התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב
8 בדצמבר 2018
פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לשלב את השימוש במיקרו נוזלים עם מערכי מיקרו אלקטרודה כדי ליצור את הפלטפורמה המתאימה לחקר תקשורת עצבית והפצת אותות אקסונאליים. שלום, אני פאולו אגואר ואני PI של המעבדה להנדסת נוירו וחישוב מדעי המוח ב INEB, משמש קוד להנדסה ביו רפואית באוניברסיטת פורטו, פורטוגל. הבנת העברת מידע במעגלים עצביים נותרה אחד האתגרים הגדולים ביותר במדעי המוח.
היום, אני הולך להראות לך איך אנחנו יכולים לשלב מערכי מפעיל מיקרו בודדים עם מיקרו נוזלים וכלים תוכנה שפותחו כאן במעבדה שלנו, כדי לזהות ולאפיין פוטנציאל פעולה הפצה. אנו משתמשים בהתקנה זו במגוון מחקרים, כלומר קידוד ופענוח עצביים, ובתקשורת בין נוירונים חושיים וסוגי תאים אחרים. אנו מאמינים כי ההדגמה החזותית של פרוטוקול זה היא קריטית.
מאז הרכבת מערכי מיקרו נוזלי מיקרו אלקטרודה הוא קושי בניהול, וקשה לשחזר רק על ידי שכפול פרוטוקולים. עבור השוק, מכירות פולחן על פלטפורמה זו אינה פשוטה, כמו ABAs קונבנציונאלי, וזה דורש תשומת לב מיוחדת החומר יושב התא, מגנטים תרבות. התקנה זו מאפשרת לנו ללמוד מספר מאפיינים הקשורים לתקשורת, כגון מהירות התפשטות וכיוון, בסביבה מבוקרת היטב.
למרות שהליך ההקלטה הוא פשוט, ניתוח נתונים דורש ידע ושימוש בכלים החישוביים הנכונים. ביום שלפני הישיבה התא, להתחיל על ידי הכנת התקנים מיקרו נוזלים, על ידי ניקוי למטה עם קלטת ויניל. לחץ בעדינות על הקלטת כנגד ההתקן כדי להגיע לכל אזורי המיקרו-נוזלים.
פלזמת אוויר לנקות את MEA במשך שלוש דקות כדי לנקות את פני השטח ולהפוך אותו הידרופילי יותר. בתוך מכסה המנוע של זרימה למינארית, הטביעו את המיקרו-נוזלים באתנול של 70 אחוז. אפשר להם להתייבש באוויר.
מניחים כל MEA בצלחת פטרי, ו לעקר על ידי 15 דקות של חשיפה לאור UV. לאחר מכן, עבור לאזור המרכזי של MEA עם 500 מיקרוליטרים של פתרון PEI. דגירה לפחות שעה אחת.
בתוך מכסה המנוע לזרימת למינאר, שאף את פתרון ציפוי ה- PEI מפני השטח של MEA. לאחר מכן, לשטוף את MEAs ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של מים סטריליים. בעזרת מיקרוסקופ סטרילי, ממוקם בתוך מכסה המנוע לזרימת למינאר.
מרכז את שבב MEA, ולהוסיף מיליליטר אחד של מים סטריליים לאזור המרכזי של MEA. לאחר מכן, מקם את ההתקן המיקרו-נוזלי על גבי משטח ה- MEA, ויישר בזהירות את הרשת המיקרו-מיקרואקטיבית של ה- MEA. שאפו את המים המוגזמים, והם דגירה לילה ב 37 מעלות, כדי לאפשר התקשרות מלאה.
למחרת, לטעון את הבארים עם למינין, ותצנרר שוב. לאחר איסוף העובר susseds, להמשיך לנתח קליפת המוח הקדם חזיתית. התחל על ידי חשיפה זהירה של המוח, באמצעות זוג מדפים.
