for downstream compound evaluation with controlled axonal alignment and microelectrode coupling.
- Quantitative Outputs: Delivers reproducible, high-resolution measurements of propagation velocity, conduction failure, and firing rate for reliable compound screening.
- Scalability & Reuse: Enables platform standardization across studies of sensory neuron communication and co-culture configurations, supporting assay transferability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models neurodevelopmental and neurodegenerative processes by tracking axonal signal propagation over weeks in vitro.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by quantifying communication phenotypes relevant to circuit dysfunction and repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through objective metrics of neuroregenerative potential and information coding fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing functional readouts that bridge phenotypic screening and mechanistic validation in neuronal systems.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating axonal contributions to network activity in controlled microenvironments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal cultures with standardized electrophysiological readouts for compound effect evaluation.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions via propagation velocity, conduction failure, and firing rate metrics derived from spike train analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling axonal communication dynamics relevant to neurodegeneration and neuroregeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying sensory neuron communication and co-culture systems across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuronal signal propagation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through compartmentalized culture design and long-term stability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in circuit-based pathologies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable axonal communication phenotypes linked to disease mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, neuronal culture, and electrophysiological recording.
- Depends on access to microelectrode arrays, plasma cleaners, laminar flow hoods, and temperature-controlled recording systems.
- Necessitates cross-team standardization for consistent device alignment, cell seeding, and medium exchange protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different neuronal types or co-culture configurations beyond prefrontal cortex-derived cultures.
- Practical limitations include the technical complexity of microfluidic-MEA assembly and the need for specialized computational tools for spike propagation analysis.