לאחר מכן, הסר בעדינות את המוח מהחלל שלו. כסו אותו עם H-HBSS קר. כאשר קיים, להסיר ולהשליך את נורות הריח.
לבסוף, לנתח את קליפת המוח הקדם חזיתית. להבטיח הסרה מלאה של קרום ההתהוות. חזור על הליך זה עבור שתי ההמיספרות.
עבור מספר המוחות הדרושים למחקר שלך. בתוך מכסה המנוע לזרימה למינארית, לאסוף את שברי קליפת המוח נותקו בעבר בסך הכל חמישה מיליליטר של H-HBSS. לאחר מכן, להעביר שברים אלה לצינור כרוני סטרילי 15 מיליליטר.
פיפטה, ויש לי 2.3 מיליליטר של פתרון טרי לצינור המכיל את שברי קליפת המוח. מערבבים את ההשעיה, ודגירה ב 37 מעלות במשך 15 דקות. להתסיס כל חמש דקות.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי המכיל את טריפסין, הוסף H-HBSS המכיל FBS, כדי להשבית את טריפסין הנותרים. להתסיס בעדינות. תן שברי קליפת המוח להתיישב, ולהשליך את העל-טבעי.
לשטוף פעמיים עם H-HBSS, כדי להסיר את FBS, ולהשליך את supernatant שוב. מוסיפים מדיום בסיס עצבי נוסף, ומנתקים רקמות מכנית על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה. השלך את הרקמה הנותרת על ידי סינון השעיית המלח באמצעות מסננת תאים.
לאחר מכן, לערבב 20 microliters של השעיית תא עם 20 microliters של כחול טריפאן. להעביר 10 microliters לתא Neubauer, ולספור את מספר תאים קיימא. מיד לפני התא יושב, להסיר למינין מכל הבארים של מיקרו EF. לאחר מכן, מוסיפים את הנפח הקטן של מדיום על-טבעי לכל באר של תא האקסונאלי.
לאט לאט זרע חמישה microliters של השעיית תא לתא somal. דגירה ב 37 מעלות במשך שעה אחת כדי לאפשר חיבור תא למצע. לאחר שעה, ממלאים בעדינות כל באר במדיום מתווסף חם.
הוסף אמצעי אחסון קטנים כדי למנוע ניתוק תאים. לאחר מכן, להעביר את מיקרו EF לאנקובטור. כאן מוצגת תרבות בחמישה ימים במבחנה.
אחרי שבוע, תרבויות מתחילות להפגין פעילות ספונטנית. לפני ביצוע הקלטות, השתמש בבקר טמפרטורה כדי לאכול את צלחת בסיס האש מראש. לאחר מכן, מניחים את המיקרו EF על הקדם-דגימה, סוגרים ותופסים את המכסה.
כדי להקליט, פתח את התוכנה הניסיונית מרובת הערוצים. הגדר את קצב הדגימה ל- 20 קילוהרץ. גרור את המסנן ואת התיבות המוקלטות וחבר אותם ברצף כדי להקליט נתונים גולמיים ומסוננים.
התחל את רכישת הנתונים כדי להמחיש את האותות ואת הרשומה המהירה. ניתן לחקור במהירות את הנתונים המוקלטים באמצעות מנתח רב ערוצי. כאן, התפשטות האותות לאורך המיקרוגרובים כבר ברורה.
כדי לזהות ולאפיין אירועים מופצים אלה, פתח את ההקלטה שלך בצייד מיקרו ספייק. לחץ על לחצן פרטי הקובץ כדי לגשת להגדרות ההקלטה ובחר את קבוצת המיקרו אלקטרודות לניתוח. הגדר את הסף להפצת זיהוי אירועים.
ונתונים לקריאה מהירה. התוכנה ת לפרט את כל הרצפים שזוהו. לאחר מכן המשתמש יכול להעריך את מהירות ההפצה כמידע, בין זוגות של אלקטרודות מיקרו, ובהתבסס על המרחק הבין-מרחק והמתאם הצולב שלהם.
הכלי גרף כימותרפיה מאפשר למשתמש להעריך ידנית את מהירות ההפצה. כאן מוצג אירוע הפצה. זוהה לאורך ארבע אלקטרודות מיקרו בתוך מיקרוגרוב.
אירועים אלה יכולים להיות מיוצגים בעלילה של ראסר. הנה פעילות ההפצה לאורך 11 מיקרוגרובים בשתי הדקות הראשונות של ההקלטה. המיקרוגרוב הגבוה והנמוך צבוע בצהוב ואדום, בכבוד.
שימו לב לסנכרון הפעילות לאורך 11 המיקרוגרובים. הסינכרון אינו תלוי בקצב הפעילות. כפי שניתן לראות בווריאציות של קצב הירי המיידי של שני המיקרוגרובים.
מיקרוגרובים מתפקדים גם כמגברי אותות אקסונאליים, כפי שמוצג בעלילה של הקופסה ושפם. הראינו לך כיצד לשלב מיקרו נוזלים עם MEAs, וכיצד לתרבת נוירונים עליהם. כמו כן, כיצד להקליט ולחלץ נתונים משמעותיים מהקלטות אלה.
אנו מקווים הדגמה זו כדי להיות שימושי עבור המחקר שלך, למה ייתכן שתרצה ללמוד את התקשורת במעגלים עצביים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את השילוב של מערכי מיקרו-אלקטרודות עם התקני מיקרו-פלואידיקה לצורך חקר העברה של פוטנציאל פעולה בתרביות נוירונים. הוא מדגיש את החשיבות של הדגמה חזותית ואת השימוש בכלי חישוב ידידותי למשתמש לניתוח נתונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- הנדסת מוח
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- הבנת העברת מידע במעגלים עצביים היא אתגר מרכזי במדעי המוח.
- מערכי מיקרו-אלקטרודות מאפשרים הקלטה של פעילות חשמלית מנוירונים.
- התקני מיקרופלואידקה מאפשרים בקרה מדויקת של הסביבה התאית.
- שילוב של טכנולוגיות אלו יכול לשפר את חקר התקשורת הנוירונלית.
מטרת המחקר
- ליצור פלטפורמה לחקר תקשורת נוירונלית והפצת אותות אקסונליים.
- לגילוי ואפיון של פוטנציאלי פעולה מתפשטים בתרביות נוירונליות.
- להקל על מחקר בתחומי הקידוד והפענוח העצביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שילוב של מערכי מיקרו-אלקטרודות עם התקנים מיקרו-פלואידיים.
- שימוש בכלי תוכנה שפותחו לניתוח נתונים.
- הדגמה חזותית של הפרוטוקול לצורך בהירות.
- יישום במחקרים שונים הכוללים נוירונים תחושתיים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי ואפיון מוצלחים של פוטנציאלי פעולה.
- הבנה משופרת של מנגנוני תקשורת עצבית.
- הדגמה של יעילות הפרוטוקול ביישומים מחקריים.
- פיתוח של כלי חישוב ידידותי למשתמש לניתוח נתונים.
מסקנות
- השימוש המשולב במערכי מיקרו-אלקטרודות ובמיקרופלואידיקה יעיל לחקר פעילות נוירונלית.
- גישה זו עשויה לקדם את המחקר במדעי המוח ובהנדסה נוירונלית.
- פרוטוקולים חזותיים חיוניים לשחזור התוצאות ולהבנת התהליך.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
פלטפורמת microfluidic-MEA זו נותנת מענה לאתגר מרכזי בחיפוש תרופות למדעי העצבים: בידוד הפסגות של הפצת אותות אקסוניים מרעש סומטי בתרביות נוירונליות. על ידי אפשור הקלטה ברזולוציה גבוהה ולטווח ארוך של הפצת פולסים (spikes) עם יחס אות לרעש משופר, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות המעורבות בהתפתחות נוירולוגית, בניוון עצבי ובהתחדשות עצבית. היא מספקת ביטחון ניבוי בשלבים מוקדמים של הגילוי באמצעות כימות של פנוטיפים הקשורים לתקשורת, כגון מהירות הולכה ותבניות פריקה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד של סיגנלינג אקסונלי להבהרת תקשורת ספציפית לנתיב במעגלים עצביים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תיקוף פונקציונלי של מטרות המודולות את מהירות התפשטות הפוטנציאל (spike propagation velocity) וכשל בהולכה.
- ערך ניבוי: מכמת את העברה של פוטנציאלים קדמית (anterograde spike transmission) ומנגנוני קידוד כדי לספק מידע לסינון פורטפוליו בהתבסס על מעורבות פונקציונלית של המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכין תרביות נוירונליות מופרדות ומאומתות להערכת תרכובות בהמשך, עם יישור אקסונלי מבוקר וצימוד מיקרו-אלקטרודות.
- פלטים כמותיים: מספק מדידות הדירות ברזולוציה גבוהה של מהירות התפשטות, כשל בהולכה וקצב פריקה לצורך סריקה מהימנה של תרכובות.
- סקילביליות ושימוש חוזר: מאפשר סטנדרטיזציה של הפלטפורמה במחקרים על תקשורת בין נוירוני חישה ותצורות של תרביות משותפות (co-culture), ובכך תומך בהעברתיות של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תהליכים של התפתחות עצבית וניוון עצבי על ידי מעקב אחר התפשטות אותים אקסונליים לאורך שבועות in vitro.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי כימות פנוטיפים של תקשורת הרלוונטיים לתפקוד לקויה של מעגלים ולתיקונם.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות go/no-go באמצעות מדדים אובייקטיביים של פוטנציאל לניוורגנרציה ודיוק בקידוד מידע.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת מדדים תפקודיים המגשרים בין סריקה פנוטיפית לאישוש מכניסטי במערכות עצביות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד תרומות אקסונליות לפעילות הרשת בסביבות מיקרו מבוקרות.
- סריקה: מספק תרביות נוירונליות שחזירות ומוכנות לבדיקה, עם תוצאות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות להערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה כמותית של תנאים באמצעות מדדי מהירות התפשטות, כשל בהולכה וקצב פריקה הנגזרים מניתוח רצפי דחפים (spike train).
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מידול דינמיקת תקשורת אקסונלית הרלוונטית לניוון עצבי ולהתחדשות עצבית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה שניתן להשתמש בה שוב לחקר תקשורת של נוירונים תחושתיים ומערכות תרבית משותפת (co-culture) במגוון תחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בהפגת אותות עצביים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות תכנון תרבית מודולרי ויציבות לטווח ארוך.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות המעורבות בפתולוגיות מבוססות מעגלים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון באמצעות פנוטיפים כמותיים של תקשורת אקסונלית הקשורים למכניזמי מחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במכשירים מיקרופלואידיים, בתרבויות נוירונליות וברישום אלקטרופיזיולוגי.
- תלוי בגישה למערכי מיקרו-אלקטרודות, מכשירי ניקוי פלסמה, מבתרי זרימה למינרית ומערכות רישום בבקרה טמפרטורית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להבטחת יישור עקבי של המכשירים, זריעה של תאים ופרוטוקולים להחלפת מצע גידול.
- כולל שיקולי התאמה כאשר מרחיבים את השימוש לסוגי נוירונים שונים או לתצורות של תרבויות משולבות (co-culture) מעבר לתרבויות המופקות מקליפת הקורטקס הפרה-פרונטלית.
- מגבלות מעשיות כוללות את המורכבות הטכנית של הרכבת מערכת המיקרופלואידיקה-MEA ואת הצורך בכלים חישוביים ייעודיים לניתוח התפשטות פוטנציאלי פעולה (spike propagation).
